отчет по лабораторной. амилосубтилин. Определение амилолитической активности ферментного препарата Амилосубтилин
 Скачать 18.1 Kb.
|
Лабораторная работа № 3Определение амилолитической активности ферментного препарата Амилосубтилин Г3Х Цель работы: освоить метод определения амилолитической активности ферментного препарата. Реактивы и материалы: 0,1000-1,0000 г исследуемого препарата, 1,00 г крахмала, 10 см3 ацетатного буферного раствора с pH 6,0, растворы фосфорнокислого натрия и фосфорнокислого калия молярной концентрации 1/15 моль/дм3 в соотношении 0,5:9,5 (для рН 5,6) и 1:9 (для рН 6,0), 0,50 г йода и 5,00 г йодистого калия, раствор соляной кислоты молярной концентрацией 0,5 моль/дм3. Теоретические сведения Метод основан на гидролизе крахмала ферментами амилолитического комплекса до декстринов различной молекулярной массы. Амилолитическая активность характеризует способность амилолитических ферментов катализировать гидролиз 1 микромоля крахмала до декстринов различной молекулярной массы за единицу времени при оптимальных условиях. Содержание фермента в препарате условно выражается в стандартных единицах активности фермента на 1 см3 ферментного раствора или 1 г препарата. Приготовление растворов Приготовление раствора крахмала с массовой долей 1 % (субстрата). 1,00 г крахмала, взятого с учетом влажности, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 25 см3 воды и перемешивают. Затем добавляют в колбу еще 25 см3 воды, помещают колбу в кипящую водяную баню не менее чем на 10-15 мин, непрерывно перемешивая содержимое до полного растворения крахмала. После этого содержимое колбы охлаждают, добавляют 10 см3 ацетатного буферного раствора с pH 6,0. Объем жидкости доводят до метки дистиллированной водой и содержимое колбы перемешивают. Раствор должен быть прозрачным. Раствор крахмала готовят в день проведения анализа. Приготовление фосфатного буферного раствора с рН 5,6 и рН 6,0. Смешивают растворы фосфорнокислого натрия и фосфорнокислого калия молярной концентрацией 1/15 моль/дм3 в соотношении 0,5:9,5 (для рН 5,6) и 1:9 (для рН 6,0). Величину рН проверяют на приборе. В случае отклонения рН буфера от требуемого, соответствующими растворами доводят его до нормы. Приготовление основного раствора йода. 0,50 г йода и 5,00 г йодистого калия растворяют в бюксе с притертой крышкой в небольшом количестве воды. Содержимое перемешивают на магнитной мешалке при плотно закрытой крышке бюксы. Раствор после полного растворения йода переносят в мерную колбу с притертой крышкой вместимостью 200 см3 и объем доводят дистиллированной водой до метки. Приготовление рабочего раствора йода. 2 см3 основного раствора йода разводят раствором соляной кислоты молярной концентрацией 0,5 моль/дм3 с предполагаемой активностью больше 50 ед./см3 в мерной колбе вместимостью 100 см3. Перед употреблением рабочего раствора проверяют его оптическую плотность в диапазоне длин волн 434-450 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм. Оптическая плотность рабочего раствора йода должна быть равна (0,220±0,010). В случае отклонения ее от этого значения добавляют в раствор несколько капель соляной кислоты или основного раствора йода. Приготовление основного раствора очищенных ферментных препаратов. 0,1000-1,0000 г исследуемого препарата (в зависимости от предполагаемой активности) растворяют в небольшом количестве воды, при необходимости тщательно растирая стеклянной палочкой, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Препараты с нерастворимыми наполнителями фильтруют. Раствор хранят в течение суток при температуре от 2 до 6 °С. Таблица 1 Приготовление рабочего раствора очищенных ферментных препаратов
Приготовление рабочего раствора очищенных ферментных препаратов. Рабочий раствор готовят в соответствии с табл. 7 из основного раствора (для навески 0,1000 г), разбавляя его дистиллированной водой так, чтобы в 5 см3 рабочего раствора содержалась масса фермента, обеспечивающая в принятых условиях гидролиз крахмала от 20 до 60 %. Для анализа берут две параллельные навески препарата и из каждой делают одно разведение, которое анализируют не менее трех раз. Рабочий раствор ферментного препарата готовят непосредственно перед определением. Ход работы Берут две пробирки, наливают в каждую по 10 см3 раствора крахмала (субстрата) и ставят в термостат или водяную баню с температурой (30,0±0,2) °С на 5-10 мин. Затем, не вынимая пробирок из термостата, наливают в первую 5 см3 дистиллированной воды (контрольная пробирка), во вторую - 5 см3 рабочего раствора анализируемого продукта (опытная). Смеси быстро перемешивают и выдерживают в термостате в течение 10 мин, используя секундомер. Затем из каждой пробирки поочередно отбирают по 0,5 см3 раствора и переносят в колбы с предварительно налитыми 50 см3 рабочего раствора йода. Содержимое колб перемешивают. Полученные растворы приобретают следующую окраску: контрольный раствор - синий цвет, опытный - фиолетовый различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизованного крахмала. Через 5-10 мин после смешивания определяют оптическую плотность растворов фотоэлектрическим колориметром в диапазоне длин волн 630-670 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм. Контрольным раствором при колориметрировании является дистиллированная вода. Массу прогидролизованного крахмала m, г, вычисляют по формуле m = (D1-D2)/D1·0,1, где D1 - оптическая плотность контрольного раствора; D2 - оптическая плотность опытного раствора; 0,1 - масса крахмала, взятая для анализа, г. Если масса прогидролизованного крахмала меньше 0,02 г или больше 0,06 г, то анализ повторяют, подбирая другое разведение. Амилолитическую активность АС, ед/г, вычисляют по формуле AC=(5,885 m+0.001671)/m1·1000, где 5,885; 0,001671 – коэффициенты расчетного уравнения, полученные при математической обработке экспериментальных данных зависимости массы прогидролизованного крахмала от массы фермента, взятого для анализа в пересчете на 1 ч действия фермента. За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое значение результатов определения активностей, полученных при анализе двух параллельных навесок препарата, относительное допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 5 %. Результат округляют до первого десятичного знака. Предел возможных значений относительной погрешности измерений при доверительной вероятности P=0,95 составляет 5 %. Обработка результатов
Вывод: освоили метод определения амилолитической активности ферментного препарата Амилосубтилин Г3Х |