транскрипция_у_эукариот. Транскрипция у эукариот
 Скачать 69.5 Kb.
|
|
Транскрипция у эукариот В основном, механизмы транскрипции у эукариот сходны с хорошо исследованной транскрипцией прокариот. Однако, имеются и значительные различия. Главными из них являются:
Процесс транскрипции состоит из трех этапов: инициации, элонгации и терминации. РНК-полимеразы эукариот
В состав РНК-полимераз эукариот входит большое количество субъединиц, они значительно крупнее прокариотических. РНК-полимеразы эукариот состоят из двух больших субъединиц и 10-15 малых. Две большие субъединицы сходны у разных типов РНК-полимераз эукариот и аналогичны субъединицам РНК-полимераз прокариот. Регуляторные элементы эукариот Элементы, регулирующие транскрипцию у эукариот многочисленны и могут находиться как в районе промотора, так и на большом расстоянии от него (цис-элементы). Промотор каждого эукариотического гена имеет свой определенный набор регуляторных последовательностей. Кроме того, для регуляции транскрипции у эукариот используется большое количество регуляторных белков (транс-действующие факторы).
Строение и экспрессия генов класса II Гены класса II кодируют все цитоплазматические мРНК и все, за исключением одной (U6) мяРНК. Гены класса II имеют наиболее типичное для эукариот строение. Гены эукариот имеют прерывистое (мозаичное) строение - последовательности, кодирующие последовательность аминокислот в белке (экзоны) чередуются с последовательностями, не несущими информации о структуре белков (интроны). мРНК после синтеза подвергаются модификации (процессингу). Одним из этапов процессинга является сплайсинг – вырезание интронов и сшивание экзонов. Все транскрипты (мРНК, мяРНК) генов класса II имеют характерные группировки (кэпы) на 5׳-конце и poly(A)-хвосты на 3׳-конце, сразу за кодирующей последовательностью. Многие гистоновые мРНК и некоторые мяРНК не имеют хвостов. мРНК эукариот несет информацию о структуре одного белка (моноцистронная). Только в некоторых случаях (альтернативный сплайсинг) с одной мРНК может образовываться несколько близких по строению белков. Во время инициации транскрипции к регуляторным последовательностям промотора присоединяются факторы транскрипции. Эти белки участвуют в связывании РНК-полимеразы II с промотором. Факторами транскрипции РНК-полимеразы II являются: TFIIA, TFIIB, TFIIC, TFIID и т.д. Фактор TFIID непосредственно связывается с ТАТА-боксом, поэтому его называют ТАТА-связывающим белком. После связывания ДНК с этим белком, с ним ассоциирует не менее семи факторов транскрипции, формируя комплекс, который затем взаимодействует с РНК-полимеразой. В конце инициации образуется открытый комплекс, после чего начинается элонгация. Сразу после образования 5׳-конца мРНК происходит кэпирование – первый этап посттранскрипционной модификации (процессинга). Кэпирование состоит в присоединении к 5׳-концу синтезирующейся мРНК 7-метилгуанозина (шапочки). Кэп защищает 5׳-конец мРНК от действия нуклеаз. Транскрипция многих генов белков эукариот заканчивается далеко за сайтом, в котором происходит расщепление РНК с образованием 3׳-конца мРНК. Терминация осуществляется во множественных сайтах последовательности ДНК протяженностью в сотни, а иногда и тысячи пар нуклеотидов. Некоторые гены белков эукариот, напротив имеют четко определенные сигналы терминации транскрипции. Такие последовательности богаты остатками Т и А. Одна из них – последовательность ААТААА, находящаяся на 10-30 нуклеотидов левее сайта расщепления-полиаденилирования (ЦА). 3׳-конец РНК отщепляется ферментами в указанной точке, затем происходит полиаденилирование этого конца молекулы РНК. Поли (А)-хвост есть практически у всех мРНК, за исключением транскриптов гистоновых генов. В отсутствии поли (А)-хвоста РНК-транскрипты быстро деградируют под действием ферментов. Полиаденилирование является вторым этапом процессинга мРНК. После полиаденилирования образуется предшественник зрелой мРНК - гетерогенная ядерная РНК (гяРНК), которая содержит в своем составе последовательности интронов. Третьим этапом созревания мРНК является сплайсинг – процесс вырезания интронов и сшивание экзонов. Сплайсинг Сплайсинг – процесс вырезания интронов и сшивание экзонов. Существует несколько механизмов сплайсинга: аутосплайсинг, собственно сплайсинг и альтернативный сплайсинг. Аутосплайсинг осущестляется без участия каких-либо белков. Аутосплайсинг выявлен для генов рРНК у примитивных эукариот (Tetrahymena), мРНК и тРНК митохондрий и хлоропластов. Интрон содержится в 26S рРНК тетрахимены. Вырезание данного интрона и сшивание экзонов осуществляется в присутствии ионов магния и свободного гуанозина. Аутосплайсинг катализируется гуанозином, гидроксильная группа которого атакует фосфатную группу на 5׳-конце интрона, в результате чего разрывается фосфодиэфирная связь и высвобождается 3׳-конец экзона 1. Затем гидроксильная группа, содержащаяся на 3׳-конце экзона 1, атакует фосфатную группу на 3׳-конце интрона, что ведет к вычленению интрона и замыканию фосфодиэфирной связи между ОН-группой 3׳-конца экзона 1 и 5׳-фосфатной группой экзона 2. Таким образом, в результате реакции трансэтерификации без дополнительных затрат энергии осуществляется лигирование двух экзонов с образование зрелой рРНК. В состав вышепленного интрона входит последовательность из 19 нуклеотидов, которая представляет собой РНК-фермент (рибозим). Т.о. интрон обладает ферментативной активностью, необходимой для вырезания себя самого. Данный рибозим узнает последовательности ЦУЦУ в составе атакуемого субстрата. В настоящее время осуществляется искусственный синтез специально сконструированных рибозимов, способных расщеплять РНК вируса ВИЧ 1, что открывает возможности создания антивирусных преператов пренципиально нового типа. Собственно сплайсинг характерен для пре-мРНК высших эукариот. Интроны в незрелых предшественниках ядерных мРНК могут достигать большой длины и их удаление требует более сложного механизма. В сплайсинге пре-мРНК у высших эукариот задействован ряд белков, а также РНК особого вида – малые ядерные РНК (мяРНК). мяРНК богаты урацилом, поэтому они обозначаются как U1, U2, U3, U4, U5, U6 и т.д. Гены мяРНК транскрибируются РНК-полимеразой II и имеют различную локализацию в геноме: часть из них представляет собой независимые гены, не имеющие интронов, другая часть располагается внутри интронов генов, кодирующих белки (чаще рибосомальных). мяРНК присутствуют в ядрах в комплексах с белками, получившими название малые рибонуклеопротеиновые частицы (мяРНП). Комплекс мяРНК и мяРНП носит название сплайсингосомы. Сплайсингосома собирается на интроне перед его вышеплением. Различные мяРНК по принципу комплементарности связываются с пограничными участками интронов в РНК. Для этого взаимодействия существенны короткие последовательности, находящиеся на концах интронов. На 5׳-конце находится последовательность ГУ, на 3׳-конце – АГ. Взаимодействие мяРНК и мяРНП с концами интрона придает ему петлеобразную структуру. При этом сближаются концы экзонов, чему способствует образование неканонических водородных связей между двуми гуанинами, на 5׳- и 3׳-сайтах сплайсинга. Сближение экзонов создает условия для реакций трансэтерификации. В результате в интроне образуется структура типа «лассо» и он вышепляется с соединением экзонов. Альтернативный сплайсинг. Несколько экзонов, содержащихся в составе мРНК, могут сшиваться в разных комбинациях с образованием различных мРНК. У эукариот альтернативный сплайсинг мРНК, содержащих большое количество интронов, является эффективным способом регуляции активности генов, создает возможность для возникновения изоформ белков, наборы которых могут существенно различаться в различных клетках, тканях и органах многоклеточных организмов. Альтернативный сплайсинг позволяет организму синтезировать разные по структуре и свойствам белки на базе одного гена. Такие гены кодируют семейства родственных белков, участвующих в мышечных сокращениях, формировании цитоскелета, нервных волокон, молекул иммуноглобулинов, пептидных гормонов. В формировании альтернативных мРНК могут быть задействованы три основные механизма. Первый из них состоит в том, что для образования различных мРНК могут использоваться разные промоторы. В этом случае образуются транскрипты, имеющие по длине 5׳-концы и разное число экзонов. Такой механизм выявлен для пре-мРНК легкой цепи миозина позвоночных животных. Второй тип альтернативного сплайсинга имеет место при изменении сайта полиаденилирования. В этом случае изменяются размеры и структура 3׳-концевого участка пре-мРНК. Таким способом образуются два вида мРНК тяжелой цепи иммуноглобулинов. Третий тип альтернативного сплайсинга включает выбор различных экзонов из одинаковых пре-мРНК. При этом часть инторнов не включается в сплайсинг. Таким образом происходит сплайсинг пре-мРНК тропонина Т скелетных мышц млекопитающих, содержащий 18 экзонов. Выбор экзонов зависит от стадии развития организма: экзон 16 присутсвует в мРНК тропонина Т у взрослых, экзон 17 – у эмбрионов. Одной из причин возникновения альтернативных продуктов могут служить мутации, нарушающие последовательности сайтов сплайсинга и возникновение новых сайтов. Такой механизм выявлен у больных талассемией (у больных резко падает содержание гемоглобина). Т.о. подобные мутации могут стимулировать образование новых белков, а альтернативный сплайсинг может играть решающую роль в эволюции высших организмов. Процесс созревания РНК кроме кэпирования, полиаденилирования и сплайсинга может включать еще ряд модификаций первичной структуры, называемых редактированием РНК (эдитинг). К этим реакциям относятся модификации азотистых оснований (дезаминирование, метилирование, и др.), в результате которых образуются необычные для РНК основания (инозин, тимин, дегидроурацил). К редактированию относятся вставки и делеции нуклеотидов внутрь цепи РНК. В результате трансляции таких «отредактированных» РНК в клетке могут синтезироваться белки, аминокислотная последовательность которых будет не вполне соответствовать нуклеотидной последовательности ДНК матрицы (гена). Транскрипция генов класса I К генам класса I относятся гены рРНК. У большинства эукариот в состав рибосом входят 18S рРНК, 28S рРНК, 5,8S рРНК, 5S рРНК. Все эти рРНК, кроме 5S рРНК транскрибируются РНК-полимеразой I. Число генов, кодирующих рРНК, колеблется от сотен до нескольких тысяч в зависимости от вида эукариот. На долю генов класса I приходится половина общей транскрипционной активности в большинстве клеток эукариот. Гены рРНК находятся в одной или нескольких хромосомах (у человека около 200 генов рРНК, расположенных в 13, 14, 15, 21 и 22 хромосомах). В этих хромосомах расположены области с характерной морфологией, названные ядрышковыми организаторами, в которых и располагаются гены рРНК. Гены рРНК практически всех эукариот построены в виде длинных повторов типа «голова к хвосту». Как правило, кодирующие области генов 18S, 5,8S, и 28S рРНК сгруппированы в указанном порядке в одну транскрипционную единицу (кластер). Каждый кластер имеет длину от 7 до 14 т.н.п. (в зависимости от вида) и отделен от других кластеров межгенным спейсером, длина которого у разных видов значительно различается, но в пределах одного вида относительно постоянна. Единица трнскрипции начинается от области межгенного спейсера на 5׳-конце и заканчивается в разных сайтах межгенного спейсера за областью, кодирующей 28S рРНК. Кодирующие области генов рРНК у разных видов являются консервативными, а длина и нуклеотидные последовательности межгенных спейсеров сильно различаются от вида к виду. После завершения транскрипции происходит созревание про-рРНК (процессинг). Для рРНК он заключается в нарезании первичного транскрипта эндонуклеазами, и вышеплении зрелых рРНК при участии мяРНК (они взаимодействуют с пограничными участками спейсерных последовательностей в молекуле – предшественнике рРНК). Кроме того, происходит сплайсинг интрона в последовательности 28S рРНК. Сигналы инициации транскрипции генов рРНК видоспецифичны (т.е. свои для каждого вида). У млекопитающих обнаружено две последовательности, предположительно выполняющие функцию промотора. С этими последовательностями связываются соответствующие регуляторные белки, которые облегчают связывание РНК-полимеразы. Терминация транскрипции генов рРНК осуществляется в сайте, расположенном примерно на 200 н.п. (и более) левее последовательности 28S рРНК, находящейся на 3׳-конце кластера. Выявлены специфические последовательности, служащие сигналом к окончанию транскрипции. Они несколько отличаются у разных видов. У человека предположительно такая поледовательность выглядит следующим образом: 5׳-ГГГТТГАССА-3׳. Есть данные, что терминация в указанном сайте происходит при связывании белковых факторов транскрипции. Транскрипция генов класса III. Гены разных тРНК (в эукариотических клетках насчитывается 40 – 60 основных типов тРНК) также часто сгруппированы в кластеры, расположенные в разных хромосомах. У человека на гаплоидный геном приходится 1300 генов тРНК (по 10 – 20 копий для каждой тРНК). Характер организации генов тРНК в составе блоков сильно варьирует у разных организмов. Расположение генов тРНК в кластерах не столь регулярно, как в случае рибосомных генов: направление транскрипции близлежащих генов бывает противоположным, а гены могут быть разделены промежутками, включающими 100 - 150, а иногда и несколько тысяч нуклеотидных пар. Природа и функции участков ДНК, разделяющих гены тРНК, не выяснены. Промотор гена тРНК располагается внутри кодирующей последовательности и имеет два района (А- и В-боксы), необходимые для правильной и эффективной транскрипции. А-бокс локализован в области от +10 до +20 н.п., а В-бокс – между парами оснований +50 и +65. Канонические последовательности А- и В-боксов имеют вид: 5׳-ТГГЦNNАГТГГ-3׳ и 5׳-ГГТЦСГАNNЦ-3׳ (N – любой нуклеотид). Расстояние между А- и В-боксами составляет 50 н.п. В транскрипции генов тРНК участвуют факторы TFIIIA, TFIIIB, TFIIIC и т.д. В генах тРНК многих организмов имеется один интрон размером от 14 до 60 н.п. (в зависимости от вида тРНК). Он всегда локализуется в одном и том же месте у разных тРНК: через один нуклеотид от 3׳-конца антикодона. Единый транскрипт подвергается процессингу: нарезается эндонуклеазами и подравнивается экзонуклеазами. Интрон вышепляется при сплайсинге. Для терминации используются специальные последовательности на 3׳-конце, содержащие остатки тимина. |