Стандартизация обработки и приготовления гистологического материала. Стандартизация обработки и приготовления гистологического матери. Сендерович А. И. Москва 2017
 Скачать 0.95 Mb.
|
|
Сендерович А.И. Москва 2017 ФГБУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина МЗ РФ Рак легких Занимает 1-е в место в России среди онкологических заболеваний (12%) 80% по гистотипу относится к НМРЛ Молекулярный портрет НМРЛ EGFR ALK KRAS ROS1 RET Технологические недостатки Малое количество ДНК Низкое качество ДНК (деградация в процессе фиксации) Парафиновые блоки – лучший способ сохранить опухолевую ткань Исследование генетических основ онкологических заболеваний увеличивает ценность парафиновых блоков Фиксация Выбор фиксатора Время фиксации Хранение материала до фиксации История В 400 г. до н.э. Гиппократ изучал воздействие ртути и этанола в качестве фиксаторов Вторая половина 19 века: систематическое изучение фиксаторов Выбор фиксатора Этанол Ацетон 10% забуференный формалин Время фиксации для операционного материала – 12-24ч, для биопсийного – 6-8ч фиксация материала на следующий день недопустима! Воздействие формалина на ДНК Образование перекрестной связи с белком Инициация денатурации за счет разрушения межцепочечных водородных связей на АТ-богатых участках Механизмы взаимодействия формальдегида с ДНК Реакция присоединения. Формальдегид добавляется к основанию нуклеиновой кислоты с образованием гидроксиметил группы (-СН2 OH). Электрофильная атака N-метилолом аминооснований с образованием метиленового мостика между двумя аминогруппами. Генерирует АП (апуриновые и апиримидиновые) сайты. Вызывает медленный гидролиз фосфодиэфирной связи. Влияние формалина на последовательность ДНК Создание искусственных мутаций C-T или G-A Необходимо секвенировать один образец дважды (в прямом и обратном направлении) G-A C-T Прямой сиквенс Прямой сиквенс Обратный сиквенс Обратный сиквенс Наиболее амплифицируемая ДНК – это нуклеиновая кислота, выделенная из тканей, фиксированных в 10% забуференном формалине Количество опухолевых клеток, необходимое для генетического исследования оптимально – не менее 50% минимально – 20% Оптимизация процесса экстракции ДНК Минеральное масло для депарафинизации 0,1М NaOH, нагретый до высоких температур Метод с фенол-хлороформом 4. Автоматизированный способ 5. Коммерческий набор Подготовка к экстракции Толщина срезов 8-10 мкм Срезы на стеклах Срезы в пробирках Основные этапы выделения ДНК Депарафинизация Обработка протеиназой К Получение ДНК Депарафинизация Ксилол Этанол: 95% 75% 50% Депарафинизация на стеклах позволяет проводить макродиссекцию Ферментативная обработка В пробирку следует добавить 20мкл протеиназы К (20мг/мл) и 180мкл лизирующего буфера (10mM Tris-HCl, pH 8 mM EDTA, pH 8 mM NaCl, 0,5% SDS) инкубировать полученную смесь при температуре 560С. Время инкубации с протеиназой К 24ч 72ч 5 дней Чем длиннее период инкубации ткани с протеиназой, тем больше выход ДНК. Экстракция ДНК Метод с фенол-хлороформом Метод с использованием абсорбционных колонок Например, QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Germany) Количество амплифицируемой ДНК после ПЦР приблизительно одинаково Проверка качества и количества ДНК Оптимальная концентрация ДНК = 2нг/мкл 1,8<А260/А280<2,0 ДНК хранить при t=-800С Анализ гена EGFR 18, 19, 20 и 21 экзоны ПЦР-РВ – определение спектра известных мутаций ПЦР+прямое секвенирование – определение всех известных и всех новых мутаций Трудности анализа гена EGFR Малое количество ПЦР продукта Невозможность амплифицировать длинные фрагменты Электрофорез в 2% агарозном геле М 18ex 19ex 20ex 21ex Решение проблемы Другой набор праймеров (для получения более короткого фрагмента) Другой материал от этого же пациента Ограничение - малое количество опухолевого материала у пациентов с НМРЛ Стандартизация обработки и приготовления гистологического материала имеет первостепенное значение. Спасибо за внимание |