1. Классификация и систематика микроорганизмов
 Скачать 158 Kb.
|
|
12. Отличительные черты строения Грамм + и Грамм – бактерий.Окраска по Грамму Грамм +(фиолетовые) Грамм- (красные) толщина 20-60мм 10-20мм липиды 1-1,6% 2-2,6% Пептидогликан 40-90% 5-10% Тейхоева кислота + - У грамположительных бактерий муреиновый слой состав- ляет 80% от массы клеточной стенки. По Грамму, они окрашива- ются в синий цвет. У грамположительных бактерий муреиновый слой составляет 20% от массы клеточной стенки, по Грамму, они окрашиваются в красный цвет. У грамположительных бактерий наружный слой клеточной стенки содержит липопротеиды, гликопротеиды, тейхоевые кис- лоты, у них отсутствует липополисахаридный слой. Клеточная стенка выглядит аморфной, она не структурирована. Поэтому при разрушении муреинового каркаса бактерии полностью теряют клеточную стенку (становятся протопластами), не способны к размножению. У грамотрицательных бактерий наружный пластический слой четко выражен, содержит липопротеиды, липополисахарид- ный слой, состоящий из липида А (эндотоксина) и полисахарида (О-антигена). При разрушении грамотрицательных бактерий об- разуются сферопласты — бактерии с частично сохраненной кле- точной стенкой, не способные к размножению. Окраска по Грамму: На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снять, а краситель слить. Нанести раствор Люголя на 1-2 мин. Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя. Промыть водой. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать. Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный. 13. Строение и способы изучения актиномицетов Актиномицеты (myces - гриб, actis - луч) относят к группе грамположительных неспорообразующих бактерий неправильной формы. К этой же группе относят нокардиоформные актиномицеты (нокардии). Отдельные виды рода Actinomyces (A. israelii, A. naeslundii, A. bovis и др.) являются представителями нормальной микрофлоры организма человека или животных, которые в определенных условиях вызывают актиномикозы. Морфология и физиология Тонкие прямые или слегка изогнутые палочки и нити с настоящим ветвлением. Короткие палочки часто с булавовидными концами, напоминающие коринебактерии. Типичны разветвленные палочки с ветвящимися нитями на концах. Грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, некислотоустойчивые. Конидий не образуют в отличие от грибов. Факультативные анаэробы, нуждаются в дополнительном снабжении СО2 Хемоорганотрофы с бродильным типом метаболизма. При сбраживании углеводов образуют кислоту. На плотных средах через 24 ч формируют характерные для отдельных видов микроколонии, а через 7-14 дней - макроколонии. Ферментируют глюкозу с образованием кислоты, обладают слабой протеолитической активностью. 14. Морфология грибов:классификация, строение, методы изучения Грибы (Fungi, Mycetes) — разнородная группа эукариотических микроорганизмов. Грибы имеют ядро с ядерной оболочкой, ци¬топлазму с органеллами, цитоплазматическую мембрану (кото¬рая содержит фосфолипиды и стеролы) и мощную клеточную стенку, состоящую из глюкана, целлюлозы, хитина, белка, ли-пидов и др. Грибы состоят из длинных тонких нитей (гиф), спле¬тающихся в грибницу, или мицелий. Гифы низших грибов — фикомицетов — не имеют перегородок. У высших грибов — эуми-цетов — гифы разделены перегородками; их мицелий многокле¬точный. Грибы размножаются спорами половым и бесполым спосо¬бами, а также вегетативным путем (почкование или фрагмента¬ция гиф). Грибы, размножающиеся половым и бесполым путем, относятся к совершенным. Несовершенными называют грибы, у которых отсутствует или еще не описан половой путь размно¬жения. Бесполое размножение осуществляется у грибов с помо¬щью эндогенных спор, созревающих внутри круглой структуры — спорангия и экзогенных спор — конидий, форми¬рующихся на кончиках плодоносящих гиф Грибы можно разделить на 7 классов: хитридиомицеты, гифохитридиомицеты, оомицеты, зигомицеты, ас-комицеты, базидиомицеты, дейтеромицеты. Среди фикомицетов различают: хитридиомицеты, или водные грибы, ведущие сапрофитический образ жизни или поражающие водо¬росли; гифохитридиомицеты, имеющие сходство с хитридиомицетами и оомицетами; оомицеты — паразиты высших растений и водяные плесени; зигомицеты включают представителей рода Mucor, распространенных в почве и воздухе и способных (на¬пример, грибы рода Mucor) вызывать мукоромикоз легких, го¬ловного мозга и других органов. При бесполом размножении на плодоносящей гифе-спорангиеносце образуется спорангий — ша¬ровидное утолщение с оболочкой, содержащее многочисленные споры (спорангиоспоры). Половое размножение (оогамия) у зи-гомицетов осуществляются путем образования зигоспор, или ооспор. 15 Морфология спирохет и методы их изучения Спирохеты(лат spirochaeta - бактерия в виде изогнутого длинного винта).Они имеют штопорообразную извитую форму. Размеры их колеблются в больших пределах(ширина-0,3-1,5 мкм и длина 7-500 мкм) Тело спирохет состоит из осевой нити и цитоплазмы, спирально завитой вокруг нити. Спирохеты имеют трехслойную наружную мембрану. При электронной микроскопии у них выявлена нежная цитоплазматическая мембрана, в которой заключается цитоплазма. Спор, капсул и жгутиков не образуют. У некоторых видов в электронном микроскопе найдены на концах очень тонкие нитевидные образования-фибриллы. Спирохеты обладают активной подвижностью вследствие выраженной гибкости тела. У спирохет различают вращательное, поступательное, волнообразное, сгибательное движение. По Романовскому-Гимзе одни виды окрашиваются в синий, другие – в сине-фиолетовый, третьи – в розовый цвет. Хорошим методом обработки спирохет является серебрение. Тинкториальные свойства используют для дифференциации сапрофитов и патогенных спирохет. (далее можно не писать,но на всякий случай написала) В порядок Spirocheatales, семейство Spirochaetaceae входят сапрофиты и патогенные виды. К сапрофитам относятся spirochaeta и cristispira, представляющие собой крупные клетки размером 200-500 мкм,некоторые имеют крипты(волнистые гребни),концы их заостренены или тупые,они обитают на мертвых субстратах в загрузненных водоемах,в кишечнике(по Романовскому-гимзе окрашиваются в синий) 16 Морфология риккетсий, способы изучения. Риккетсии(Rickettsia) включены в порядок Rickettsiales; представляют собой полиморфные микроорганизмы, живут и размножаются только в клетках(цитоплазме и ядре) тканей животных, человека и переносчиков. Кокковидные формы имеют вид очень мелких, гомогенных или однозернистых овоидов диаметром около 0,5 мкм; довольно часто образуют диплоформы. Палочковидные формы риккетсий – короткие образования диаметром 1-1,5 мкм с зернами на концах или длинные и обычно изогнутые тонкие палочки длиной 3-4 мкм. Нитевидные(мицеллярные) формы имеют размер 10-40 мкм и более; иногда это изогнутые и многозернистые нити. Риккетсии не образуют спор и капсул; они подвижны, хорошо окрашиваются по Романовскому-Гимзе, Цилю-Нильсену, грамотрицательны. Электронной микроскопией и цитохимическими исследованиями у риккетсий установлено наличие внутренней(6нм) и наружной оболочки, выполняющей функции стенки и состоящей из трех слоев. В цитоплазме риккетсий обнаружены гранулы типа рибосом величиной 20-70 нм и вакуолеобразные структуры 6-8 нм в диаметре. Риккетсии размножаются путем деления кокковидных и палочковидных форм с образованием гомогенных популяций соответствующего типа, а также в результате дробления нитевидных форм с последующим развитием кокковидных и палочковидных образований. Большая часть риккетсий относится к безвредным микроорганизмам. Около 50 различных видов риккетсий найдено в кишечнике и слюнных железах тлей, клопов, клещей. Патогенные риккетсии из семейства Rickettsiaceae поражают различные виды животных и человека; заболевания, вызываемые риккетсиями, носят название риккетсиозов. 17 Общая характеристика простейших, способы их изучения. Простейшие –одноклеточные организмы, тело которых состоит из цитоплазмы и одного или нескольких ядер. Клетка простейшего – это самостоятельная особь, проявляющая все основные свойства живой материи. Она выполняет функции всего организма, тогда как клетки многоклеточных составляют лишь часть организма, каждая клетка зависит от многих других. Большинство представителей класса имеет микроскопические размеры – 3—150 мкм. Только наиболее крупные представители вида (раковинные корненожки) достигают 2–3 см в диаметре. Среда их обитания – вода, почва, организм хозяина (для паразитических форм). Строение тела простейшего типично для эукариотической клетки. Имеются органеллы общего (митохондрии, рибосомы, клеточный центр, ЭПС и др.) и специального назначения. К последним относятся органы движения: ложноножки, или псевдоподии (временные выросты цитоплазмы), жгутики, реснички, пищеварительные и сократительные вакуоли. Органоиды пищеварения – пищеварительные вакуоли с пищеварительными ферментами. Питание происходит путем пино– или фагоцитоза. Непереваренные остатки выбрасываются наружу. Некоторые простейшие имеют хлоропласты и питаются за счет фотосинтеза. Пресноводные простейшие имеют органы осморегуляции – сократительные вакуоли, которые периодически выделяют во внешнюю среду излишки жидкости и продукты диссимиляции. Большинство простейших имеет одно ядро, но есть представители с несколькими ядрами. Ядра некоторых простейших характеризуются полиплоидностью. Цитоплазма неоднородна. Она подразделяется на более светлый и гомогенный наружный слой, или эктоплазму, и зернистый внутренний слой, или эндоплазму. Наружные покровы представлены либо цитоплазматической мембраной (у амебы), либо пелликулой (у эвглены). Систематика простейших основана на способах движения, размножения и циклах развития. Тип Protozoa подразделяется на 4 класса: жгутиковые, саркодовые, споровики, ресничные(инфузории). Простейшие размножаются простым и множественным делением, половым путем, а также сложным способом - половым и бесполым( плазмодии малярии). Амебы, лямблии и балантидии могут образовывать цисты как более устойчивые формы существования особей. К патогенным простейшим относятся возбудители лейшманиоза, трипаносомоза, трихомониаза, лямблиоза, амебиаза, малярии, токсоплазмоза, балантидиаза. Во внешней среде патогенные простейшие быстро отмирают. Цисты энтамеб, лямблий и балантидий длительно сохраняются, не теряя своих биологических свойств. Простейшие окрашиваются по Романовскому-Гимзе(ядро-красного, цитоплазма- синего цвета). За последние годы широкое применение в изучении простейших нашли методы электронной микроскопии, цитохимии, ультрафиолетовой микроскопии. 18 Способы питания бактерий. В зависимости от источников углерода для питания бактерии делятся на: 1)аутотрофы, использующие для построения своих клеток диоксид углерода и другие неорганические соединения 2)гетеротрофы, питающиеся за счет готовых органических соединений. Гетеротрофы, утилизирующие органические остатки отмерших организмов в окружающей среде, называются сапрофитами. Гетеротрофы, вызывающие заболевания у человека или животного, относят к патогенным и условно-патогенным. Среди патогенных микроорганизмов встречаются облигатные(способны существовать только внутри клетки)и факультативные паразиты. В зависимости от окисляемого субстрата(донор электронов или водорода) делятся на: 1)литотрофы – микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода неорганические соединения 2)органотрофы – микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода органические соединения Учитывая источник энергии различают: 1)фототрофы- используют энергию света 2)хемотрофы- источником энергии служат химические вещества 19 Механизм поступления питательных веществ в бактериальную клетку. Поступление различных веществ в бактериальную клетку зависит от величины и растворимости их молекул в липидах или воде, рН среды, концентрации веществ, различных факторов проницаемости мембран. Основным регулятором поступления веществ в клетку является цитоплазматическая мембрана. Выделяют следующие механизмы: 1)простая диффузия – по градиенту концентрации, без затраты энергии, не имеет субстратной специфичности 2)облегченная диффузия – по градиенту концентрации, без затраты энергии, субстратноспецифическая, осуществляется при помощи специальных белков-переносчиков(пермеаз) 3)активный транспорт – против градиента концентрации, энергозатратная(за счет АТФ), субстратоспецифичная(специально связывающие белки в комплексе с премеазами), вещества поступают в клетку в химически неизмененной форме 4)транслокация – против градиента концентрации, с помощью фософтрансферазной системы, энергозатратная, вещества поступают в клетку в фосфолированном виде 20 Питательные среды: классификация, назначение; требования, предъявляемые к ним. Питательной средой в микробиологии называют среды, содер жащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Требования: прозрачность, стерильность, содержание пит веществ, доступность. Классификация: 1)по происхождению -естественные (молоко, желатин, картофель и др.); - искусственные (пептона, аминопептида, дрожжевого экстракта и т. п.); - полусинтетические (МПА и МПБ) 2) по консистенции -плотные(МПА, агар-агар, кровяной агар) -жидкие(МПБ) -полужидкие( 0,5% МПА) 3)по назначению -транспортные(общего назначения)- для культивирования большинства бактерий -специальные Элективные- лучше растет определенный вид микроорганизмов(висмутсульфидный агар) Среды обогощения- стимулирует рост одного микроорганизма и ингубирует другого микроорганизма дифференциально-диагностические- для изучения и идентификации отдельных групп бактерий, для определения протолитической активности, подвижности. Могут содержать определенные соединения- углевод ,спирты и т.д(желточно-щелочной агар для культивирования стрептококков, солевой для стефалококков) 21 Культуральные особенности микроорганизмов. Рост на плотных и в жидких питательных средах. Культивирование, то есть выращивание микроорганизмов в ла боратории, применяется для изучения их свойств и для получения био массы. Культуральные свойства данного вида микроорганизмов - это: 1) условия, необходимые для размножения 2) характер роста на пита тельных средах. Культуральные свойства - это одна из характеристик, которые учитываются при идентификации (определения вида) микро организмов. Размножение бактерий в жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный(в виде пленки) рост культуры. Подразделяют на несколько фаз: 1)лаг-фаза(период между посевом и началом размножения, продолжительность 4-5ч,при этом бактерии увеличиваются в размерах и готовятся к делению, нарастает количество нуклеиновых кислот, белка и др.компонентов. 2)фаза логарифмического роста(период интенсивного деления бактерий, продолжительность около 5-6ч) 3)фаза стационарного роста(количество жизнеспособных клеток остается без изменений составляя максимальный уровень) 4)фаза гибели(отмирание бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий) Размножение бактерий на плотной питательной среде:такие бактерии образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или шероховатыми краями(S- и R-формы), различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образуют, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Пигментообразующие виды микробов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др. 22. Дыхание микроорганизмов. Особенности энергетического обмена у аэробов и анаэробов. Путем дыхания микроорганизмы добывают энергию. Дыхание – биологический процесс переноса электронов через дыхательную цепь от донора к акцепторам с образованием АТФ. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, выделяют аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электрона является молекулярный кислород, при анаэробном связанный кислород (-NO3, -SO4, -SO3). Все бактерии по типы дыхания подразделяются на аэробы и анаэробы. Облигатные аэробы развиваются при наличии в атмосфере 20% кислорода, распространены на поверхности жидкой и плотной питательной среды (бруцеллы, микрококки, микобактерии). Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации свободного кислорода. Для создания этих условий в газовую смесь для культивирования обычно добавляют углекислый газ до 10% концентрации (актиномицеты, лептоспиры.) Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них есть микроорганизмы толерантные к относительно высоким концентрациям кислорода (аэротолерантные), а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях переключаться с анаэробного на аэробное дыхание (большинство патогенных и сапрофитных микробов). Строгие анаэробы размножаются только в анаэробных условиях, т.е. при очень низких концентрациях кислорода, который для них очень губителен (клостридии ботулизма, столбняка). Аэробное дыхание энергетически более эффективно, т.к. синтезируют большее количество АТФ. В процессе аэробного дыхания образуются образуются токсичные продукты окисления - перекиси водорода, супероксид-анион кислорода, от которых бактерии защищаются специальными ферментами (каталаза, пероксидаза, супероксиддисмутаза). У анаэробов эти ферменты отсутствуют. 23. Методы культивирования анаэробов. Для культивирования анаэробных микроорганизмов необходимо создание бескислородных условий, достигаемое различными методами. Физические методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах — анаэростатах. Иногда воздух в них заменяют каким-либо другим газом, например СО2. Химические методы заключаются в том, что при культивировании исследуемого материала на плотных средах в эксикатор помещают химические вещества, например пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода. В жидкие питательные среды можно добавлять различные редуцирующие вещества: аскорбиновую или тиогликолевую кислоту. Биологический метод основан на одновременном культивировании аэробов и анаэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закупоренных. (использование специальных питательных сред). Вначале кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, а затем начинается рост анаэробов, посев которых сделан на другой половине. Сахарный агар Среда Вильсон-Блэра Среда Китта -Тароци Метод Фортнера 24. Понятие о чистой культуре. Выделение чистых культур аэробных бактерий. Чистой культурой называется популяция бактерий од ного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты — биовары. Биовары, различающие ся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по анти генным свойствам — сероварами, по чувствительности к фагу — фаговарами. Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо сим волами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактерио логических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами. ^ Колония представляет собой видимое изолированное скоп ление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей мор фологии, цвету и другим признакам. 1 этап исследования - в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Изучают внешний вид, консистенцию, цвет, запах и другие признаки, готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. 2 этап исследования - на поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуется сплошной, густой налет или изолированные колонии. Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара. Обращают внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки. При потребности исследуют колонии под лупой, малым или большим увеличением микроскопа. В случае необходимости изготовляется мазок, окрашивается, исследуется под микроскопом, а микроорганизмы засеваются петлей на поверхность плотной питательной среды для получения изолированных колоний. На третий день (3 этап исследования) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию. Сначала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, крася его по методу Грама, с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размеров и тинкториальных (способность краситься) свойств, делают вывод, что культура чиста. 25. Понятие о чистой культуре. Выделение чистых культур анаэробных бактерий. Чистой культурой называется популяция бактерий од ного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты — биовары. Биовары, различающие ся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по анти генным свойствам — сероварами, по чувствительности к фагу — фаговарами. Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо сим волами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактерио логических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами. ^ Колония представляет собой видимое изолированное скоп ление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей мор фологии, цвету и другим признакам. Схема выделения чистой культуры облигатных анаэробов. Взятие исследуемого материала осуществляется шприцем с притертым поршнем, после чего материал вносят в пробирку с транспортной средой. Выделение чистой культуры проводится со строгим соблюдением анаэробных условий на всех этапах исследования. 1-й этап – получение изолированных колоний. Готовят ряд разведений исследуемого материала и делают посев на чашки Петри со средой КАБ или другой питательной средой для культивирования анаэробов. Посевы инкубируют в микроанаэростатах. заполненных газовой смесью, при температуре 37С в течение 48-72 часов. 2-й этап - получение чистой культуры анаэробов. На этом этапе: 1.Изучают морфологические и культуральные свойства выросших колоний. 2. Проводят параллельный рассев каждой отобранной колонии на две чашки Петри с питательной средой, например КАБ. Одну чашку инкубируют в аэробных условиях, другую - в анаэробных условиях. Для дальнейшего исследования отбирают культуры, выросшие только в анаэробных условиях (так исключают факультативные анаэробы). 3-й этап - идентификация выделенных облигатных анаэробов. Проводят биохимическую идентификацию в микротест-системе. 26. Рост и размножение бактерий. Фазы развития популяции. Рост – координированное воспроизведение клеточных компонентов и структур, ведущий в конечном итоге к увеличению массы клетки. Размножение – увеличение числа клеток в популяции. Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты,как и грибы, размножаются спорами. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные – путем перетяжки, в результате образования гантелевидных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки. Делению клетки предшествует репликация бактериальной хромосомы. Она происходит в три этапа: инициация, элонгация и терминация. Размножение бактерий в питательных средах. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз: Лаг- фаза – период между посевом и началом размножения. (4-5 часов). Бактерии при этом увеличиваются в размерах и готовятся к делению, нарастает количество нуклеиновых кислот, белка и других компонентов. Фаза логарифмического(экспоненциального) роста – период интенсивного деления бактерий. (5-6 часов) Бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, НК и др. Фаза стационарного роста- количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальных уровень. (М-концентрация) Фаза гибели - отмирание бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. 27. Бактериологический метод исследования, его этапы. Бактериологический метод исследования является важнейшим в практической деятельности любой микробиологической лаборатории. От правильного его выполнения зависит определение этиологического фактора, который вызывал заболевание, и, соответственно, выбор тактики лечения инфекционного больного. Важность этого метода объясняется тем, что во многих случаях врачи имеют дело с микробными ассоциациями, тогда необходимо устанавливать роль каждого из микробов в возникновении болезни. Потому перед освоением основных принципов и методов выделения чистых культур необходимо овладеть техникой посевов и пересеваний бактерий в жидких и на плотные питательные среды. Бактериологическое исследование подразумевает получение чистой культуры возбудителя и установление его принадлежности к виду, роду и т. д. Данный метод включает в себя определенные этапы. Вначале выделяется чистая культура возбудителя с помощью посева на плотные питательные среды. Выбор питательной среды зависит от свойств предполагаемого возбудителя. На следующем этапе осуществляют исследование полученных колоний бактерий макроскопическим и микроскопическим методами. Затем из небольших фрагментов каждой из образовавшихся колоний готовят мазки, которые окрашивают по Грамму. Далее исследуют их под микроскопом, определяя свойства, присущие выделенной культуре, и проверяют ее чистоту. Оставшуюся часть колонии переносят в специальные пробирки со скошенным агаром (плотной питательной средой) для накопления чистой культуры с целью последующего полного изучения данной колонии. Все пробирки с агаром ставят на 18—24 ч в термостат. На 2-м этапе бактериологического исследования зачастую учитывают количество образовавшихся колоний микроорганизмов. Это имеет огромное значение при наличии у пациента заболеваний, вызываемых условно-патогенной микрофлорой. На З-м этапе бактериологического исследования проводятся идентификация выделенной чистой культуры возбудителя и установление степени его чувствительности к антибиотикам и прочим химиотерапевтическим лекарственным препаратам. Идентификацию культуры осуществляют по морфологическим, биохимическим, тинкториальным, антигенным, культуральным и токсикогенным свойствам: 28. Ферменты бактерий, их классификация. Значение ферментов в идентификации бактерий. Ферменты распознают соответствующие метаболиты (субстраты), вступают с ними во взаимодействие и ускоряют химические реакции. Являются белками, участвуют в процессах анаболизма (синтеза) и катаболизма (распада), то есть метаболизма. По локализации: Экзоферменты – выделяются во внешнюю среду и действуют на субстрат вне клетки (протеазы) Эндоферменты – действуют на субстрат внутри клетки (ферменты, расщепляющие аминокислоты, моносахара) Различают конститутивные и индуцибельные ферменты. Конститутивные ферменты синтезируются клеткой непрерывно, вне зависимости от наличия субстратов в питательной среде. Индуцибельные (адаптивные) ферменты синтезируются только при наличии в среде субстрата данного фермента. Например, кишечная палочка на среде с глюкозой практически не образует Р-галактозидазу, но резко увеличивает ее синтез при выращивании на среде с лактозой или другим Р-галактозидом. Известно более 2000 ферментов. Они объединены в шесть классов: оксидоредуктазы окислительно-восстановительные ферменты (к ним относятся дегидрогеназы, оксидазы и др.); трансферазы, переносящие отдельные радикалы и атомы от одних соединений к другим; гидролазы, ускоряющие реакции гидролиза, то есть расщепления веществ на более простые с присоединением молекул воды (эстеразы, фосфатазы, глюкозидазы и др.); лиазы, отщепляющие от субстратов химические группы негидролитическим путем (карбоксилазы и др.); изомеразы, превращающие органические соединения в их изомеры (фосфогексоизомераза и др.); лигазы, или синтетазы, ускоряющие синтез сложных соединений из более простых (аспарагинсинтетаза, глютаминсинтетаза и др.). Различия в ферментном составе используются для идентификации микроорганизмов, так как они определяют их различные биохимические свойства: сахаролитические (расщепление сахаров), протеолитические (разложение белков) и другие, выявляемые по конечным продуктам расщепления (образование щелочей, кислот, сероводорода, аммиака и др.). 29. Сахаролитическая активность микроорганизмов – это способность бактерий с помощью ферментов разлагать сахара до более простых соединений – кислоты, газа, альдегидов. Эти вещества можно обнаружить в питательной среде с помощью специальных химических веществ – индикаторов. Для определения сахаролитических ферментов исследуемую культуру засевают на среды Гисса. «Пёстрый ряд» Гисса (короткая схема) содержит 5 пробирок с жидкими средами: к пептонной воде добавляют последовательно глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу и сахарозу и индикатор Андреде в каждую пробирку. Цвет сред до посева – жёлтый. Исследуемую культуру засевают в среды Гисса и культивируют при 37° 18 – 24 часа. Под действием сахаролитических ферментов бактерий углеводы расщепляются с образованием кислоты и газа. Наличие кислоты определяют по покраснению среды – в кислой среде индикатор Андреде меняет цвет с жёлтого на ярко - розовый. Выделение газа можно определить визуально по образованию пузырьков или более точно – с помощью поплавков, погружённых в среду перед посевом. При отсутствии у бактерий сахаролитических ферментов к данному углеводу рост бактерий выражается в помутнении среды без изменения цвета. Наличие кислоты в среде в схеме бактериологического исследования обозначается «К», наличие газа – «Г». 30.Протеолитическая активность микроорганизмов – это способность бактерий с помощью протеолитических ферментов расщеплять молекулы белка до аминокислот и простых веществ – сероводорода, индола и др. Для обнаружения протеолитических ферментов исследуемую культуру засевают на мясо – пептонный бульон или пептонную воду. Под пробки пробирок вводят индикаторные бумажки, пропитанные реактивными растворами. Если бактерии разлагают белок с образованием сероводорода, то реактивная бумажка окрашивается в чёрный цвет. Некоторые бактерии разлагают белок с накоплением в окружающей среде индола. В этом случае индикаторная бумажка окрашивается в малиновый цвет. Присутствие продуктов распада белка в пробирке - сероводорода и индола - свидетельствует о протеолитической активности бактерий и обозначается на схеме H2S (+) и индол (+) соответственно. III. Протеалитическую активность бактерий можно изучать на желатиновой среде. При посеве на желатин бактерии с сильной протеолитической активностью разжижают его. Форма разжижения желатина характерна для некоторых видов бактерий и используется как видовой признак в лабораторной диагностике инфекций. 31. Белковый обмен у бактерий: - процесс синтеза собственных аминокислот и белков путем ассимиляции необходимых компонентов из внешней среды; - внеклеточное расщепление белков под воздействием различных ферментов. Если расщепление белков происходит в анаэробных условиях, то процесс называется гниением. Если в аэробных условиях — тлением. При наличии у бактерий протеаз белки расщепляются ими до промежуточных продуктов распада — пептонов. При наличии пептидаз пептоны расщепляются ими до аминокислот и продуктов их распада (аммиака, сероводорода, индола). Протеолитические (способность расщеплять белки) и пептоли-тические (способность расщеплять пептоны) свойства выражены далеко не у всех бактерий, поэтому их изучение в совокупности с другими ферментативными свойствами помогает идентифицировать бактерии. Ионный обмен: Для роста и размножения бактерий необходимы неорганические ионы. Одни из них, например ионы аммония, могут использоваться бактериями в качестве единственного источника азота. Ионы К+ бактерии используют для биосинтеза белка, поскольку они необходимы для связывания тРНК с рибосомами, образования комплекса иРНК с рибосомами и поддержания функциональной активности рибосом и структуры полисом. Поступление ионов К+ в бактерии, например в клетки Е. coli, зави¬сит от функционирования специфических транспортных белков. Одни из этих белков осуществляют непосредственное проникновение в клетку, а другие способствуют внутриклеточному удержанию этих ионов. Благодаря высокой внутриклеточной концентрации ионов К+ бактерии поддерживают высокое внутриклеточное давление. Потребность бактерий в ионах Mg2+ определяется их способностью быть кофактором многих ферментов. Ионы магния важны для стабилизации ряда ферментативных ансамблей, например РНК-поли- меразы, а также рибосом. Железо выполняет в бактериях роль кофа¬ктора для ряда ферментативных процессов, входит в состав цитохромов и других гемопротеидов. 32. В углеводном обмене у бактерий катаболизм преобладает над анаболизмом. Сложные углеводы внешней среды могут расщеплять только те бактерии, которые выделяют ферменты – полисахаридазы. Полисахариды расщепляются до дисахаров, которые под действием олигосахаридаз распадаются до моносахаров, причем внутрь клетки может поступать только глюкоза. Часть ее идет на синтез собственных полисахаридов в клетке, другая часть подвергается дальнейшему расщеплению, который может идти по двум путям: по пути анаэробного распада углеводов – брожению (гликолизу) и в аэробных условиях – по пути горения. В зависимости от конечных продуктов выделяют следующие виды брожения: 1) спиртовое (характерно для грибов); 2) пропионионово-кислое (характерно для клостридий, пропиони-бактерий); 3) молочнокислое (характерно для стрептококков); 4) маслянокислое (характерно для сарцин); 5) бутилденгликолевое (характерно для бацилл). Наряду с основным анаэробным распадом (гликолизом) могут быть вспомогательные пути расщепления углеводов (пентозофосфатный, кетодезоксифосфоглюконатный и др.). Они отличаются ключевыми продуктами и реакциями. Липидный обмен осуществляется с помощью ферментов – липопротеиназ, летициназ, липаз, фосфолипаз. Липазы катализируют распад нейтральных жирных кислот, т. е. ответственны за отщепление этих кислот от глицерина. При распаде жирных кислот клетка запасает энергию. Конечным продуктом распада является ацетил-КоА. Биосинтез липидов осуществляется за счет ацетилпереносящих белков. При этом ацетильный остаток переходит на глицерофосфат с образованием фосфатидных кислот, а они уже вступают в химические реакции с образованием сложных эфиров со спиртами. Эти превращения лежат в основе синтеза фосфолипидов. Бактерии способны синтезировать как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты, но синтез последних более характерен для аэробов, так как требует кислорода. Углеводный обмен у бактерий также носит двоякий характер — это процесс синтеза и распада углеводов. Расщепление углеводов бактериями (сахаролитические свойства) в аэробных условиях с образованием углекислого газа и воды называется горением, а расщепление ими углеводов в анаэробных условиях — брожением. В зависимости от характера конечных продуктов разложения углеводов в анаэробных условиях различаютброжение: • спиртовое;• молочнокислое;• пропионовокислое;• муравьинокислое;• маслянокислое; • уксуснокислое. Молекулярный кислород в процессах брожения не участвует. Большинство бактерий, осуществляющих брожение, — облигатные анаэробы. Однако некоторые из них — факультативные анаэробы — способны осуществлять процесс брожения в присутствии кислорода, но без его участия. Более того, кислород подавляет процесс брожения, и оно сменяется горением (дыханием — конечный акцептор водорода — кислород). Этот эффект был назван эффектом Пастера и является одним из классических примеров смены метаболизма у бактерий в зависимости от условий среды. 33. Размеры вирусов колеблются от 20 до 300 нм. В среднем они в 50 раз меньше бактерий. Их нельзя увидеть в световой микроскоп, так как их длины меньше длины световой волны. Вирусы состоят яз различных компонентов: а) сердцевина - генетический материал (ДНК или РНК). Генетический аппарат вируса несет информацию о нескольких типах белков, которые необходимы для образования нового вируса: ген, кодирующий обратную транскриптазу и другие. б) белковая оболочка, которую называют каспидом. Оболочка часто построена из идентичных повторяющихся субъединиц - капсомеров. Капсомеры образуют структуры с высокой степенью симметрии. в) дополнительная липопротеидная оболочка. Она образована из плазматической мембраны клетки-хозяина. Она встречается только у сравнительно больших вирусов (грипп, герпес). Полностью сформированная инфекционная частица называется вирионом. Классификация а) Вирусы классифицируются по сердцевине: ДНК-содержащие и РНК-содержащие (ретро) вирусы. б) По структуре капсомеров. Изометрические (кубические), спиральные, смешанные. в) По наличию или отсутствию дополнительной липопротеидной оболочки г) По клеткам-хозяинам Кроме этих классификаций есть еще много других. На пример, по типу переноса инфекции от одного организма к другому. Вирусы обладают следующими свойствами. 1. Это мельчайшие живые организмы. 2. Они не имеют клеточного строения. 3. Вирусы способны воспроизводиться, лишь проникнув в живую клетку. Следовательно, все они — облигатные эндопаразиты. Иными словами, вирусы могут жить, лишь паразитируя внутри других клеток. Большинство из них вызывает болезни. 4. Вирусы устроены очень просто. Они состоят из небольшой молекулы нуклеиновой кислоты, либо ДНК, либо РНК, окруженной белковой или липопротеиновой оболочкой. 5. Они находятся на границе живого и неживого. 6. Каждый тип вируса способен распознавать и инфицировать лишь определенные типы клеток. Иными словами, вирусы высокоспецифичны в отношении своих хозяев. |