СОП, гепатит В,С. Проведение исследования. Гепатит В,С СОП. Принцип выявления количественного и качественного определения днк вируса гепатитаВиС методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
 Скачать 21.61 Kb.
|
|
Принцип выявления количественного и качественного определения ДНК вируса гепатита Ви С методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Пересмотр СОП
Стандартные операционные процедуры 1.Назначение Принцип выявления и количественного и качественного определения ДНК вируса гепатита В- методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. 2. Материал - сыворотка в объеме 1000 мкл 3. Оснащение - одноразовый хирургический комплект - перчатки одноразовые - контейнер с дезинфицирующим раствором - контейнер для мед. отходов - стандартные бланки направление крови -маркер - пробирка «Vocutainer» - штатив - набор одноканальных полуавтоматических дозаторов - одноразовые наконечники для пипеток на 200мкл и 1000мкл с аэрозольным барьером - одноразовые наконечники для пипеток на 200мкл без фильтра -одноразовые полипропиленовые пробирки на 200мкл -штативы для пробирок и микропробирок вместимостью 1000,200,02 мкл -магнитный штатив для выделения нуклеиновых кислот 4.Оборудование. -амплификатор с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени «CFX-96» -ламинарный бокс 2-го класса биологической защиты (бокс абактериальный воздушной среды типа БАВп -01- Ламинар-с) -холодильник бытовой микроцентрифуга типа «Eppendorf c минимальной скоростью вращения не ниже 13000 об/мин -встряхиватель для пробирок «Вортекс» -термошейкер -отсасыватель хирургический 5. Реагенты -набор для выделения нуклеатиновой кислоты -готовая реакционная смесь 6.Инструкция по выполнению процедур. А) - условия передачи материала (венозная кровь) в лабораторию и его регистрация Б) - последовательность работы с набором для выделения НК Область применения:Для выявления, количественного и качественного определения ДНК вируса гепатита В в режиме реального времени Образцы для исследования: Сыворотка или плазма. Готовность к анализу: 1 - Надеть резиновые перчатки и одноразовый хирургический комплект. 2 - Довести все реагенты до температуры 18-22 градуса в течении 30 мин. 3 - Отобрать и подписать необходимое количествопробирок объемом 2 мл(с учетом контролей) 4- В каждую пробирку внести по 30 мкл ВКО 5 -Для отрицательного контроля внести 1мл ОКО 6 -Для положительного контроля внести 970мл ОКО и 30 мл ПКО 7 - В остальные пробирки внести по 1 мл анализируемых образцов сыворотки.Для каждого образца использовать индивидуальный наконечник для пипетки. 8 -В каждую пробирку не задевая стенок внести по 1 мл концентрирующего раствора. 9- Содержимое пробирок тщательно перемешать переворачиванием 5 раз и выдержать при комнатной темпиратуре 10-15 мин.Затем центрифугировать при 3000 об/минпри комнатной температуре 5 мин. 10-Из каждой пробирки пипеткой с отдельным наконечником максимально удалить надосадочную жидкость. 11-В каждую пробирку к полученному осадку добавить по 200мкл 1-го лизируещего раствора .Перемешать содержимое пробирок на вортексе в течении 10-15 сек,чтобы осадок отслоился от дна пробирки,выдержать при комнатной температуре 5 мин. 12-В каждую пробирку добавить по 500 мкл 2-го лизирующего раствора с сорбентом.Перемешать содержимое пробирок на вортексе в течении 10-15 сек.Выдержать в термошейкере при 56*С в течении10 мин с частотой вращения 1300 об/мин.Коротким центрифугированием сбросить капли со стенок пробирки. 13- Вкаждую пробирку с анализирующими образцами внести по 750 мкл осадителя НК. 14-Перемешать содержимое пробирок на вортексе в течении 10-15 сек.Оставить при комнатной температуре на 3-5 мин.Центрифугировать при 13 000 об/мин при комнатной температуре 5 мин. 15-Не взбалтывая осадок установить пробирки в магнитный штатив .Из каждой пробирки отдельным наконечником отобрать надосадочную жидкость. 16-Вкаждую пробирку к осадку добавить 500 мкл раствора для отмывки №1.Перемешать содержимое пробирок на вортексе в течении 10-15 сек. Центрифугировать при 13 000 об/мин при комнатной температуре 5 мин. 16-Не взбалтывая осадок установить пробирки в магнитный штатив .Из каждой пробирки отдельным наконечником отобрать надосадочную жидкость. 17-В каждую пробирку к осадку добавить 300 мкл раствора для отмывки №2.Перемешать содержимое пробирок на вортексе в течении 10-15 сек.Центрифугировать при 13 000 об/мин при комнатной температуре 5 мин. 18- Не взбалтывая осадок установить пробирки в магнитный штатив .Из каждой пробирки отдельным наконечником отобрать надосадочную жидкость.Высушить осадки при комнатной температуре в течении 2-3 мин 19В каждую пробирку к осадку добавить 200 мкл элюирующего раствора. Тщательно ресуспендировать на вортексе. Инкубировать в термошейкере при 65С 10 мин.Центрифугировать 1 мин при 13000 об/мин. 7.Проведение ПЦР. 1-Пробирки с подготовленными пробами установить в магнитный штатив. 2-Необходимое количество микропробирок с готовой реакционной смесью для ПЦР пронумеровать и расположить в штативе. 3-В каждую микропробирку пипеткой отдельным наконечником с фильтром внести 50 мкл соответсвующего раствора выделенной ДНК. 4-Поместить пробирки в амплификатор. 5-Запрограмировать прибор для проведения амплификации специфического продукта фрагмента ДНК ВГВ и ВКО и детекциифлуоресцентных сигналов. 6-Полученные результаты передаем через систему ЛИС в регистратуру или в СВА. Ссылка: СОП составлен на основе инструкции по применению изделия медицинского назначения. Лист регистрации изменений
Лист ознакомления
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||