Вирусология. семинары вирусы. Правила отбора, хранения и транспортировки патматериала

• Название: Правила отбора, хранения и транспортировки патматериала
• Анкор: Вирусология
• Дата: 26.02.2023
• Размер: 37.5 Kb.
• Имя файла: семинары вирусы.docx
• Тип: Правила; #955540

Правила отбора, хранения и транспортировки патматериала.

Пат.материал – от больного или павшего животного.

Пат. Материал отбирают исходя из патогенеза болезни и тропизма вируса.

Основное требование к отбору пат.материала: вирус в материале должен сохраняться в максимальной концентрации.

ПРАВИЛА:

1. 
   Пр. места (пат мат берут из места возможной локализации вируса, т.е. где развивался патогенез).
   
2. 
   Пр. места (материалы берут во время яркого проявления клин. признаков).
   
3. 
   Правила асептики.
   
4. 
   Пат мат доставляют в лабораторию не позднее 2 часов с момента взятия в термосе со льдом или контейнере со льдом.
   

Виды пат. Материала:

1. 
   От больных животных
   

• 
  Смывы с доступных слизистых оболочек (жёсткими сухими инструментами)
  
• 
  Биологические жидкости
  
• 
  Кровь на 1. Вирусовыделение (только ретровирусы, лейкоз); 2. На получение сыворотки (серологическая диагностика)
  
• 
  Кусочки поражённой кожи (оспа, ящур, кальцивироз, кошачий спид).
  

2. 
   От трупов (кусочки органа 10-20г)
   

-кусочки паренхиматозных органов

-регионарные лимфоузлы

-кусочки поражённых органов.

Подготовка материала к вирусологическому исследованию:

Смыв:

1. 
   Ватно-марлевый тампон, зонд или щёточку омывают в физ. р-ре и отправляют в дез. р-р.
   
2. 
   Полученный смыв или вируссодержащую суспензию центрифугируют при 1500-3000 об/мин.
   
3. 
   Надосадочную жидкость переносят в стерильный флакон, добавляют р-ры антибиотиков и оставляют на контакт 2 часа при комнатной температуре.
   
4. 
   Проводят бактериологический контроль суспензии путём посева на бактериальные пит. среды.
   
5. 
   При отсутствии роста микрофлоры, суспензию используют для дальнейшего вирусологического исследования. При наличии роста микрофлоры, суспензию повторно обрабатывают р-ром антибиотика.
   

Пат. Материал с трупов:

1. 
   Кусочки органов растирают в ступке со стерильным песком до гомогенного состояния.
   
2. 
   Добавляют стерильный физ. р-р в соотношении 1:10 для получения 10% суспензии.
   
3. 
   Суспензию центрифугируют при 1500-3000 об/мин – 20-30 минут.
   
4. 
   Надосадочную жидкость переносят в стерильный флакон, добавляют р-р антибиотиков и делают посев на пит. среду.
   

Меры борьбы с вирусными болезнями

Профилактика:

1. 
   Специфическая – направлена на предупреждение определённого вируса:
   

• 
  Вакцинация (актив)
  
• 
  Сыворотка
  
• 
  Серопрофилактика (пассив)
  

2. 
   Неспецифическая – профилактика любой инф. Болезни.
   

• 
  Вет-сан мероприятия (дезинфекция, карантин)
  
• 
  Зоогигиенические мероприятия (уход, кормление, содержание)
  

Использование лабораторных животных в вирусологии

Для обнаружения активного репродуцирующегося вируса в вирусологии используют живые системы.

Живая система – совокупность клеток, чувствительных к конкретному вирусу.

Виды живых систем:

1. 
   Лабораторные животные
   
2. 
   Эмбрионы кур
   
3. 
   Культура клеток
   

Виды ЛЖ:

• 
  Белые мыши
  
• 
  Морские свинки
  
• 
  Кролики
  
• 
  Белые крысы
  
• 
  Золотистые хомячки
  

Био.проба – заражение живой системы.

Цели использования ЛЖ:

1. 
   Индикация (обнаружение) вируса в пат.мат.
   
2. 
   Изоляция (выделение) вируса.
   
3. 
   Идентификация – определение вида вируса.
   
4. 
   Титрование или определение количества вируса.
   
5. 
   Накопление биомассы вируса при изготовлении вакцин.
   
6. 
   Поддержание штаммов вирусов в лаб. условиях путём пассажа.
   
7. 
   Получение гипериммунных сывороток (для серопрофилактики).
   
8. 
   Получение специфической клинической картины болезни (оспы, ящур, в. Болезни Ауески).
   

Пассаж – заражение ЖС с целью получения новой популяции вирусов или восстановления активности вируса при хранении (=биопроба).

Требования к ЛЖ:

1. 
   Животные должны быть здоровыми, из благополучных по инф. Болезням питомников или вивариев.
   
2. 
   Животные должны быть того вида и возраста, который наиболее чувствителен к данному вирусу.
   
3. 
   Животные должны быть линейными (генетически однородными, полученными от одной пары родителей).
   

Биопроба заключается в инокуляции (введение) вируссодержащего материала в организм ЛЖ. Способ заражения зависит от тропизма вируса.

Тропизм – способность вирусов репродуцироваться только в определённых чувствительных к нему клетках организма.

За заражёнными животными наблюдают для обнаружения признаков репродукции:

1. 
   Клинические признаки
   
2. 
   Гибель в определённые сроки (первые 24-48ч неспецифическая гибель)
   
3. 
   От положительной биопробы отбирают вторичный пат мат для дальнейшего вирусологического исследования.
   

Слепой пассаж – заражение ЖС без получения видимых изменений.

При исследовании первичного пат мат проводят не менее трёх слепых пассажей.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ В ВИРУСОЛОГИИ

КЭ – оплодотворённое яйцо (21 день).

Перед заражением КЭ овоскопируют для определения жизнеспособности:

1. 
   Хорошо выраженные сосуды ХАО (хорионаллантоисная оболочка)
   
2. 
   Подвижность КЭ, которую определяют по движению глаза.
   

Структуры и функции:

1. 
   Скорлупа (защита)
   
2. 
   Подскорлупная оболочка (защита)
   
3. 
   Воздушная камера (воздухообмен)
   
4. 
   Хорион-аллантоисная оболочка – ХАО (дыхание)
   
5. 
   Аллантоисная полость (выделение)
   
6. 
   Амниотическая полость (физиологическая среда)
   
7. 
   Желточный мешок (питание)
   
8. 
   Белок (запас воды)
   
9. 
   Зародыш
   

Цели использования КЭ:

1. 
   Индикация
   
2. 
   Изоляция
   
3. 
   Идентификация
   
4. 
   Титрование
   
5. 
   Накопление биомассы вируса
   
6. 
   Поддержание штаммов вирусов в лаб. Условиях.
   

Преимущества КЭ:

1. 
   К КЭ чувствительно большое количество вирусов благодаря недостаточному развитию защитных механизмов.
   
2. 
   КЭ не образуют АТ в ответ на введение вируса (но, если птица, от которой получили эмбрион, вакцинирована, то могут быть АТ)
   
3. 
   КЭ практически стерильная ЖС
   
4. 
   Простая для заражения система, не требует кормления, ухода и содержания.
   

Требования к КЭ:

1. 
   Получают от здоровой невакцинированной птицы из благополучных по инф. болезням птицефабрикам
   
2. 
   Скорлупа КЭ должна быть чистой, непигментированной
   
3. 
   Возраст КЭ должен соответствовать тропизму вируса
   

При заражении КЭ учитывают:

1. 
   Тропизмы вирусов (в какую структуру заражать)
   
2. 
   Срок максимального развития данной структуры.
   

• 
  Аллантоисную полость заражают пневмотропными вирусами на 9-11 д инкубации
  
• 
  ХАО – дермотропные – 10-12д
  
• 
  Желточный мешок – вирус ринопневмонии лошадей – 5-7 день
  
• 
  Тело зародыша – пантропные вирусы – 7-14 день
  

Методика заражения КЭ вирусом болезни Ауески в аллантоисную полость (9дней инкубации, доза 0,2-0,3мл)

1. 
   Скорлупу в области воздушной камеры и со стороны противоположной зародышу фломбруют.
   
2. 
   Стерильным пробойником делают 2 отверстия: по центру возд. камеры и на 5мм ниже возд. камеры с противоположной зародышу стороны.
   
3. 
   Вводят 0,2-0,3 мл вируса на всю длину иглы.
   
4. 
   Отверстие закрывают парафином.
   
5. 
   Подписывают
   
6. 
   Инкубируют 5 дней – 37 градусов.
   

Индикация вирусов куриных эмбрионов

Заражённые эмбрионы инкубируют и срок инкубации зависит от вида вируса. Зараженные эмбрионы ежедневно овоскопируют.

Гибель эмбриона в первые 24 часа - неспецифическая, такие эмбрионы выбраковывают. В дальнейшем все погибшие эмбрионы до вскрытия помещают на +4 для уплотнения оболочек и снижения вероятности кровотечения при вскрытии.

Признаки репродукции вирусов куриных эмбрионов:

1. 
   Гибель в определённые сроки.
   
2. 
   Патологоанатомические изменения в структурах эмбрионов.
   

Некоторые вирусы не вызывают гибели и патологических изменений куриных эмбрионов. Их индикацию проводят по свойству гемагглютинации.

Гемагглютинация - склеивание эритроцитов в присутствии гемагглютинирующих вирусов.

Гемагглютинирующие вирусы содержат в своём составе гемагглютинин, который взаимодействуют со специфическими рецепторами на поверхности эритроцитов, вызывая их склеивание. Каждый вирус агглютинирует эритроциты определённого вида животных.

• 
  Пример: вирус болезни ньюкасла - эритроциты петуха.
  
• 
  Парагрип-3 КРС - эритроциты морской свинки
  
• 
  Вирус бешенства - эритроциты гуся
  

Индикацию гемагглютинирующих вирусов проводят в капельной реакции гемагглютинации (РГА)! не относится к серологическим реакциям!

Методика индикации вируса болезнь ньюкасла в курином эмбрионе (вскрытие)

1. Скорлупу в области воздушной камеры фламбируем.

2. Ножницами срезают скорлупу по границе воздушной камеры.

3.Прорывают под скорлупную оболочку и ХАО и наконечником отбирают одну каплю аллонтоисной жидкости и помещают её на керамическую плитку.

4. Добавляют одну каплю 5% взвеси эритроцитов петуха, перемешивают, контакт 5 мин при комнатной температуре.

Если вирус репродуцировался, то прошла гемагглютинация. Видна как хлопья эритроцитов на фоне просветления жидкости.

Использование культуры клеток в вирусологии

КК - клетки многоклеточного организма, живущие и делящиеся вне организма.

Цели использования - как у куриных эмбрионов.

Преимущества КК:

1. 
   Отсутствие видового ограничения для культивирования вирусов.
   
2. 
   Возможность вмешательства в инфекционный процесс на любой его стадии.
   
3. 
   Культуральная жидкость является стерильной вирусодержащей суспензией.
   

Классификация культур клеток:

I. По продолжительности жизнеспособности:

1. 
   Переживающая(клетки не делятся и сохраняют жизнеспособность ограниченное время)
   
2. 
   Растущая культура клеток(клетки делятся и сохраняют жизнеспособность определённое время)
   

• 
  Культура ткани
  
• 
  Культура клеток
  

II. По способу культивирования:

1. Многослойные стационарные КК(клетки прикреплены к поверхности культурального флакона (КК матрас) и делятся на три вида:

• 
  -первично трипсинизированное(получают из органов животного)
  
• 
  -диплоидная(морфологически однородные клетки, полученные из первичной и стабилизированные в процессе культивирования);
  
• 
  -перевиваемые(клетки, полученные из первичной или диплоидной КК спонтанно или искусственно и способные к делению вне организма не ограниченное время)
  

2. Суспензионные КК(клетки прикреплены на носитель Или микро носитель и в культуральном флаконе находится в виде взвеси).

Методика получения первично-трипсинизированных клеток

Принцип основан на том, что кусочки ткани здорового животного расщепляют протеолитическими ферментами на отдельные клетки. От здорового животного (лучше эмбрион) не позднее 2 часов с момента убоя выделяют орган (почки, лёгкие, сосуды, железы).

1. 
   Кусочки органы измельчают ножницами и отмывают от крови и слизи солевыми растворами.
   
2. 
   Кусочки переносят в колбу с магнитом + 0,25% тёплый раствор трипсина и помещают в магнитную мешалку.
   
3. 
   Дробная трипсинизация( трипсин в начале расщепляет белки межклеточного вещества; отдельные белки накапливаются в растворе и жидкость мутнеет. Полученные клетки переносят в стерильный раствор на +4. К оставшимся кусочкам органа добавляют трипсин и процедуру повторяют до полного истощения ткани).
   
4. 
   Полученные клетки центрифугируют при 1000 об\мин - 10-15мин. Надосадочную жидкость удаляют.
   
5. 
   Количество клеток подсчитывают в камеру горлева и доводят до 10 в 6ст кл\мл.
   
6. 
   Клетки помещают в матрас, добавляют ростовую питательную среду и культивируют при 37°.
   

Метод наблюдения за КК - световая микроскопия.

Растворы для КК:

1) солевые растворы:

• 
  -р-р Хэнкса
  
• 
  -р-р Эрла
  

Смеси Солей + Глюкоза. Используют как основу для приготовления питательной среды и для манипуляций на Культуре клеток.

2) диспергирующие растворы:

• 
  -0,25% р-р трипсина
  
• 
  -0,002% р-р версена
  

Используют для первичной трипсонизации и для снятия клеток с поверхности матраса.

3) питательные среды

• 
  -ср Игла
  
• 
  -ср 199
  

По функциям:

• 
  -поддерживающая
  
• 
  -ростовая (+10% сыворотки крови КРС).
  

Индикация вирусов в КК

Методика заражения КК (биопроба)

1. 
   Подготовительный (для заражения используют КК с полным монослоем и типичной морфологией клеток). Оставляют 5-10 матрасов с незараженной КК в качестве контроля.
   
2. 
   Биопроба
   

• 
  Из всех матрасов удаляют ростовую среду
  
• 
  вносят вирусную суспензию в заражающей дозе (контакт 1 час 37°)
  
• 
  Вирусную суспензию удаляют и вносят в поддерживающую среду
  
• 
  Культивируют при 37°, ежедневно на микроскопируя для выявления признаков репродукции вируса.
  

1) индикация вируса по цитопатическому действию (ЦПД) - это любые изменения на слоя или морфологии клеток под действием вируса. Обнаруживают методом световой микроскопии, сравнивая зараженную культуру клеток с контрольной. Любые отличия заражённой КК являются признаками ЦПД. ЦПД обнаруживают по площади изменённого на слоя или по изменению морфологии клеток (округление клетки, фрагментация, образование симпласта).

2) индикация вирусов по реакции гемадсорбции (РГАд)

Гемадсорбция - адсорбция (присоединение) эритроцитов определённого вида на клетках, заражённых вирусом.

Формы существования вирусов

Вирусы могут существовать в 2 формах:

1. 
   Внеклеточная (зрелый неактивный вирус) - вирион.
   
2. 
   Внутриклеточная форма
   

• 
  Активный репродуцирующийся вирус на любой стадии
  
• 
  Провирус (когда вирусный геном интегрирован в геном клетки хозяина и длительное время персистирующий без клинических признаков в нём)
  
• 
  Дефектные интегрирующие частицы (ДИЧ). Дефектные по генетическому материалу вирусы, у которых отсутствует информация о Белках и ферментах, необходимых для репликации вирусного генома.
  

Индикация вирусов по вириону - вирусоскопия

1. 
   Световая микроскопия (-позволяет обнаруживать вирусы только очень крупного размера(оспы); + доступность).
   
2. 
   Электронная микроскопия (- получают электронные микрофотографии, по которым можно определить критерии рода (форма вириона, размер вириона, тип симметрии, наличие суперкапсидной оболочки).
   

Индикация вирусов по тельцам включения

Некоторые вирусы во время репродукции образуют структуры (тельца-включения). Их обнаружение позволяет говорить о включении вирусов в клетку. Метод обнаружения: световая микроскопия.

Классификация

1. По происхождению и составу:

• 
  Клеточного (скопления структур клеток на ранних стадиях репродукции)
  
• 
  Вирусные (скопление компонентов вируса или отдельных вирионов, не покинувших клетку на поздних стадиях)
  
• 
  Смешанные (скопления структур клеток и компонентов вируса)
  

2. По локализации:

• 
  Ядерные ( ДНК-геномные) пр оспа днк геномная, образует тел.вкл.
  
• 
  Цитоплазматические (РНК-геномные)
  

3. По отношению к красителю:

• 
  Оксифильные в красный
  
• 
  Базофильные в синий
  

Тельца включения примеры:

• 
  Вирус бешенства - тельца Бабеша-Негри
  
• 
  Вирус чумы плотоядных - т Лентуа
  
• 
  Вирус оспы овец - т Боррелиа
  
• 
  Вирус оспы птиц - т Боллингера
  
• 
  В.инф ларинготрахеита птиц - т Зейфреда
  

Титр – количество вируса в единице объема материала.

Метод определения вируса – титрование.

Цели:

1. 
   Определение рабочей дозы вируса для серологич. Р-ии.
   
2. 
   Определение активности противовирусных вакцин.
   
3. 
   Контроль активности вируса при хранении.
   
4. 
   Постановка биопробы
   
5. 
   Получение гиперимунных сывороток.
   

Титр вируса определяют по эффекту или эффективности его действия в какой-либо системе. 2 вида эффективности действия вируса:

• 
  Инфекционной активностью обладают все вирусы
  
• 
  Гемагглютинирующая активность
  

Инфекционную активность вируса определяют по инфекционному титру методом титрования в живой чувствительной системе, где единица измерения 1 ЭД50(эффективная доза 50 – такая доза вируса, которая при введении чётному количеству ЖС, вызывает эффект в 50% случаев).

Инфекционный титр – количество ЭД50 в 1мл вируссодержащего материала. ИЛИ то число, во сколько раз развели вирус, чтобы получить одну ЭД50.

Инфекционный титр одного и того же вируса зависит от живой системы, в которой титруют вирус и от эффекта, по которому титруют вирус.

ЛЖ: летальность – ЛД50; кл.пр и пат.ан.изм – ИД50.

КЭ: летальность – ЭЛД50; пат.изм – ЭИД50; локальн.изм – ООЕ

КК: пат.изм – ЦТД50; локальн.изм – БОЕ.

Определяют инф титр вируса по методу Кербера:

1. 
   Приготовление 10вХ разведений вируса
   
2. 
   Каждым разведением вируса заражают по 4 КЭ по 0,2 мл
   
3. 
   Учёт результатов (+ КЭ пал).
   

+ МЕТОД Рида и Менча по локальным повреждениям.

Титрование вирусов по ГА-активности

ГА вирусы обладают ГА-активностью, которую определяют по ГА-титру методом титрования в количественной р-ии агглютинации.

1 ГАЕ – гемагглютинирующая единица.

За 1 ГАЕ принимают такую дозу вируса, которая вызывает ГА не менее, чем на 2 креста.

Этапы ГА:

1. 
   Адсорбция вирусов на поверхности Э засчёт взаимодействия вирусного белка ГА со специфическими рецепторами на поверхности клетки Э.
   
2. 
   Склеивание Э засчёт образования между ними мостиков из вирусов.
   
3. 
   Элюция (деабсорбция) – сползание вирусов с поверхности Э засчёт разрушения рецепторов Э.
   

РГА – обратимая. Есть качественная(капельная) только для индикации ГА-вирусов. Количественная только для определения ГА-титра вируса.

Компоненты: физ.р-р, Вирус, 1% взвесь Э петуха.

Использование серологических реакций в вирусологии

Серологические р-ии – р-ии между генетически чужеродным агентом – АГ и специфическими белками – АТ, с образованием комплекса АГ-АТ.

Задачи, решаемые с помощью серологическими р-ями:

1. 
   Индикация вируса в первичном пат мат.
   
2. 
   Идентификация выделенного вируса.
   
3. 
   Обнаружение АТ в сыворотке крови.
   
4. 
   Определение титра АТ.
   

Источник АГ – вирусные белки.

РИФ(МФА) – серологическая р-ия, основанная на том, что специфические АТ, соединённые с флюорохромом сохраняют способность вступать в специфическое взаимодействие с гомологичными АГ с образованием комплекса АГ-АТ, который обнаруживают по характерному свечению в люминесцентном микроскопе.

Признак положит РИФ – свечение.

Прямой вариант: исследуемый материал + специфический конъюгат=свечение в люминесцентном микроскопе (комплекс АГ-АТ). Используют для индикации и идентификации вирусов.

Непрямой вариант: исследуемый мат. + специфический конъюгат= комплекс АГ-АТ +антивидовой конъюгат= свечение. Используют для индикации и идентификации вирусов, обнаружение и определение титра АТ.

Конъюгат – АТ+ любая метка.

Антивидовая сыворотка – сыворотка, содержащая АТ против белков сыворотки крови того вида животного, которое было донором специфической сыворотки. + любая метка = антивидовой конъюгат.

Достоинства р-ии: экспресс-метод; обладает высоко й специфичностью; не требует стерильности компонентов.

ОООООООООООООООООООООООООООООО

РДП (р-ия диффузионной преципитации) – серологическая р-ия, основанная на том, что АГ и АТ , помещённые в лунки агарового геля диффундируют в нём в разных направлениях и, если они гомологичны друг другу между ними образуется комплекс АГ-АТ, который обнаруживают по белой линии преципитации.

За титр АТ в РДП принимают наибольшее разведение сыворотки, ещё дающее линию преципитации.

Достоинства РДП: экспресс-метод, высокая специфичность метода, не требует стерильности компонентов; низкая чувствительность.

ООООООООООООООООООООООО

РН- серологическая р-ия, основанная на взаимодействии АГ активного вируса с АТ сыворотки крови с обр. комплекса АГ-АТ, в которой вирус утрачивает свою инфекц. Активность.

Индикатором свободного несвязанного вируса является чувствительная к нему живая система. При образовании комплекса АГ-АТ живая система не заражается, т.к защищена АТ сыворотки крови.

Пр-ак + РН отрицательная биопроба.

1 этап сыворотка с АТ. АГ + АТ = АГ-АТ

2 этап биопроба на ЛЖ,КК,КЭ.

Цели использования: идентификация, обнаружение и определение титра АТ.

За титр АТ в РН принимают наибольшее разведение сыворотки, которое защищает от действия вируса 50% ЖС.

Достоинства РН: эталонная по специфичности реакция.

Недостатки: не экспресс-метод; требует стерильности комп.; трудоёмкая, длительная, дорогостоящая.

ООООООООООООООООООООООООООО

РНГА

Принцип 1 варианта: Э, на которых стабильно и необратимо адсорбированы специф. Вирусные АГ приобретают способность агглютинироваться в присутствии специфич. Гомологичных АТ. Используют для обнаружения и определения титра АТ. ЭрАГ+АТ=ЭрВАТ

Принцип 2 варианта: Э, на которых стабильно и необратимо адсорбированы специф. противоВирусные АТ приобретают способность агглютинироваться в присутствии специфич. Гомологичных АТ. ЭрАТ+АГ=ЭрАТ

Компоненты: физр р, сыворотка, эритроцитарный АГ диагностикум.

За титр АТ в РНГА – наибольшее разведение сыворотки, дающее ГА не менее, чем на 2 креста.

Пр-ак + зонтик

Этапы изготовления эритроцит. Диагностикумов:

1. 
   Подготовка Э. получают из баранов, птиц, людей (искл. Для болезней людей) и консервируют р-р формалина или акрола.
   
2. 
   Ранизация эритроцитов. Обрабатывают дубильными в-вами, оболочка Э уплотняется и сморщивается, приобретая большую сорбционную ёмкость (способность адсорбировать белки).
   
3. 
   Сенсибилизация (повыш чувствительности). Фиксируют специфические вирусные белки или АТ.
   

Достоинства РНГА: экспресс; не тр стерильности; высокая чувствительность и специфичность; простая техника.

Недостаток: сложность в изготовлении диагностикумов.

ОООООООООООООООООООООО

Реакция торможения гемадсорбции (РТГАд) основана на взаи­модействии расположенных на поверхности зараженных клеток анти­генов гемадсорбирующих (вызывающих адсорбцию эритроцитов на поверхности зараженных клеток) вирусов со специфическими анти­телами. При этом блокируется гемадсорбирующая активность вируса. Индикатором в реакции торможения гемадсорбции являются эри­троциты определенного вида животных.

РТГАд преимущественно используют для идентификации вируса и редко — для обнаружения и титрования антител.

Для идентификации вируса последовательные двукратные разве­дения вируса вносят в лунки планшета с культурой клеток. После контакта добавляют специфическую сыворотку в постоянной рабочей концентрации. На втором этапе вносят индикатор — 0,5 —1%-ю взвесь эритроцитов, которые после контакта удаляют физиологиче­ским раствором. Реакцию учитывают методом световой микроскопии по отсутствию адсорбированных на клетках эритроцитов.

Реакция имеет ограниченное применение, поскольку может быть использована только для гемадсорбирующих (гемагглютинирующих) вирусов, не является экспресс-методом и трудоемка.

ООООООООООООООООООООО

РТГА – серолог реакция на взаимодействие ГА вируса с АТ сыворотки крови, с образованием АГ-АТ, в котром вирус утрачивает ГА-активность. Э не склеиваются, т.к. вирус теряет способность адсорбироваться на Э и ГА тормозится.

Пр-ак + пуговка

Индикатором свободного вируса является чувствительность к Э.

1 эт: АГ+АТ = АГ-АТ

2ЭТ: АГ-АТ + ЭР = пуговка

За титр принимают наибольшее разведение сыворотки, полностью тормозяящее ГА.

Титр должен иметь 4ГАЕ.

Достоинство РТГА: не требует стерильности; высокая специфичность; простая постановка

Недостаток: только для ГА-вирусов.

ООООООООООООООООООООО

Иммунно-ферментный анализ (ИФА) - серологическая р-ия, основанная на том, что АТ, соединённые с ферментной меткой – конъюгат – вступают в специфическое взаимодействие с гомологичным АГ с образованием комплекса АГ-АТ, в который встраивается ф-т и добавление к комплексу ф-та чувствительного в-ва (субстрата) приводит к образованию цветного продукта ферментативной р-ии.

ИФА: 1. специфическая фаза – сама иммунная реакция(образование АГ-АТ); 2. Неспецифическая – ферментативная р-ия, которая позволяет увидеть и измерить результат.

Пр-ак + ИФА – цветное окрашивание прямо пропорциональное кол-ву АТ или АГ в исследуемом материале.

Реакция учитывается визуально или с помощью спектрофотометра.

АГх + специф конъюгат = АГхАТ + субстрат = цв.окрашивание

Ферменты: щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена.

Субстрат – в-во, на которое действует фермент. (которое меняет цвет)

Твердофазный вариант ИФА : 1 из компонентов (АТ или АГ) адсорбирован на дне плашки. Р-ия проходит на границе 2 фаз.

1 вариант(сэндвич): Специфические АТ + АГx = (комплекс) АГх-АТ + специфический коньюгат = комплекс + субстрат = продукты ферментативной реакции. Для обнаружения АГ и идентификации, и индикации вируса.

2 вариант(непрямой): Специфические АТx + АГ = (комплекс) АГ-АТx + антивидовой коньюгат = комплекс + субстрат = продукты ферментативной реакции. Для обнаружения АТ и титра АТ.

Достоинства: Экспресс метод; Метод обладает чуствительностью и специфичностью; Не требует стерильности; Возможность полной автоматизации.