|
|
ПАБК, БЕНЗОДИАЗЕПИНЫ. Объекты исследования
Объекты исследования. Желудок и тонкий кишечник с содержимым, головной мозг, печенка, почки, кровь, моча.
При исследовании извлечений из биологических объектов на производные 1,4-бензодиазепина используют 2 направления в анализе.
1 направление основано на гидролизе бензодиазепинов до 2-аминобензофенонов. (метод Б. М. Изотова)
Данный способ позволяет обнаружить и определить в извлечении нативные соединении и их метаболиты. Этому направлению придают судебно-химическое значение при отрицательном результате.
2 направление используется, если в процессе исследования обнаружены бензофеноны по 1 направлению анализа. Этот способ позволяет точно установить природу 1,4-бензодиазепина по нативным соединениям и их метаболитам.
Преимущество исследования производных 1,4-бенздиазепина по продуктам гидролиза — 2-аминобензофенонами — заключается в возможности суммарно определять нативные соединения и метаболиты. Анализ по направлению I имеет отрицательное судебно-химическое значение. При позитивном результате необходимо продолжать исследование по направлению II (по нативным соединениям и метаболитам), что позволит точнее установить природу яда (особенно при наличии хлордиазепоксида и оксазепама, которые имеют ряд общих метаболитов и гидролизуются до 2-амино-5-хлорбензофенона).
Изолирование по направлению I
Изолирование по методу Б. М. Изотова проводится после деструкции гомогенизата органа 6Мраствором соляной кислоты.
В результате гидролиза объекта в колбе собратным холодильником на глицериновой бане (t= 140—145 °С) в течение 60 мин происходят разрушения связи белок—яд и разрыв азепинового цикла нативных ядов с образованием бензофенонов.
Гидролизат очищают центрифугированием и фильтрованием.
Учитывая, что бензофеноны характеризуются основными свойствами, их переводят в ионизированное состояние при подщелачивании водной фазы раствором NаOH и экстрагируют смесью хлороформ— пентанол (9:1).
Изолирование по направлению I можно проводить полярными растворителями:
— по методу О. О. Васильевой — водой, подкисленной щавелевой кислотой;
— по методу Стаса—Отто — спиртом, подкисленным щавелевой кислотой. Производные 1,4-бенздиазепина экстрагируют хлороформом из водной фазы при рН = 2—3 и рН = 9—10 или сорбируют на полимерных сорбентах с последующим элюированием хлороформом.
После отделения органической фазы остаток растворяют в 6Мрастворе HCІ и проводят гидролиз при 120 °С в течение 20 мин.
Начало формы
Конец формы
ТСХ-скрининг. 1-й этап — в общей системе растворителей хлороформ— диоксан—ацетон—25%-вий раствор аммиака (45 : 47,5 : 5 : 2,5); сорбент — силикагель КСК. Выявление бензофенона проводится по собственной желтой окраски пятен; по реакции образования азокрасителя (2-аминобензофеноны) с β-нафтолом (оранжевые пятна) или с N-α-нафтилетилендиамином (розовато-сиреневые пятна). Бензофенон (Rf= 0,63—0,70) из сорбента элюирует бензолом.
2-й этап — в частной системе растворителей хлороформ—етанол (20 : 1); сорбент — алюминию оксид основной; Rf = 0,60—0,63; элюент — бензол.
Очистка от примесей проводится методами тонкослойной хроматографии, электрофореза, гелевой хроматографии, экстракционным методом.
Хроматографию проводят на пластинках «Силуфол». В качестве подвижной фазы используют бензол, которым предварительно насыщают хроматографическую камеру в течение 10 мин. Раствор экстракта из гидролизата наносят на стартовую линию пластинки и одновременно в качестве «свидетелей» - бензофеноны, полученные при гидролизе стандартных веществ - бензодиазепинов (по 10-15 мкг каждого). После хроматографирования бензофеноны первоначально фиксируют на пластинке по собственному желтому окрашиванию. При просматривании пластинки в УФ-свете бензофеноны обнаруживают характерную флуоресценцию. Затем проводят непосредственно на пластинке реакцию Браттона-Маршалла. Хроматографическую пластинку последовательно опрыскивают 0,1% раствором нитрита натрия, 2 М раствором хлороводородной кислоты. Через 1-2 мин обрабатывают 2% щелочным раствором Р-нафтола. Флуоресцирующие пятна на пластинке окрашиваются в оранжево-красный цвет. Пятна 2-метиламино- , 5-хлорбензофенона не переходят в красно-оранжевый цвет, но при обработке хроматограммы 10% раствором хлорной кислоты дают яркую флуоресценцию в УФ-свете при 254 и 360 нм. |
Предел обнаружения производных бензодиазепина составляет 1-5 мкг исследуемого ! вещества в пробе, нанесенной на пластинку.
УФ-спектрофотометрия используется после проведения ТСХ и элюирования бензофенонов с пластинки спиртом или ацетоном. Бензофеноны имеют характерную абсорбцию в области 230-240 и 390-410 нм.
УФ-спектры бензофенона:
а) при рН < 5 — λмах = 265 нм;
б) при рН > 7 — λтах= 235, 390 нм.
Оценка. Описанное исследование по 1 направлению имеет судебно-химическое зна чение при получении отрицательного результата. •
При получении положительных испытаний по 1 направлению проводят дальнейший анализ.
Выявления бензофенона проводят с помощью:
Реакции окрашивания — образование азокрасителя:
Определение индивидуальных производных 1,4-бензодиазепина и их метаболитов
Для обнаружения отдельных веществ и их метаболитов изолирование проводят путем настаивания слтолярным растворителем и экстрагируют из водного раствора хлороформом при рН=2 и рН=10 или используют сорбционный метод на полимерных сорбентах с последующим элюированием исследуемых соединений с сорбента. Полученные экстракты (элюаты) упаривают до небольшого объема 0,5-1 мл (концентрирование). Для обнаружения производных 1,4-бензодиазепина и их метаболитов в полученном концентрате используют хроматографию в тонком слое сорбента, УФ-спектрофотометрию, газожидкостную, высокоэффективную жидкостную хроматографию и химический метод.
Хроматография в тонком слое сорбента. Часть раствора наносят в виде точки на стартовую линию хроматографической пластинки «Силуфол УФ-254». В качестве «стандартов» на пластинку наносят по 10-15 мкг растворов хлозепида, диазепама, нитразепама и оксазепама. Пластинку помещают в одну из систем растворителей: хлороформ - ацетон (90:10) или этилацетат - 25% раствор аммиака - уксусная кислота (26:1,6:3,3), позволяющих разделить бензодиазепины.
Для обнаружения бензодиазепинов на пластинке ее обрабатывают реактивами в определенной последовательности. Пластинку опрыскивают раствором нингидрина и затем 5 мин нагревают при 100°С. Образуются пятна желтого цвета. При последующей обработке реактивом ФПН (смесь хлорида железа (Ш), хлорной и азотной кислот) желтые пятна приобретают голубой цвет. Эту же пластинку опрыскивают подкисленным йодпла тинатом - пятна приобретают темный цвет.
Пластинку можно обработать реактивом Марки. Пятна бензодиазепинов окрашиваются в желтый цвет.
Кроме того, можно дополнительно провести химическую реакцию образования азокрасителя после гидролиза бензодиазепинов и метаболитов на пластинке до аминобензофенонов.
Заключение о нахождении в извлечении конкретного производного 1,4-бензодиазепина по результатам ТСХ можно сделать, если цвет и исследуемого вещества и «стандарта» полностью совпадают.
УФ-спектрофотометрия проводится после очистки экстрактов с помощью ТСХ, элюирования веществ с пластинки этиловым спиртом, 0,1 М раствором серной (хлороводородной) кислоты или смесью 1 М раствора хлороводородной кислоты и метилового спирта (1:9).
При регистрации спектра поглощения производные 1,4-бензодиазепина и их метаболиты определяют по характерным максимумам и минимумам в спектре. Например, в растворе 0,1 М серной кислоты хлозепид обнаруживает 2 максимума при 245 и 306 нм, диазепам при 241, 284 и 359 нм, нитразепам при 277 нм.
Газожидкостная хроматография проводится с использованием колонок длиной 2 м и диаметром 4 мм на хромосорбе <3 (80-100 меш.) с покрытием БЕ-ЗО. Обнаружение бензодиазепинов и их метаболитов проводят по соответствующим индексам удерживания (см. табл. 22).
ИК-спектроскопия. Сухой остаток после испарения хлороформного экстракта или элюата растирают с кристаллами бромида калия и прессуют в виде диска. В ИК- спектре бензодиазепинов появляются интенсивные полосы за счет валентных колебаний ОН-, N4-, СО-, С-С- групп (см. табл. 23).
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Обнаружение производных 1,4-бензодиазепина предложено проводить по нативным соединениям или бензо- фенонам. Методика включает следующие условия разделения веществ: жидкостный хроматограф «Милихром»; хроматографическая колонка 62x2 мм; подвижные фазы - смесь 0,05 М водного гидрофосфата аммония и ацетонитрила 65:35 (для бензодиазепинов) и 45:55 (для бензофенонов); детектирование при 230 нм (для бензодиазепинов) и при 220 нм (для бензофенонов); скорость потока (элюирования) 100 мкл/мин.
Изолирование проводится полярными растворителями (общие методы). После экстракции хлороформом бенздиазепинов и их метаболитов из подкисленной и подщелоченной водных фаз проводят ТШХ-скрининг в общей системе растворителей (для веществ основного характера); проявитель — реактив Драгендорфа по Мунье (оранжево коричневые пятна из Rf = 0,63—0,77).
Вещества элюируют растворителями метанол—25 %-вий раствор аммиака (9 : 1) и хроматографируют в частных системах растворителей хлороформ—этанол (20 : 1). После проявки пятен реактивом Драгендорфа идентифицируют нативные вещества, сравнивая их со «свидетелями», с последующим элюированием ядов (элюент метанол—25 %-вий раствор аммиака (9 : 1)) и проведением подтверждающих исследований.
Химические методы:
1. Реакции осаждения. Из-за наличия в молекулах третичных атомов азота производные 1,4-бенздиазепины образуют осадки с общеалкалоидными осадительными реактивами Драгендорфа, Бушарда, пикриновой кислотой, солью Рейнеке и др.
2.Реакции окрашивания на нативные вещества.
3. Реакции окрашивания на метаболиты (продукты гидролиза) — 2-амино-бензофенони, образованный при гидролизе хлордиазепоксида, нитразепаму, оксазепаму, дают реакцию образования азокрасителя (за исключением 2-метиламидобензофенона).
Физико-химический метод. УФ-спектрометрия. В электронных спектрах производных 1,4-бензодиазепина образуются три полосы поглощения с λмах в пределах:
1)200 - 215 нм;
2) 220 - 240 нм;
3) 290 - 330 нм.
Две первых полосы отвечают возбуждению ароматических хромофоров. Третью, длинноволновую полосу относят к азометиновой связи, соединенной с бензогрупой.
По характеру поглощения в УФ-области 1,4-бенздиазепины принадлежат к соединениям, абсорбция корорых изменяется в зависимости от величины значений рН:
— в кислой среде — благодаря протонированию атома азота в положениях 1 (хлордиазепоксид) и 4 (1,2-дигидропроизводные 1,4-бенздиазепина — нтразепам, оксазепам, диазепам);
— в щелочной среде в молекуле 1,2-дигидропроизводных 1,4-бенздиазепина наблюдается изменение хромофорной системы, то есть увеличение соединения благодаря лактим-лактамной таутомерии азометиновой связи в положении 1—2 (нитразепам, оксазепам).
Исследование нативного соединения и метаболитов дает возможность провести идентификацию производных 1,4-бенздиазепина внутри группы и подтвердить результаты анализа по бензофенонам.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Препараты имеют основные свойства. Значение величин рКа = 4,6 (аминогруппа) и 9,24 (третичный атом азота).
В медицине используются соли производные ПАБК, которые имеют вид белых или желтоватых кристаллических порошков, растворимых в воде, этаноле, малорастворимых в хлороформе и нерастворимых в диэтиловом эфире.
Оптимально экстрагируются основания производных ПАБК из водных растворов органическими растворителями (диэтиловый эфир, хлороформ) при рН = 11.
ПРИМЕНЕНИЕ
Лекарственные средства новокаинамид, новокаин, дикаин имеют местное анестезирующее действие.
Новокаин после всасывания в кровь снижает возбудимость периферических холинореактивних систем, при этом наблюдаются уменьшения спазмов гладкой мускулатуры, снижения возбудимости мышцы сердца и некоторых отделов головного мозга.
Дикаин применяется для анестезии гортани при интубации и бронхографии, в офтальмологии.
Новокаинамид характеризуется способностью снижать возбудимость и проводимость сердечной мышцы и применяется как антиаритмическое средство.
ТОКСИЧНОЕ ДЕЙСТВИЕ
Препарата влекут нервно-психические и сердечно-сосудистые расстройства.
В терапевтических дозах они вызывают аллергические осложнения (сыпи на коже), головокружения, диспептические явления, отек кожи, слизевых оболочек, бронхоспазм.
В токсичных дозах влекут нарушение, а впоследствии паралич центральной нервной системы. Клиническая картина характеризуется психомоторными нарушениями, тонико-клоническими судорогами, потерей сознания, снижением артериального давления, брадикардией.
По токсичности дикаин превосходит новокаин (летальная доза 1 грамм) и новокаинамид (летальная доза 1,5 граммов).
ПОВЕДЕНИЕ В ОРГАНИЗМЕ
Новокаин применяется в основном для инъекций. Попадая в кровь, он быстро гидролизуется до п-аминобензойной кислоты и диетиламиноэтанола:
Объекты исследования. Печень, почки, кровь, моча.
Изолирования препаратов — производных п-аминобензойной кислоты — из биологических обьектов (тканей органов) проводится водой, подкисленной до рН = 2—3 хлористоводородной кислотой, при этом соли препаратов хорошо растворяются в воде. Из водной фазы препараты в виде основ экстрагируются хлороформом при рН = 11 (подщелачивание водной фазы проводят раствором NаOH). Примеси остаются в водной фазе.
При проведении ТСХ-скрининга производные п-аминобензойной кислоты на 1-ом этапе — в общей системе растворителей для веществ основного характера — оказываются в 3-й зоне (Rf = 0,63—0,83). После элюирования препаратов системой растворителей метанол— 25 %-вий раствор аммиака (9 : 1) проводят ТСХ-скрининг; на 2-ом этапе — в частной системе хлороформ—этанол (20 : 1), сорбент — алюминия оксид. Для проявки препаратов на пластинках используют реактив Драгендорфа по Мунье (оранжево-коричневые пятна) или идентифицируют по реакции образования азокрасителя с β-нафтолом (оранжевые пятна).
После элюирования при необходимости прибегают к сочетанию ТСХ-метода с экстракционным (для очистки экстракта от примесей) и проводят подтверждающие исследование.
Хроматография в тонком слое сорбента проводится в частной системе растворителей в присутствии «стандартов» - растворов прокаина и прокаинамида. Используют хроматографические пластинки с тонким слоем силикагеля и систему растворителей циклогексан - бензол - диэтиламин (75:15:10). Для обнаружения исследуемых веществ пластинку обрабатывают реактивом Драгендорфа (в модификации Мунье). Оба вещества проявляются в виде пятен оранжевого цвета. Значение и цвет пятен в извлечениях из объекта и «стандартов» должны полностью совпадать.
1. Реакции осаждения с общеалкалоидными осадочными реактивами, в результате которых образуются кристаллические или аморфные осадки. Реакции высокочувствительны, неспецифические.
2. Микрокристаллоскопические реакции — высокочувствительные, специфические:
Реакция с реактивом Драгендорфа. При добавлении к сухому остатку капли 0,1 М раствора хлороводородной кислоты и капли реактива Драгендорфа образуется осадок, состоящий из характерных кристаллов.
Прокаинамид образует кристаллы в виде прямоугольных пластинок (ромбовидные пластинки) светло-оранжевого цвета, прокаин - сростки кристаллов в виде тонких игл, собранных в щепотки оранжево-красного цвета.
Реакция прокаина с пикриновой кислотой. При добавлении к остатку капли 0,1 М раствора хлороводородной кислоты и 1-2 капель 0,5% раствора пикриновой кислоты при наличии в остатке прокаина образуются призматические кристаллы, которые при стоянии переходят в дендриты желто-зеленого цвета.
— с раствором бромистого золота — кристаллы в виде пластинок и игл (новокаин);
— с раствором хлорной платины — плотные розетки (новокаинамид);
— с раствором натрия нитрита — призмы, раздвоенные на концах (дикаин).
3.Реакции окрашивания (хромогенные):
Обнаружение прокаинамида по реакции с ванадатом аммония. К сухому остатку после испарения хлороформного экстракта из раствора с рН=8-10 добавляют 2-3 капли концентрированной серной кислоты и 0,01 г ванадата аммония. При нагревании смеси наблюдают вишнево-красное окрашивание при наличии в остатке прокаинамида.
Реакция прокаина с перманганатом калия. При добавлении к остатку, после испарения извлечения из объекта раствора перманганата калия, при наличии прокаина фиолетовая окраска исчезает.
Реакция Bитaли—Морена: оранжево-желтый цвет раствора (новокаин); желто-коричневый цвет раствора (новокаинамид); кроваво-красный цвет раствора (дикаин). Реакция неспецифическая;
Реакция образования азокрасителя: с β -нафтолом (красно-оранжевое окрашивание) или с N-α-нафтилетилендиамином (розовато-сиреневое окрашивание) — для новокаина и новокаинамида.
Для подтверждения наличия производных п-аминобензойной кислоты используются физико-химические методы — УФ- та ИК-спектрометрия, ТСХ-, ГЖХ-, ВЕЖХ- методы.
Высокоэффективная жидкостная хроматография проводится после очистки с помощью ТСХ по общепринятой методике. Для анализа используют условия, описанные ранее для лекарственных и наркотических веществ.Идентифицируют вещества по времени (объему) удерживания и по спектральным отношениям при нескольких длинах волн.
УФ-спектры производных п-аминобензойной кислоты характеризуются наличием трех максимумов поглощения в растворе серной кислоты при λмах в пределах:
1) 228—230 нм;
2) 272-281 нм;
3) 279-312 нм
УФ-спектрофотометрия. Очищенные остатки, после испарения хлороформного экстракта из щелочного раствора, растворяют в воде или 0,2 М растворе серной кислоты. Спектры поглощения растворов прокаина в воде имеют максимум при 290 нм, прокаинамида - при 278 нм; в 0,2 М растворе серной кислоты прокаина - при 228, 272 и 279 нм, прокаинамида - при 224 нм.
ИК-спектроскопия. Очищенный хлороформный экстракт испаряют до сухого остатка, растирают с бромидом калия, прессуют в диск, который используют для регистрации ИК-спектра. Прокаин обнаруживает пики с волновыми числами 1274, 1690 и 1605 см-1
Начало формы
Конец формы |
|
|
Скачать 391.9 Kb.