1. Классификация и систематика микроорганизмов
 Скачать 158 Kb.
|
|
1.Классификация и систематика микроорганизмов. 1.Микробы - это мельчайшие, преимущественно одноклеточные живые организмы, видимые только в микроскоп. Размер микроорганизмов измеряется в микрометрах — мкм (1/1000 мм) и нанометрах — нм (1/1000 мкм). Микробы характеризуются огромным разнообразием видов, отличающихся строением, свойствами, способностью существовать в различных условиях среды. Они могут быть одноклеточными, многоклеточными и неклеточными. Микробы подразделяют на бактерии, вирусы и фаги, грибы, дрожжи. Отдельно выделяют разновидности бактерий — риккетсии, микоплазмы, особую группу составляют простейшие (протозои). БАКТЕРИИ.Различают три основные формы бактерий — шаровидные (кокки), палочковидные (бациллы и др.), извитые (вибрионы, спирохеты, спириллы) Шаровидные бактерии (кокки) имеют обычно форму шара, но могут быть немного овальной или бобовидной формы. Кокки могут располагаться поодиночке (микрококки); попарно (диплококки); в виде цепочек (стрептококки) или виноградных гроздьев (стафилококки), пакетом (сарцины). Палочковидные бактерии самые распространенные. Палочки могут быть одиночными, соединяться попарно (диплобактерии) или в цепочки (стрептобактерии) Извитые бактерии могут быть в виде запятой — вибрионы, с несколькими завитками — спириллы, в виде тонкой извитой палочки — спирохеты. К вибрионам относится возбудитель холеры, а возбудитель сифилиса — спирохета. Микоплазмы - бактерии, лишенные клеточной стенки, нуждающиеся для своего развития в ростовых факторах, содержащихся в дрожжах. ВИРУСЫ.Вирусы бактерий называют бактериофагами, вирусы грибов - микофагами и т. п. Бактериофаги встречаются повсюду, где есть микроорганизмы. Фаги вызывают гибель микробной клетки и могут использоваться для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний. Грибы являются особыми растительными организмами, которые не имеют хлорофилла и не синтезируют органические вещества, а нуждаются в готовых органических веществах. Дрожжи — одноклеточные неподвижные микроорганизмы размером не более 10-15 мкм. Форма клетки дрожжей бывает чаще круглой или овальной, реже палочковидной, серповидной или похожей на лимон 2. Устройство микроскопа, иммерсионная система. УСТРОЙСТВО МИКРОСКОПА.Оптическая система микроскопа состоит из основных элементов — объектива и окуляра. Они закреплены в подвижном тубусе, расположенном на металлическом основании, на котором имеется предметный столик. Увеличение оптического микроскопа без дополнительных линз между объективом и окуляром равно произведению их увеличений[4]. В современном микроскопе практически всегда есть осветительная система (в частности, конденсор с ирисовой диафрагмой), макро- и микро- винты для настройки резкости, система управления положением конденсора. В зависимости от назначения, в специализированных микроскопах могут быть использованы дополнительные устройства и системы. Иммерсия (иммерсионный метод микроскопического наблюдения) в оптической микроскопии — это введение между объективом микроскопа и рассматриваемым предметом жидкостидля усиления яркости и расширения пределов увеличения изображения. Иммерсионная система — оптическая система, в которой пространство между первой линзой и предметом заполнено жидкостью. Применяемая таким образом жидкость называется иммерсионной. 3.Методы микроскопии: люминесцентная, темнопольная, фазово-контрастная, электронная. Люминесцентная микроскопия — один из современных методов исследования, применяемый в нормальной и патологической гистологии. Основными преимуществами Люминесцентной микроскопии являются высокая чувствительность (чувствительнее обычных цито- и гистохим. методов не менее чем в 1000 раз), легкость количественного измерения содержания различных хим. компонентов ткани и клеток, доступность аппаратуры. Для Л. м. органов и тканей используют первичную и вторичную люминесценцию. Темнопо́льная микроскопи́я — вид оптической микроскопии, в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом. При использовании метода темного поля регистрируются даже незначительные различия в преломляющей способности участков препарата[1]. Основы метода разработаны Р. Зигмонди в 1906 году. Фазово-контрастная микроскопия — метод получения изображений в оптических микроскопах, при котором сдвиг фаз электромагнитной волнытрансформируется в контраст интенсивности. Фазовоконтрастную микроскопию открыл Фриц Цернике, за что получил Нобелевскую премию за 1953 год. Электронная микроскопия.В электронной микроскопии для построения изображения вместо световых лучей используется пучок электронов. Это позволяет увеличить разрешающую способность электронного микроскопа по сравнению со световым в сотни раз. Первый работоспособный прототип электронного микроскопа был построен в 1932 году Э. Руска и М. Кнолль; 4.Этапы приготовления микропрепаратов из культур м/о. Способы окраски. 1)обезжиривание предметного стекла(мыло) 2)прокалить бактериальную петлю и нанести на стекло 2-3 капли физ.р-ра 3)прокалить бактериальную петлю,обжечь край пробирки с культурой микроба,взять касательным движением петли микроорганизм из питательной среды 4)внести микроб в физ.р-р и равномерно распределить в нем. 5)высушить мазок на воздухе. 6)зафиксировать мазок на огне или в смеси Никифорова. Окраска по Грамму: На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снять, а краситель слить. Нанести раствор Люголя на 1-2 мин. Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя. Промыть водой. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать. Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный. Окраска цитоплазмы по методу Нейссера 1.Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислой синей 1мин,затем сливают краску 2.промывают водой и наливают раствор Люголя на 20-30сек 3.не промывая водой окрашиваем везувином 1-3мин 4. промывают водой,высушивают и микроскопируют. Тела бактерий окрашиваются в желтый цвет, зерна волютина –темно-синий (черный) цвет. Обнаружение капсулы по методу Бурри-Гинса 1. На середину предметного стекла наносят каплю черной туши и смешивают ее с каплей культуры капсульных бактерий с помощью петли 2. Краем другого предметного стекла делают мазок по типу кровяного. Мазок сушат на воздухе и фиксируют в пламени горелки 3. Окрашивают 5 мин карболовым фуксином,разведенным водой 1:3 4. Промывают водой, высушивают Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном фоне препарата. Окраска спор по методу Циля-Нильсена: 1. Фиксированный мазок покрывают плоской фильтровальной бумагой и наливают на нее карболовый фуксин Циля. Мазок подогревают на горелке до появления паров, затем отводят для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревают повторно 2-3раза 2. Препарат обесцвечивают путем погружения или нанесения на него 5%- раствора сернокислого спирта и промывают несколько раз водой 3. Окрашивают препарат метиленовым синим 3-5мин, промывают водой и высушивают Споры окрашиваются в красный цвет, а палочки в голубой Обнаружение жгутиков окраска по Морозову Многократное эмпригнирование нитратом серебра.Жгутики утолщаются в виде коричневых нитей. Производится электронное микроскопирование. 5.Морфология бактерий. Химический состав микробной клетки. .Бактерии—одноклеточные микроорганизмы. Они имеют разнообразную форму и довольно сложную структуру, определяющую многообразие их функциональной деятельности. Для бактерий характерны четыре основные формы: сферическая (шаровидная), цилиндрическая (палочковидная), извитая и нитевидная (рис. 11). Бактерии шаровидной формы —кокки—в зависимости от плоскости деления и расположения отдельных особей подразделяются на микрококки (отдельно лежащие кокки), диплококки (парные кокки), стрептококки (цепочки кокков), стафилококки (имеющие вид виноградных гроздьев), тетракокки (образования из четырех кокков) и сарцины (пакеты из 8 или 16 кокков). Палочковидные бактерии располагаются в виде одиночных клеток, дипло- или стрептобактерий. Извитые формы бактерий—вибрионы и спириллы, а также спирохеты. Вибрионы имеют вид слегка изогнутых палочек, спириллы — извитую форму с несколькими спиральными завитками. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ.Вода. Основная составная часть бактериальной клетки, приходящаяся нга воду, — 75—85 %, сухое вещество составляет 15—25 %. Часть воды находится в свободном состоянии, а часть — в связанном. В процентном отно шении к сухому веществу бактерии содержат: углерода — 45—55, азота — 8—15, кислорода — 30, водорода-—6—8. Соот ветственно дрожжи содержат: углерода — 49, азота— 12, кис лорода—-.31, водорода — 6%. В микроскопических грибах, углерода — 47, азота — 5, кислорода — 40, водорода — 6%. Минеральные вещества. Кроме органогенов в микробных клетках находятся так называемые зольные элементы — минеральные вещества, составляющие от 3 до 10 % сухого вещества микроорганизмов. Белки — это высокомолекулярные азотсодержащие орга нические соединения, молекулы которых построены из ами нокислотных остатков, соединенных между собой ковалент-ными пептидными связями. Углеводы. В бактериях их содержится 12—18% от сухого вещества. Это многоатомные спирты (сорбит, маннит, дуль-цит); полисахариды (гексозы, пентозы, гликоген, декстрин); моносахариды (глюкоза, глюкуроновая кислота и др.). Угле воды выполняют энергетическую роль в микробной клетке. Липиды и липоиды. Липиды—истинные жиры, липоиды — жироподобные вещества. 6. Строение бактериальной клетки. Отличия прокариот от эукариот. Структурные компоненты бактериальной клетки делят на основные и временные. Основными структурами явля ются: клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и различными вклю чениями, нуклеоид; временными — капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на опре деленных этапах жизненного цикла бактерий, у некоторых видов они отсутствуют полностью. Отличия по строению клетки 1) У прокариот нет ядра, а у эукариот есть. 2) У прокариот из органоидов имеются только рибосомы (мелкие, 70S), а у эукариот, кроме рибосом (крупных, 80S), имеется множество других органоидов: митохондрии, ЭПС, клеточный центр, и т.д. 3) Клетка прокариот гораздо меньше клетки эукариот: по диаметру в 10 раз, по объему – в 1000 раз. Отличия по наследственной информации 1) У прокариот ДНК кольцевая, а у эукариот линейная 2) У прокариот ДНК голая, почти не соединена с белками, а у эукариот ДНК соединена с белками в соотношении 50/50, образуется хромосома 3) У прокариот ДНК лежит в специальной области цитоплазмы, которая называется нуклеоид, а у эукариот ДНК лежит в ядре. 7. Оболочка бактерий: ее биологическая роль, строение, способ выявления. Оболочка бактерий, или клеточная стенка, обусловливает относительное постоянство форм бактерий (палочки, кокки, извитые формы). Во время движения бактерии нередко наблюдается изгибание ее тела, что возможно только при наличии клеточной стенки (оболочки). Последняя становится хорошо заметной, если бактериальную клетку поместить в концентрированный раствор сахара или поваренной соли. С потерей воды вследствие разницы осмотического давления в клетке и окружающей среде более упругая по сравнению с цитоплазмой оболочка отделяется от нее и становится видимой. У некоторых бактерий можно обнаружить двойные контуры оболочки. Оболочка очень тонка — 10—20 нм (100—200 ?А) — и бесцветна: чтобы обнаружить ее под микроскопом, прибегают к предварительной химической обработке и окрашиванию. В электронном микроскопе оболочка отчетливо выступает и легко отличима от наружного слоя цитоплазмы. Поры клеточной оболочки очень малы (у некоторых бактерий диаметр равен приблизительно 1 нм) и заполнены водой. Оболочка обладает большой прочностью, упругостью, эластичностью, может выдерживать очень большое давление. Будучи для бактерий защитой от неблагоприятных внешних воздействий, оболочка принимает участие и в обмене веществ клетки: здесь наиболее интенсивно происходит синтез полисахаридов. Она является частью живого вещества бактериальной клетки и неразрывно с ним связана (М. А. Пешков). Химический состав бактериальной оболочки неоднороден. В него входят полисахариды, липоиды, аминокислоты и др. Некоторые бактерии, например ауксотрофные, нуждаются для синтеза своей клеточной оболочки в диаминопимелиновой кислоте (ДПК), которая обязательно должна быть в питательных веществах. Если ДПК в питательной среде нет, то бактерии хотя и растут, но клеточная оболочка не образуется. При добавлении к питательной среде ДПК эти бактерии приобретают свою естественную (исходную) форму. 8.Цитоплазма бактерий и включения. Способ окраски цитоплазмы и зерен волютина Цитоплазма –это сложная коллоидная система состоящая из растворимых белков, рибонуклеиновых кислот, включений, и многочисленных мелких гранул-рибосом. Ответственных за синтез (трансляцию)белков. Бактериальная цитоплазма неподвижна,имеет высокую плотность, содержит мелкие зерна представляющие собой рибонуклеопротеиды, получившие название рибосом. Из нескольких рибосом образуются полисомы.В цитоплазме кроме нуклеоида,содержатся цитоплазматические генетические структуры в виде небольших молекул ДНК (плазмиды), Которые детерминируют синтез различных веществ. В цитоплазме находятся включения:гранулы волютина,липопротеидные тельца, гликоген,гранулеза,пигментные скопления,сера,кальций. Гранул волютина окрашиваются более интенсивно,чем цитоплазма клетки и содержат метафосфаты. Окраска цитоплазмы по методу Нейссера 1.Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислой синей 1мин,затем сливают краску 2.промывают водой и наливают раствор Люголя на 20-30сек 3.не промывая водой окрашиваем везувином 1-3мин 4. промывают водой,высушивают и микроскопируют. Тела бактерий окрашиваются в желтый цвет, зерна волютина –темно-синий (черный) цвет. 9.Капсула бактерий,ее биологическая роль,способ обнаружения Капсула-образуется у патогенных бактерий,когда они находятся в живых организмах или в специальных питательных средах Биологическая роль 1. Предохраняют поверхность бакьериальной клетки от повреждения,высыхания 2. Она препятствует фагоцитозу бактерии 3. Капсула антигена: антитела против капсулы вызывают ее увеличение (реакция набухания капсулы) 4. Капсула создает дополнительный осмотический барьер и является источником резервных веществ Обнаружение капсулы по методу Бурри-Гинса 5. На середину предметного стекла наносят каплю черной туши и смешивают ее с каплей культуры капсульных бактерий с помощью петли 6. Краем другого предметного стекла делают мазок по типу кровяного. Мазок сушат на воздухе и фиксируют в пламени горелки 7. Окрашивают 5 мин карболовым фуксином,разведенным водой 1:3 8. Промывают водой, высушивают Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном фоне препарата. 10.Спорообразование у микробов. Биологическая роль. Способ окраски спор Споры-Палочковидные бактерии обладают способностью к спорообразованию, которое заключается в том, что при наступлении условий неблагоприятных для жизни, клетка частично теряет воду, объем и форму, под внешней мембраной образуется плотная сферическая оболочка. Споруляция бактерий 1. Подготовительная стадия споруляции сопровождается прекращением деления и увеличением количества липидных включений. 2. Стадия предспоры споруляции обычно начинается бурно. В клетке появляется эллиптическая оболочка, окружающая участок цитоплазмы с изменёнными плотностью и тинкториальными свойствами. Подобное образование обозначают терминами «предспора», или «примордиальная спора». 3. Третья стадия споруляции включает появление оболочки (обычно в течение 10 мин после образования предспоры) и ещё большее увеличение коэффициента светопреломления. 4. Стадия созревания споры сопровождается её уплотнением и снижением метаболической активности клетки. Время образования споры-18-20часов Споры могут располагаться центрально, субтерминально или терминально Окраска спор по методу Циля-Нильсена: 4. Фиксированный мазок покрывают плоской фильтровальной бумагой и наливают на нее карболовый фуксин Циля. Мазок подогревают на горелке до появления паров, затем отводят для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревают повторно 2-3раза 5. Препарат обесцвечивают путем погружения или нанесения на него 5%- раствора сернокислого спирта и промывают несколько раз водой 6. Окрашивают препарат метиленовым синим 3-5мин, промывают водой и высушивают Споры окрашиваются в красный цвет, а палочки в голубой 11.Жгутики бактерий, их обнаружение. Жгутик-это поверхностная структура присутствующая у многих прокариотический клеток и служащая для их движения в жидкой среде или по поверхности твердых сред. По характеру движения подвижные бактерии разделяют на плавающие и скользящие(ползающие). Орган движения плавающих бактерий — жгутики; подвижность скользящих бактерий обеспечивают волнообразные сокращения тела. По расположению жгутиков подвижные микробы подразделяются на: Монотрихи Лофотрихи Амфитрихи Перитрихи Жгутики состоят их трех субструктур: Филамент (фибрилла, пропеллер) — полая белковая нить толщиной 10—20 нм и длиной 3—15 мкм, состоящая из флагеллина, субъединицы которого уложены по спирали. Полость внутри используется при синтезе жгутика — он происходит в направлении от ЦПМ. По полости к собираемому в настоящий момент участку переносятся субъединицы флагеллина. Крюк — более толстое, чем филамент (20—45 нм), белковое (не флагеллиновое) образование. Базальное тело (трансмембранный мотор) Обнаружение жгутиков окраска по Морозову Многократное эмпригнирование нитратом серебра.Жгутики утолщаются в виде коричневых нитей. Производится электронное микроскопирование. Обнаружение подвижности: 1. Препарат раздавленная капля 2. Препарат висячая капля 3. При посеве в столбик полужидкого агара.Подвижность микробы дают дифференцированный рост, а неподвижные рост по ходу укола. Пили, фимбрии или ворсинки — поверхностные структуры, присутствующие у многих бактериальных клеток и представляющие собой прямые белковые цилиндры длиной 1—1,5 мкм и диаметром 7—10 нм. Различаются по строению и назначению, причём у одной бактерии могут присутствовать несколько их типов. Во многих случаях функции пилей не до конца установлены, но всегда они так или иначе участвуют в прикреплении бактериальной клетки к субстрату. Пили I порядка обуславливают прикрепление (адгезию) микроорганизма к опред. Организма хозяина Пили II порядка ( конъюгативные , половые) участвуют в переносе генетического материала от донора клетки к реципиентной. Таких пилей от 1-4 на клетку. |