Практическое занятие 5 (1). Тема Молекулярногенетические методы исследования. Геномика. Генная инженерия Актуальность темы (мотивация)
 Скачать 0.67 Mb.
|
|
Тема 5. Молекулярно-генетические методы исследования. Геномика. Генная инженерия Актуальность темы (мотивация): Исследование ДНК и РНК используется во многих разделах медицины. Знание структуры и функции генов, основных видов изменчивости, знакомство с наследственными болезнями позволяет перейти к анализу молекулярно-генетических методов. Методы молекулярной генетики направлены на изучение молекулы ДНК как в норме, так и при ее повреждении, а также на «манипуляции» с молекулами ДНК и РНК. Использование молекулярно-генетических методов требует знания основных этапов получения определенных последовательностей (фрагментов) ДНК. Цель занятия: Изучить молекулярно-генетические методы исследования ДНК - Студент должен знать: 1. Возможности молекулярной генетики 2. Молекулярно - генетические методы диагностики наследственных болезней - Студент должен уметь: 1. Применять молекулярно – генетические методы исследования для определения наследственной патологии. Вопросы для самоподготовки: а) по базисным знаниям: 1. Нуклеиновые кислоты, строение, виды, функции. 2. Кариотип. 3. Перенос генетической информации б) по теме занятия: 1. Получение образцов ДНК 2. Амплификация 3.Электрофорез фрагментов ДНК 4. Саузерн блоттинг 5.Технологии получения нуклеотидных последовательностей ДНК Информационно-дидактический блок: Молекулярно-генетические методы — большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций (повреждений) в структуре участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат генно-инженерные манипуляции с ДНК и РНК. Исходным этапом всех молекулярно-генетических методов является получение образцов ДНК. Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. На практике чаще используют лейкоциты, хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов. Возможность проведения молекулярно-генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов данной группы. Выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различных исследований и может долго сохраняться в замороженном виде. Во многих случаях для успешной диагностики болезни достаточно исследовать небольшой фрагмент генома. Выделение таких фрагментов стало возможным благодаря открытию ферментов — рестриктаз, которые разрезают молекулу ДНК на фрагменты в строго определенных местах. 1. Получение образцов ДНК: — выделение всей (геномной) ДНК из клеток (лимфоцитов, фибробластов, амниотических клеток, клеток хориона); — рестрикция ДНК — получение отдельных фрагментов ДНК (использование рестриктаз, которые разрывают ДНК по строго определенным последовательностям нуклеотидов из 4-6 пар оснований — сайтах рестрикции). 2. Амплификация — накопление (умножение, клонирование) одинаковых фрагментов ДНК: — использование классических трудоемких методов: создание рекомбинантных плазмид —> введение их в бактериальную клетку —> размножение клеток —> выделение заданных фрагментов ДНК; — использование полимеразной цепной реакции: разделение двухцепочечной ДНК на одноцепочечную —> присоединение праймеров (затравка) к одноцепочечным молекулам ДНК (по принципу комплементарности) —> синтез многочисленных полинуклеотидных цепей на одноцепочечных молекулах в границах присоединения праймеров. Рис 10 Амплификация 3. Электрофорез фрагментов ДНК — разделение фрагментов по молекулярной массе и электрическому заряду на поверхности агарозного геля. Каждый фрагмент имеет определенные размеры и занимает в геле определенное место в виде дискретной полосы. 4. Идентификация конкретных фрагментов ДНК с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Фрагменты ДНК переносятся на специальные фильтры, где проводится их гибридизация с радиоактивными синтетическими зондами или клонированными фрагментами ДНК. Зонд выявляет необходимый фрагмент ДНК путем связывания с комплементарными ему нуклеотидными последовательностями фрагмента. Рис 12 Саузерн блоттинг Изменение положения и длины фрагмента по сравнению с контролем (зондом), исчезновение или появление нового фрагмента свидетельствует о перестройках последовательности нуклеотидов в исследуемом гене. Базируясь на технологии получения нуклеотидных последовательностей ДНК, можно выделить следующие методы молекулярной генетики. 1. Метод секвенирования — определение нуклеотидной последовательности ДНК. Таким методом полностью определена последовательность нуклеотидов генов глобина, некоторых гормонов (инсулина, гормона роста, пролактина и др.). 2. Метод полимеразной цепной реакции (используется для увеличения числа фрагментов ДНК). Для этого необходимо узнать нуклеотидную последовательность данного фрагмента, и синтезировать два олигонуклеотидных праймера (поправки). Процесс амплификации включает три стадии: температурная денатурация ДНК (разделение двухцепочечной ДНК на одноцепочечные молекулы) → присоединение праймеров к комплементарным последовательностям одноцепочечных молекул (отжиг)→синтез полинуклеотидных цепей на одноцепочечных молекулах в границах присоединенных праймеров с помощью полимеразы. Многократное повторение данного цикла позволяет размножить определенную последовательность ДНК в миллион и более раз . Рис 13 Стадии ПЦР 3.Метод получения праймеров, соответствующих известным генам. 4. Метод гибридизации нуклеиновых кислот. 5. Метод клонирования ДНК. 6. Метод получения рекомбинантных молекул ДНК. 7. Метод получения белков с помощью рекомбинантных молекул ДНК. 8. Создание библиотеки генов — полного набора (коллекции) клонированных фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикции тотальной ДНК. Методы молекулярной генетики позволяют: • идентифицировать мутации в гене. Примером выявления мутантного гена является диагностика серповидно-клеточной анемии в эмбриональном периоде. Фрагменты ДНК, полученные при действии рестриктаз у здорового и больного, сравниваются с помощью метода гибридизации по Саузерну, при этом в качестве зонда используется радиоактивно меченая ДНК гена Р-глобина; • диагностировать моногенное наследственное заболевание путем определения нуклеотидной последовательности генов (гемофилия, гемоглобинопатия) и выявления мутантных генов (фенилкетонурия, муковисцидоз); • осуществлять генетический анализ полиморфизма ДНК родителей и детей; • определять индивидуальную изменчивость ДНК человека по вариабельным точкам ДНК, молекулярный анализ которых позволяет проводить идентификацию личности человека); • выделять и синтезировать гены (выделение, синтез и клонирование генов является одним из этапов генной инженерии): а) выделение генов: получение определенных фрагментов ДНК с помощью рестриктаз: разделение фрагментов по молекулярной массе и электрическому заряду —» определение длины фрагмента —> выявление нуклеотидной последовательности данного гена; б) синтез генов (варианты): химический синтез — синтез определенных последовательностей нуклеотидов, соответствующих данному гену (используют генетический код и по известной последовательности аминокислот химическим путем синтезируют последовательность ДНК). Ферментативный синтез — с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы) на матрице мРНК синтезируют комплементарную ДНК. Контроль: 1. Оценка компетенции - знание. 2. Устный опрос по основным вопросам темы. 3. Тестовый контроль – 2 варианта по 10 вопросов. 4. Решение задач: Задача № 1 Для идентификации и локализации гена применяются ДНК-зонды - короткие фрагменты ДНК с известной последовательностью нуклеотидов, комплементарные участку гена. С каким участком молекулы ДНК свяжется ДНК-зонд, имеющий следующую структуру: АТТТАТАТГЦЦЦАЦ ? ДНК- ГГЦЦЦТГАТЦГТАГАТТТАТАТГЦЦЦГТЦТАГГТАЦАТАААТАТАЦГГГТГТЦЦАТГ Задача № 2. Для обнаружения мутации в определенном гене с известным белковым продуктом, используется ДНК-зонд с последовательностью, комплементарной этому участку ДНК. ДНК-зонд можно синтезировать на иРНК, несущей информацию о данном белке. а) Синтезируйте ДНК- зонд для локализации гена, отвечающего за синтез следующего белка: фен-лиз-про-гис. б) Определите локализацию этого гена на ДНК: ДНК - ГЦТАТАГГЦГЦТАААГТТТГГАГТААТГААТТТТАТАТГГГАУАТГАЦТА Задача № 3. Рестриктазный анализ заключается в том, что с помощью фермента рестриктазы разрезают ДНК на фрагменты. Разные рестриктазы узнают разные последовательности, т.е. имеют разные сайты рестрикции. Затем эти фрагменты пропускают через гель в электрическом поле (гель-электрофорез). При этом фрагменты займут в геле строго соответствующее место в зависимости от их длины. Дальше всех будет располагаться самый короткий отрезок. Дан участок молекулы ДНК. ДНК- АТГГАТАТТТЦГАЦЦГАТААТТТТГЦЦЦАГАТЦГАТААТТТГТАААГЦГЦЦАГТ а) Сколько фрагментов образуется, если ее обработать рестриктазой, "разрезающей ДНК" в середине сайта - АТТТ ? б) Какие фрагменты образуются и как они распределятся в геле? Расположите их по порядку. в) Как изменится распределение фрагментов в геле, если в ДНК произойдет мутация в участке, указанном стрелкой, где Т (выделен жирным) заменится на А? Контрольные вопросы: 1. Что представляют тобой молекулярно-генетические методы? 2. Что такое амплификация гена? 3. Описать Саузерн – блот гибридизацию 4. Что представляет собой секвенирование ДНК? 5. Возможности молекулярной генетики |