|
|
Приготовление искусственных питательных сред и их. Приготовление искусственных питательных сред и их стерилизация
Приготовление искусственных питательных сред и их стерилизация
План: История появления питательных сред Питательная среда – это смесь веществ предназначенных для выращивания микроорганизмов в искусственных, лабораторных условиях. История открытия питательных сред начинается с Л. Пастера. В 19 веке он положил начало культивированию в жидких средах. - В 1861 году он доказал, что брожение есть процесс, тесно связанный с жизнедеятельностью дрожжевых грибков, которые питаются и размножаются за счёт бродящей жидкости, т.е. положил начало культивированию в жидких средах.
- В 1883 году Р. Кох разработал метод выделения чистых культур микробов путем посева на пластинки желатина. Другой состав плотной среды, который используется до сих пор, предложил в 1884 году немецкий микробиолог В. Хессе. Основным компонентом был агар-агар, который его жена использовала для приготовления фруктового желе.
- Такая форма в виде донышка, отрезанного от лабораторной бутыли, была предложена в 1887 году Ю. Петри и получила название - чашка Петри.
Эти открытия положили основу для разработки, а затем промышленного выпуска и широкого практического использования жидких, полужидких и плотных питательных сред, которые, так же как и чашки Петри, до сих пор являются неотъемлемым атрибутом каждой микробиологической лаборатории. - В 1905 году бактериолог А. Мак-Конки разработал первую хромогенную среду. В ее состав входят селективные компоненты (нейтральный красный и соли желчных кислот), которые ингибируют рост грам-положительных микробов, и специфический субстрат – лактоза. Кишечные бактерии ферментируют лактозу, что приводит к понижению рН и изменению окраски рН-индикатора. В результате колонии сальмонелл, шигелл и колиформных бактерий имеют красный цвет и окружены мутной зоной преципитации желчных солей.
В. Хессе Э. Петри Классификация питательных сред - По исходным компонентам:
- Натуральные среды (продукты живот. и раст. происх.)
- искуственные
- Синтетические среды
- По степени готовности:
- Готовые среды
- Сухие смеси
- По консистенции:
- Жидкие
- Полужидкие
- Плотные
- По составу (простые и сложные)
- По назначению:
- Основные (для культивирования больш. орган-в.)
- Специальные (выделение и выращивание)
- Элективные (выделение определ-х видов микробов)
- Дифференциально диагностические
- Транспортные
- По исходным компонентам:
- Натуральные среды — готовят из продуктов животного и растительного происхождения (мясо, асцит, костная мука, кормовые дрожжи, сгустки крови и др.) - Искусственные среды - содержат переработанные естественные продукты (мясную воду, перевар), вещества, полученные из этих продуктов (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты) и различные добавки. Это наиболее применяемая группа сред. Их готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ. - Синтетические среды — готовят из определённых химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дважды дистиллированной воде. - По степени готовности:
- Готовые питательные среды (в чашках Петри, во флаконах) - Сухие смеси. Это высушенные и измельченные до порошкообразного состояния готовые питательные среды. У сухих сред имеется ряд преимуществ перед средами обычного изготовления: их можно хранить длительно в сухом затемненном помещении в герметически закрытой таре, они транспортабельны, удобны в применении и стандартны, что облегчает получение сравнимых результатов при бактериологическом исследовании.Источник: - По консистенции (степени плотности):
- Жидкие (бульоны) - Полужидкие - Плотные Плотные и полужидкие среды отличаются от жидких наличием желирующего агента (агар-агар, реже желатин). Кроме того, в качестве плотных сред применяют коагулировавшие яичные или сывороточные белки, картофель, среды с силикагелем. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество — при их росте среда разжижается. - По составу:
- Простые: мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), питательный желатин. - Сложные — многокомпонентные среды, которые могут содержать аминокислоты, витамины, микроэлементы и другие вещества. По назначению: - По назначению:
- Основные — служат для культивирования большинства микроорганизмов, например МПБ, МПА, бульон, шоколадный агар, пептонная вода. - Специальные — служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах. - Элективные (избирательные) — служат для выделения определённого вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. Среды становятся элективными при добавлении к ним определённых антибиотиков, солей, изменения pH. Жидкие элективные среды называют средами накопления. - Дифференциально-диагностические — применяют для изучения биохимических свойств и отличия (дифференцировки) одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. - Транспортные — предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала. — среды определенного и неопределенного состава; — натуральные, полусинтетические и синтетические; — основные, диагностические, элективные; — плотные, полужидкие, жидкие, сухие, сыпучие. Натуральными питательными средами называют те, что получают из природных материалов: крови, мяса, белков, органов животных, растительных экстрактов и растительного сырья. Примером таких сред могут быть мясной бульон, молочная сыворотка, пивное сусло, настои сена, агар-агар, кровь, желчь. Натуральные среды относятся к средам с неопределенным составом, который в разное время могут иметь разное количество тех или иных компонентов. Полусинтетические среды тоже считаются средами с неопределенным составом. Они готовятся на основе натуральных питательных сред, но в них добавляются вещества, которые гарантируют культурам активное размножение. На полусинтетических средах выращивают культуры для получения витаминов, аминокислот, антибиотиков в промышленной фармацевтике. Основные, элективные и диагностические питательные среды Основные среды служат для выращивания различных микробных культур, а также как основа для получения элективных и диагностических сред. К основным средам, например, относится мясной бульон, мясной агар, сусло, бульон Хоттингера. Для разных культур в основные среды добавляют некоторые компоненты для стимулирования роста — это могут быть витамины, аминокислоты, природные экстракты. Так, возбудитель коклюша выращивается на среде с добавлением крови. Элективные среды — среды для избирательного (селективного) выращивания биологических культур. Состав среды подбирается так, чтобы быть оптимальным для одного вида или группы близкородственных бактерий и подавлять развитие бактерий других видов. Диагностические среды служат для идентификации микроорганизмов. По изменению среды и ее химического состава (изменению окраски среды, появлению пузырьков газа и т.п.) определяют вид бактерий. В такие среды часто добавляют химические красители-индикаторы, такие как кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый, метиленовый синий, фусин и другие. Они помогают разделить близкие культуры. Скажем, в розовой среде Эндо, подкрашенной фусином, кишечная палочка образует колонии красного цвета, а тифозные и дизентерийные колонии бактерий — бесцветные. Требования к питательным средам Питательные среды должны : - быть питательными, то есть содержать в легко усваиваемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. При культивировании ряда микроорганизмов в среды вносят факторы роста — витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать.
- иметь оптимальную концентрацию водородных ионов — pH, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества.
Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (pH 7,2—7,4). Исключение составляют холерный вибрион — его оптимум находится в щелочной зоне (pH 8,5—9,0) и возбудитель туберкулёза, нуждающийся в слабокислой реакции (pH 6,2—6,8). Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили pH, среды должны обладать буферностью, то есть содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена. - быть изотоничными для микробной клетки; то есть осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальная среда, соответствующая 0,5 % раствору натрия хлорида.
- быть стерильными, так как посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды.
- плотные среды́ должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию.
- обладать определённым окислительно-восстановительным потенциалом, то есть соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2. Например, анаэробы размножаются при RH2 не выше 5, а аэробы — при RH2 не ниже 10.
- быть по возможности унифицированным, то есть содержать постоянное количество отдельных ингредиентов.
Свойства: - содержать достаточное количество питательных веществ, микроэлементов, минеральных солей;
- иметь определенную вязкость;
- иметь определенные влажность и/или кислотность;
- быть изотонической, не нарушать нормальное функционирование клеток, проницаемость клеточных мембран;
- в большинстве случаев – прозрачной.
Консистенция: К жидким средам относятся растительные экстракты, сыворотка крови, мясной бульон. На основе жидких сред, добавляя определенные количества агар-агара, желатина, силикагеля, получают полужидкие и плотные среды. Плотные среды применяются для выращивания чистых культур микроорганизмов, для исследования их свойств, для подсчета количества бактерий в исследуемой пробе. Сухие питательные среды представляют собой гигроскопичный порошок. Это стандартизированные готовые смеси, которые выпускаются промышленным способом и предназначены для приготовления питательных сред в лаборатории. Их преимущества: — точно известный химический состав; — долгий срок хранения; — высокое качество компонентов и высокая степень очистки, которых трудно добиться вне условий специализированной лаборатории; — удобны при хранении и транспортировке; — из них просто и быстро можно приготовить питательную микробиологическую среду. Приготовление питательных сред Для приготовления питательных сред в лабораториях используют или уже готовые сухие смеси, или проверенные временем рецепты, которые есть в специализированной литературе. Существует более тысячи питательных сред для культивирования различных микроорганизмов. В полужидкие и плотные среды вводят агар-агар или желатин, чтобы добиться нужной консистенции. После того, как питательная среда изготовлена, ее делают прозрачной, добавляя специальные вещества (например, яичный белок) и отфильтровывая взвешенные частицы. Плотные и полужидкие среды, как правило, фильтруют горячими. Следующий этап — установить определенный уровень кислотности среды, добавляя раствор кислоты или щелочи. Это очень важно, так как разные микробы и бактерии требуют своего уровня рН. Есть микроорганизмы, которые могут размножаться только в кислой (рН около 9) или только в щелочной (рН=5) среде. Для нейтральной среды уровень кислотности подбирается с точностью до десятых долей, например, рН=7,4. Для контроля кислотности используют цветную индикацию (лакмусовые бумажки, фенолфталеин, метанитрофенол и др.) и фотоколориметры или рН-метры. Приготовленную питательную среду в конце обязательно стерилизуют, чаще всего методом термообработки, в автоклаве или аппарате Коха. Способ и режим термообработки зависит от вида среды. Приготовление питательных сред Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в среду при варке её в ржавых кастрюлях. Лучше пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. Перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить. Новую стеклянную посуду предварительно кипятят 30 минут в 1-2 % растворе хлороводородной кислоты, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде. Посуда для приготовления сред: Посуда для культивирования микроорганизмов 1 – качалочная колба; 2 – качалочная колба с отбойниками; 3 – коническая колба; 4 – чашка Петри; 5 – пробирка; 6 – матрац. Сырье: Исходным сырьём для приготовления большинства сред служат продукты животного и растительного происхождения, а также готовые полуфабрикаты. Этапы варки - Варка. среды варят на открытом огне, водяной бане, автоклаве или варочных котлах.
- Установление pH. ориентировочно производят с помощью индикаторной бумаги, для точного определения пользуются потенциометром или компаратором. При стерилизации pH снижается на 0,2, поэтому сначала готовят более щелочной раствор.
- Осветление. Производят, если при варке среды мутнеют или темнеют. Для этого используют белок куриного яйца или сыворотку крови.
- Фильтрация жидких и расплавленных желатиновых сред производят через влажный бумажный или матерчатый фильтры. Фильтрация агаровых сред затруднена — они быстро застывают. Обычно их фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
6. Стерилизация: режим стерилизации зависит от состава среды и указан в её рецепте. 7. Контроль. - Для контроля стерильности среды ставят на 2 суток в термостат, после чего их просматривают. - Химический контроль окончательно устанавливает pH, содержание общего и амминого азота, пептона, хлоридов. - Для биологического контроля несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами, и по их росту судят о питательных свойствах среды. Стерилизация питательных сред Все питательные среды независимо от их назначения разливают в чистую посуду и стерилизуют. Большинство сред стерилизуют автоклавированием, но при различных режимах. - . Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15—20 мин в автоклаве при температуре 115—120°С и давлении 1-1,5 атмосферы.
- Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С и давлении до 1 атмосферы.
- . Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.
- Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.
Хранение питательных сред Приготовленные и стерилизованные питательные среды разливают по большим колбам или культуральным бутылям и хранят в темных, холодных помещениях с контролируемой влажностью. Перед применением среды с желирующими компонентами (агаром, желатином) нагревают на водяной бане и разливают через воронку или бюретку по сосудам, в которых будет производиться выращивание культур: по биологическим пробиркам или чашкам Петри. Пробирки устанавливают вертикально или почти горизонтально, чтобы получить среду в виде столбика или скошенную, с увеличенной площадью поверхности. При работе с аэробными (дышащими кислородом) культурами пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками, которые пропускают воздух, но не посторонние микроорганизмы. Для выращивания и изучения анаэробных микроорганизмов следует ограничить или исключить доступ кислорода к ним. Для этого культуры выращивают под слоем масла, в глубине плотных сред, в атмосфере из углекислого газа. Иногда в среду добавляют специальные вещества, которые связывают кислород. Спасибо за внимание |
|
|
Скачать 3.21 Mb.