|
|
гистология реф. На пороге микромира
На пороге микромира
Собирающие (увеличивающие) линзы были известны с XI века, и очки распространились по Европе уже в XIV веке. Традиционно изобретение первого составного микроскопа приписывают отцу и сыну — Хансу и Захарию Янсенам в 1595 году (рис. 1). Этот первый микроскоп мог увеличивать изображение всего в 3–9 раз. Есть версия, что первый микроскоп создал Корнелиус Дреббель. Среди изобретателей первых микроскопов был и Галилей, создавший свой микроскоп в 1609 году. Так или иначе, ни один из изобретателей не оставил подробных описаний микромира. Микроскопия как наука началась с Роберта Гука, который в 1665 году издал Micrographia — книгу, в которой подробно описывались устройство микроскопа, основы оптики и первые наблюдения за биологическими объектами, иллюстрированные подробными рисунками [1]. Микроскоп Гука (рис. 2) состоял из трех линз и источника света — эта основа сохраняется и в современной микроскопии. Однако достичь больших увеличений удалось с помощью более простой конструкции — Антони ван Левенгук использовал, казалось бы, примитивный микроскоп всего с одной линзой (рис. 2). Однако благодаря высочайшему качеству этой линзы ему удалось достичь 200-кратного увеличения и описать клетки простейших и даже крупные бактерии. Использование всего одной линзы не создавало оптических аберраций, которые только множились при конструировании более сложной оптической системы.
Улучшение оптики и преодоление аберраций
Оптические артефакты — аберрации — не позволяли рассматривать мелкие объекты, даже когда удавалось достичь больших увеличений. В XVIII веке некоторые мастера-оптики смогли устранить хроматические и сферические аберрации с помощью сложных оптических систем, состоящих из собирающей и рассеивающей линз из разного типа стекол с разными показателями преломления. Ахроматические линзы (то есть линзы, устраняющие хроматические аберрации) изобрел Честер Мур Халл в 1733 году. Первые ахроматические объективы для микроскопов создал Бенджамин Мартин (около 1775 г.) и значительно улучшил Йозеф Фраунгофер. Отец известного хирурга и отца антисептики Джозефа Листера — Джозеф Джексон Листер — обнаружил, что сочетание нескольких ахроматических линз позволяет исправить не только хроматические, но и сферические аберрации (1826 г.). Правда, несмотря на совершенство оптики, повышать увеличение до бесконечности нельзя: причиной тому дифракционный предел, о котором пойдет речь ниже.
Гистология
Развитие оптики в XVIII веке позволяло исследовать микромир на больших увеличениях, однако исследование тканей и клеток было сопряжено со множеством трудностей — они же в основном не окрашены, малоконтрастны и быстро умирают вне организма. Очередной прорыв в микроскопии пришел со стороны химии. В XIX веке открыли огромное количество красителей, и биологи пробовали окрашивать ими объекты своих исследований. Одновременно изобрели микротом (рис. 3) — прибор для нарезания тонких срезов тканей определенной толщины. Для стабилизации структуры ткани выдерживали в растворах фиксаторов (например, формалина), после чего препараты хранились долгое время. Для удобства нарезания заформалиненные куски органов заключали в парафин, блоки которого удобно резать.
Ряд классических гистологических красителей, изобретенных в 19-м веке и начале 20-го, используется до сих пор: фиолетовый гематоксилин окрашивает ядра, розовый эозин — цитоплазму клеток, краситель Перлса — двухвалентное железо, реактив Шиффа — полисахариды, краситель Судан III выявляет жиры техникой Дадди, а нитрат серебра — клетки Пуркинье на срезах мозга по методу Рамон-и-Кахаля. Изобретение различных техник позволило описать тонкие структуры каждого органа, выявить входящие в них ткани и даже рассмотреть структуру клеток — ядро (с митотическими хромосомами), ядрышки и митохондрии. Микроскопические исследования того времени, хотя и были в большей степени описательными, сформировали базовые теории клеточной биологии, нейробиологии и иммунологии [2].
Математический аппарат
Дальнейшие улучшения в оптике сопровождались разработкой математического аппарата для ее описания. Джордж Биддель Эйри описал диск Эйри — дифракционный рисунок, образующийся в идеальной оптической линзе с круговой апертурой. Дифракция света ограничивает минимально возможное разрешение между двумя источниками света, и, соответственно, разрешение в оптической системе (то есть минимальное расстояние, на котором оптика микроскопа может различить раздельно две близко расположенные точки). Эрнст Аббе предложил формулу дифракционного предела в 1873 году [3]. Формула определяет предельное разрешение как:
r = λ/2NA,
где λ — длина волны источника света (от 390 до 700 нм), а NA — числовая апертура объектива, определяемая как:
NA = n×sin(θ),
где n — индекс преломления среды между объективом и препаратом, а θ — апертурный угол между крайними лучами конического светового пучка, попадающего в объектив.
Из формулы видно, что разрешение тем выше (то есть значение r меньше), чем меньше длина волны (синий свет предпочтителен красному) и чем больше числовая апертура и индекс преломления среды. Поэтому для увеличения разрешения микроскопа используют масляные объективы, когда между препаратом и объективом добавляется иммерсионное масло с высоким показателем преломления. Более строгим является критерий Рэлея, в котором предел разрешения определяется как:
R=0,61×λ/NA
Разница с пределом Аббе вызвана отличием в том, как два оптика определяли разрешение между двумя точками (критерий Рэлея строже).
Устройство микроскопа
Принципиальное устройство светового микроскопа мало менялось со времен Аббе, и основные улучшения касались уменьшения аберраций за счет усложнения состава и количества линз. Оптический микроскоп состоит из источника света, объектива и окуляров. Препарат, освещенный светом лампы, должен находиться немного дальше фокуса объектива, что создает увеличенное изображение, которое усиливается и проецируется линзой окуляра и хрусталиком глаза на сетчатку (или на матрицу камеры). В микроскопах с «бесконечной» оптикой (не ограниченной определенной длиной тубуса) препарат находится в фокусе объектива, и для построения промежуточного изображения необходима дополнительная тубулярная линза. В современных микроскопах каждый из этих компонентов включает в себя большое количество сложных линз для коррекции хроматических и сферических аберраций, а также диафрагмы, позволяющие регулировать размер поля зрения и интенсивность света. Исследовательские микроскопы оснащены несколькими объективами с разным увеличением (от 2,5—4× до 100×), которые имеют одинаковую фокусную длину и могут свободно меняться с помощью револьверной насадки. Таким образом можно найти интересный участок препарата, используя небольшое увеличение, позволяющее рассмотреть широкое поле зрение, и затем разглядеть подробности, сменив объектив на более мощный.
Линза окуляра дополнительно увеличивают промежуточное изображение в 10–25 раз, создавая огромные увеличения. Световая микроскопия позволяет хорошо рассмотреть тонкие препараты (например, срезы ткани или клетки, растущие на стекле), окрашенные цветными красителями (например, антителами с цветной меткой или гистологическими красителями) (рис. 5). Окраска препарата требует его химической фиксации, что не подходит для наблюдения за живыми объектами, а поэтому в большинстве современных микроскопов вводят дополнительные элементы, позволяющие наблюдать микроскопические объекты без фиксации — с помощью методов фазового контраста и его модификаций.
Виды микроскопов
Оптический микроскоп
Оптически микроскоп не мог давать разрешающей способности менее полупериода волны опорного излучения (диапазон длин волн 0,2—0,7 мкм, или 200—700 нм). Таким образом, оптический микроскоп способен различать структуры с расстоянием между точками до 0,20 мкм, поэтому максимальное увеличение, которого можно было добиться, составляло
2000 крат.
Бинокулярный микроскоп
Бинокулярный микроскоп позволяет получать 2 изображения объекта, рассматриваемые под небольшим углом, что обеспечивает объёмное восприятие, это оптический прибор для многократного увеличения рассматриваемых объектов, который обладает специальной бинокулярной насадкой, позволяющей вести изучение объекта при помощи обоих глаз. В этом и заключается его удобство и преимущество перед обычными микроскопами. Именно поэтому бинокулярный микроскоп чаще других применяется в профессиональных лабораториях, медицинских учреждениях и высших учебных заведениях. В числе других преимуществ данного прибора необходимо отметить высокое качество и контрастность изображения, механизмы грубой и точной настройки. Бинокулярный микроскоп работает по тому же принципу, что и обычные монокулярные: объект изучения помещают под объектив, где на него направляется искусственный световой поток. Общее увеличение (объектив*окуляр) оптических микроскопов с бинокулярной насадкой обычно больше, чем у соответствующих монокулярных микроскопов.
Стереомикроскоп
Стереомикроскоп, как и другие виды оптических микроскопов, позволяют работать как в проходящем, так и в отражённом свете. Обычно они имеют сменные окуляры бинокулярной насадки и один несменный объектив (есть и модели со сменными объективами). Большинство стереомикроскопов дает существенно меньшее увеличение, чем современный оптический микроскоп, однако имеет существенно большее фокусное расстояние, что позволяет рассматривать крупные объекты. Кроме того, в отличие от обычных оптических микроскопов, которые дают, как правило, инвертированное изображение, оптическая система стереомикроскопа не «переворачивает» изображение. Это позволяет широко использовать их для препарирования микроскопических объектов вручную или с использованием микроманипуляторов.
Металлографический микроскоп
Специфика металлографического исследования заключается в необходимости наблюдать структуру поверхности непрозрачных тел. Поэтому металлографический микроскоп построены по схеме отраженного света, где имеется специальный осветитель установленный со стороны объектива. Система призм и зеркал направляет свет на объект, далее свет отражается от не прозрачного объекта и направляется обратно в объектив. Современный прямой металлографический микроскоп характеризуются большим расстоянием между поверхностью столика и объективами и большим вертикальным ходом столика, что позволяет работать с крупными образцами. Максимальное расстояние может достигать десятки сантиметров. Но обычно в материаловедении используются инвертированный микроскоп, как не имеющие ограничения на размер образца (только на вес) и не требующие параллельности опорной и рабочей граней образца (в этом случае они совпадают).
Поляризационный микроскоп
В основе принципа действия поляризационного микроскопа лежит получение изображения исследуемого объекта при его облучении поляризованными лучами, которые в свою очередь должны быть получены из обычного света с помощью специального прибора — поляризатора. В сущности при прохождении поляризованного света через вещество либо отраженное от него меняет плоскость поляризации света в результате чего на втором поляризационном фильтре выявляется в виде излишнего затемнения. Либо дают специфичные реакции как двойное лучепреломление в жирах. Поляризационный микроскоп предназначен для наблюдения, фотографирования и видеопроекции объектов в поляризованном свете, а также исследований по методам фокального экранирования и фазового контраста. Поляризационный микроскоп используется для исследования широкого круга тех свойств и явлений, которые обычно недоступны для привычного оптического микроскопа. Поляризационный микроскоп снабжается бесконечной оптикой с профессиональным программным обеспечением.
Люминесцентный микроскоп
Принцип действия люминесцентных микроскопов основывается на свойствах флюоресцентного излучения. Микроскоп используются для исследования прозрачных и непрозрачных объектов. Люминесцентное излучение, по-разному отражается различными поверхностями и материалами, что и позволяет успешно применять его для проведения иммунохимических, иммунологических, иммуноморфологических и иммуногенетических исследований. Благодаря их уникальным возможностям, люминесцентный микроскоп широко используются в фармацевтике, ветеринарии и растениеводстве, а, кроме того, в биотехнологических отраслях промышленности. Люминесцентный микроскоп также практически незаменим для работы экспертно-криминалистических центров и санитарно-эпидемиологических учреждений.
Измерительный микроскоп
Измерительный микроскоп служит для точного измерения угловых и линейных размеров объектов. Используется в лабораторной практике, в технике и машиностроении. На универсальном измерительном микроскопе проводятся измерения проекционным методом, а также методом осевого сечения. Универсальный измерительный микроскоп отличается простотой автоматизации благодаря своим конструктивным особенностям. Наиболее простым решением является установка квазиабсолютного датчика линейных перемещений, благодаря чему значительно упрощается процесс наиболее часто проводимых измерений. Современное применение универсального измерительного микроскопа обязательно подразумевает наличие как минимум цифрового отсчетного устройства. Несмотря на появление новых прогрессивных средств измерения, универсальный измерительный микроскоп достаточно широко используется в измерительных лабораториях благодаря своей универсальности, простоте измерения, а также возможности легко автоматизировать процесс проведения измерения.
Электронный микроскоп
Электронный микроскоп позволяют получать изображение объектов с максимальным увеличением до 1000000 раз, благодаря использованию, в отличие от оптического микроскопа, вместо светового потока пучка электронов с энергиями 200 В ÷ 400 кэВ и более (например, просвечивающий электронный микроскоп высокого разрешения с ускоряющим напряжением 1 МВ). Разрешающая способность электронного микроскопа в 1000÷10000 раз превосходит разрешение светового микроскопа и для лучших современных приборов может быть меньше одного ангстрема. Для получения изображения электронный микроскоп использует специальные магнитные линзы, управляющие движением электронов в колонне прибора при помощи магнитного поля. Электронное изображение формируется электрическими и магнитными полями примерно так же, как световое - оптическими линзами.
Сканирующий зондовый микроскоп
Сканирующий зондовый микроскоп это класс микроскопов для получения изображения поверхности и её локальных характеристик. Процесс построения изображения основан на сканировании поверхности зондом. В общем случае позволяет получить трёхмерное изображение поверхности (топографию) с высоким разрешением. Сканирующий зондовый микроскоп в современном виде изобретен Гердом Карлом Биннигом и Генрихом Рорером в 1981 году. Отличительной СЗМ особенностью является наличие: зонда
Основные типы сканирующих зондовых микроскопов:
Сканирующий атомно-силовой микроскоп
Сканирующий туннельный микроскоп
Ближнепольный оптический микроскоп
Рентгеновский микроскоп
Рентгеновский микроскоп — устройство для исследования очень малых объектов, размеры которых сопоставимы с длиной рентгеновской волны. Основан на использовании электромагнитного излучения с длиной волны от 0,01 до 1 нанометра. Рентгеновский микроскоп по разрешающей способности находится между электронными и оптическими микроскопами. Теоретическая разрешающая способность рентгеновского микроскопа достигает 2-20 нанометров, что на порядок больше разрешающей способности оптического микроскопа (до 150 нанометров). В настоящее время существуют рентгеновский микроскоп с разрешающей способностью около 5 нанометров.
Рентгеновский микроскоп бывают:
Проекционный рентгеновский микроскоп.
Отражательный рентгеновский микроскоп.
Дифференциальный интерференционно-контрастный микроскоп
Дифференциальный интерференционно-контрастный микроскоп позволяет определить оптическую плотность исследуемого объекта на основе принципа интерференции и таким образом увидеть недоступные глазу детали. Относительно сложная оптическая система позволяет создать чёрно-белую картину образца на сером фоне. Это изображение подобно тому, которое можно получить с помощью фазово-контрастного микроскопа, но в нём отсутствует дифракционное гало. В дифференциальном интерференционно-контрастном икроскопе поляризованный луч из источника света разделяется на два луча, которые проходят через образец разными оптическими путями. Длина этих оптических путей (т. е. произведение показателя преломления и геометрической длины пути) различна. Впоследствии эти лучи интерферируют при слиянии. Это позволяет создать объемное рельефное изображение, соответствующее изменению оптической плотности образца, акцентируя линии и границы. Эта картина не является точной топографической картиной.
Виды микроскопии
Световая или светопольная – является основным методом изучения биологических объектов. Разрешающая способность ограничена длинной световых волн. Увеличение до 1.500 раз. Можно изучать не только фиксированные но и живые объекты
Темнопольная – в отличие от световой, где в объектив попадает прямой луч света, темнопольная основана на рассеивании света микро. Объектами, размеры которых меньше предела светового микроскопа. В объектив попадают только лучи света, рассеянного объектами при боковом освещении. Прямые лучи в объектив не попадают. Объект выглядит светящимся на темном поле.
Фазово-контрастная – основана на интерференции света: прозрачные объекты, отличающиеся по показателю преломления от окружающей среды, выглядят как темные на светлом фоне (позитивный контраст) или как светлые на темном фоне (негативный).
Люминисцентная – основана на люминисценции, т.е. способности объектов к свечению при облучении коротковолновой частью видимого света или У.Ф. лучами. Свечение вещества, возникает в результате превращения энергии, поглощаемой веществом, в видимое излучение
У.Ф. микроскопия – основана на способности некоторых в-в поглощать У.Ф. лучи.
Поляризационная – основана на поляризации света и предназначена для выявления объектов, вращающих плоскость поляризации.
Флуоресцентная - мощный источник света возбуждал свечение во флуоресцентных веществах. Флуоресцентная микроскопия позволяет получать красочные изображения, светящиеся собственным светом, и в то же время за счет использования светофильтров рассматривать свечение разных цветов отдельно. Так можно изучать распределение нескольких меток. Источник света во флуоресцентном микроскопе — яркая лампа (ртутная или галогеновая). Свет от лампы проходит через светофильтр, который оставляет оптимальные для возбуждения флуоресцентной метки длины волн. Прошедший через светофильтр свет отражается дихроичным зеркалом и фокусируется объективом на образце, возбуждая флуоресценцию метки. Конфокальная микроскопия Качество флуоресцентной микроскопии было ограничено из-за возбуждения флуоресценции вне оптического фокуса. Конфокальная микроскопия позволила рассматривать флуоресценцию только в фокусе объектива, и реконструировать трехмерные изображения из послойно снятых фокусных планов. Для этого используют точечный источник света, сканирующий образец, и точечную диафрагму, отсекающую свет вне оптического фокуса. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия является модификацией флуоресцентной микроскопии, улучшающей качество изображения и позволяющей строить трехмерные реконструкции препарата, а также в некоторых модификациях манипулировать биологическими объектами с помощью лазера. В конфокальной микроскопии, в отличие от флуоресцентной, свечение возбуждается не во всём препарате, а точечно. Перемещение лазера сканирует препарат, подобно тому, как распечатывает изображение принтер. Двухфотонная (мультифотонная) микроскопия является модификацией конфокальной микроскопии, позволяющей отказаться от точечных апертур [13]. Возбуждение в таком микроскопе происходит за счет возбуждения флуорофора одновременным попаданием двух фотонов неоптимальной длины волны от мощного лазера. Вероятность такого события падает с квадратом расстояния, поэтому эффективное возбуждение происходит только в месте фокусировки лазера. Электронная - Ее идея состоит в использовании электронов в качестве средства «освещения». Длина волны у электрона на 5 порядков (в 100 000 раз) меньше, чем у фотона, что дает разрешение до 50 пикометров! Электронная микроскопия позволяет рассматривать вирусы и структуру белковых комплексов. В принципе, устройство электронного микроскопа очень похоже на микроскоп оптический. В качестве источника электронов (осветителя в обычном микроскопе) используется электронная пушка, в которой поток электронов от источника (например, вольфрамовой нити) фокусируется с помощью цилиндрического электрода (цилиндра Венельта). В качестве линз используют электромагнитные катушки, работающие как магнитные линзы. Для того чтобы электроны не задерживались молекулами воздуха, внутри микроскопа создают вакуум. Методы суперразрешения
Электронная микроскопия продвинула исследования далеко за предел разрешения оптической микроскопии, однако она не позволяет смотреть на живые объекты и использовать разноцветные метки или красители. Возможно ли преодолеть дифракционный предел в оптической микроскопии? Методы, преодолевающие предел Аббе, называются методами суперразрешения. Мы подробно остановимся на двух таких методах, за которые присудили Нобелевскую премию по химии 2014 года [14].
В 1990-х исследователи начали разрабатывать методы для преодоления дифракционного предела Аббэ. Центральную роль в разработке этих методов играл Штефан Хелль, который разработал STED-микроскопию [14–16]. В методике STED возбуждение флуорофора происходит с помощью двух лазеров — один возбуждает флуоресценцию в точке фокуса, в то время как другой тушит ее вокруг этой точки за счет смещения флуоресценции в более красную область. За достижением Хелля последовало изобретение других суперразрешающих методов — PALM/STORM, GSDIM и других.
Штефан Хелль одним из первых понял, что возможно преодолеть дифракционный предел, используя свойства самих флуорофоров. Идея Хелля состояла в том, что не обязательно ограничивать дифракцию света, который стимулирует флуоресценцию, если можно «запретить» флуоресцировать молекулам вне самого центра фокуса. Для этого он придумал использовать принцип стимулирования испускания: в нем флуорофор в возбужденном состоянии переводится в невозбужденное состояние вторым лазером. За счет использования «более красной» длины волны испускаемый при стимулированном переходе фотон имеет большую длину волны (такую же, как и лазер) и не регистрируется детектором.
Как же можно увидеть изображение, если мы подавили флуоресценцию во всем образце? Дело в форме луча света второго лазера — проходя через специальную фазовую пластинку, он приобретает форму кольца, и интенсивности подавляющего лазера в узкой центральной точке не хватает для подавления флуоресценции. Таким образом, флуоресценция возбуждается только в узкой фокусной точке, которая по размерам гораздо меньше предела дифракции. STED-микроскопия (рис. 17 и 18) позволяет получать изображения с разрешением меньше 20 нм в поперечном направлении, и около 40–50 нм в продольном направлении.
Другим подходом стало ограничение флуоресценции флуорофоров по времени. В PALM/STORM/FPALM-микроскопии используют специальные флуорофоры (флуоресцентные белки или синтетические флуорофоры), которые могут переключаться между возбужденным и невозбужденным состоянием (см. видео) [17], [18]. Низкочастотный возбуждающий лазер возбуждает лишь часть молекул, так чтобы статистически возбужденные молекулы были разделены расстоянием больше дифракционного предела. Высокочувствительная камера регистрирует флуоресценцию от этих молекул, позволяя точно определить их положение по испускаемым фотонам. Второй лазер подавляет флуоресценцию и возвращает молекулы обратно в невозбужденное состояние. После многократного повторения этого цикла (в каждом цикле случайно возбуждаются разные молекулы флуорофора), компьютер составляет цельную картину из изображений, снятых в отдельных циклах. |
|
|
Скачать 29.95 Kb.