Серологические
реакции
ОПРЕДЕЛЕНИЕ Серологические реакции – это реакции взаимодействия между антигеном и соответствующим ему специфическим антителом in vitro, имеющие различные внешние проявления. Широко используются в микробиологических и серологических лабораториях с целью: - серодиагностики бактериальных, вирусных, реже других инфекционных заболеваний,
- сероидентификации выделенных бактериальных, вирусных и других культур различных микроорганизмов
Применение СР - Для серологической диагностики:
- обнаружение неизвестных антител с помощью известного антигена – диагностикума
- обнаружение неизвестных антигенов с помощью известных антител.
- Для серологической идентификации возбудителя – определение серогруппы, серовара возбудителя с помощью специфической иммунной диагностической сыворотки
Фазы СР - Специфическая (невидимая, быстрая, обратимая) – результат взаимодействия антигена и антитела за счет водородных, кулоновских и вандерваальсовых сил.
- Неспецифическая (видимая, медленная, необратимая) – появление видимых изменений: агглютинации, гемолиза и т.д.
Параметры СР - Чувствительность реакции указывает на концентрацию антител или антигенов, которая определяется с помощью данной реакции.
- Специфичность - способность антигенов или антител реагировать только с гомологичными антителами, содержащимися в сыворотке крови, либо с гомологичными антигенами соответственно.
Классификация серологических реакций
Серологические реакции
Двухкомпонентные
Простые
РА
РП
РНА
РКоА
Латекс-агглютинация
Сложные
РН
РТГА
РНГА
РОНГА
РИФ прямая
Многокомпонентные
Сложные
РИФ непрямая
РИА
РЭМА
РСК
ИФА
Реакции агглютинации и преципитации - Наиболее полно механизм соединения антигена и антитела объяснен гипотезой Маррека (теория "решетки") и Полинга (теория "фермы") .
- Маррек рассматривает соединение антигена и антител в виде решетки, в которой антиген чередуется с антителом, образуя решетчатые конгломераты.
- Согласно гипотизе Полинга антитела имеют две валентности (две специфические детерминанты), а антиген несколько валентностей - он поливалентен. При соединении антигена и антител образуются агломераты, напоминающие "фермы" построек.
Реакции агглютинации и преципитации - При оптимальном соотношении антигена и антител образуются большие прочные комплексы, видимые простым глазом.
- При избытке антигена каждый активный центр антител заполнен молекулой антигена, не хватает антител для соединения с другими молекулами антигена и образуются мелкие, невидимые глазом комплексы.
- При избытке антител, для образования решетки не хватает антигена, детерминанты антител отсутствуют и видимого проявления реакции нет.
Реакция агглютинации Метод обнаружения корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов) путем их склеивания антителами с образованием аггломератов – хлопьев, в присутствии электролита NaCl.
РА используют для:
Реакция агглютинации (РА) Компоненты реакции: - Антиген – крупный, корпускулярный, целая клетка (бактерия или эритроцит)
- Антитело – IgM (валентность 5)
- Физраствор
- Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие O- антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.
- Агглютинация с Н - диагностикумом (бактерии, убитые формалином,сохранившие жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.
Способы постановки: РА на стекле; развернутая РА
РА на стекле - используется в основном для серотипирования выделенной чистой культуры возбудителя, реже для ускоренного обнаружения антител Постановка реакции: - На предметное стекло помещают каплю сыворотки (Опыт) и каплю физраствора (Контроль)
- В каждой капле распределяют взвесь бактерий
- Появление мелкозернистой или хлопьевидной агглютинации – положительный результат
- Равномерное помутнение – отрицательный результат
Опыт «+» Контроль «-»
Развернутая РА - используется в основном для обнаружения антител в сыворотке больного Постановка реакции: - Развернутую РА проводят в пробирках или лунках пластин.
- При этом готовят десятикратные разведения исследуемой сыворотки и вносят одинаковые количества антигена.
- При положительном результате на дне пробирки образуется рыхлый осадок и сам раствор становится прозрачным,
- отрицательный результат- помутнение раствора сохраняется
«+» «-»
| |
Реакция агглютинации
|
Реакция преципитации
|
Механизм
|
Теория решетки Марека-Полинга
| |
Антиген
|
Крупный, корпускулярный, целая клетка
|
Мелкодисперсный, растворимый
|
Антитела
|
IgM
|
IgG
| Реакции непрямой агглютинации - Метод обнаружения антигенов и антител, который основан на способности корпускулярных носителей( эритроцитов, шариков латекса, клеток стафилококков) адсорбировать на своей поверхности растворимые антигены. - В зависимости от типа корпускулярного носителя различают: - РНГА
- Латекс-агглютинация
- РКоА
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) Компоненты реакции: 1. Эритроцитарный диагностикум них антигенами) 2. Исследуемая сыворотка 3. Физраствор РНГА ставят в пластиковых планшетках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.
Титр сыворотки= 1:160 (максимальное разведение исследуемого материала, при котором реакция положительна)
Реакция обратной непрямой гемагглютинации (РОНГА) - Компоненты реакции:
1. Эритроцитарный антительный диагностикум них антителами 2. Исследуемый материал 3. Физраствор - Постановка РОНГА не отличается от РНГА
- Применение: обнаружение аг (например, бактериального экзотоксина)
Латекс-агглютинация Вариант РНА, в которой частицы латекса с адсорбированными на них молекулами антигенов или антител агглютинируются соответствующими антигенами или антителами. Применяют качественный и количественный методы. Ставят по типу агглютинации на стекле.
антитело
Латексные частицы, покрытые антигенами
Реакция коагглютинации
Реакцию коагглютинации применяют для определения антигенов с помощью антител, адсорбированных на белке А клеток стафилококка (антительный диагностикум).
| |
Антительный диагностикум
| | | | |
Белок А имеет сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии, обработанные иммунной диагностической сывороткой неспецифически адсорбируют антитела сыворотки, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.
| |
Реакция коагглютинации
| | | | | Реакция преципитации - Реакция преципитации - РП (от лат praecipilo осаждать) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом.
Компоненты реакции: - Антиген – мелкодисперсный, растворимый
- Антитело – IgG (валентность 2)
- Физраствор
- Преципитат образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
- Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.
- Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиапьная иммунодиффузия, иммуноэпектрофорез и др.
Реакция кольцепреципитации - Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген.
- При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата.
- Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется реакцией-термопреципитации (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).
Опыт Контроль
Реакция микропреципитации Двойная диффузия в геле по Оухтерлони - Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки.
- В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу.
- В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы.
Двойная радиальная иммунодиффузия представляет собой прежде всего метод количественного анализа. Ее применяют для определения количества антигена в жидкостях (сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, экстракты тканей). Ее также применяют для проверки чистоты препаратов, при получении антисывороток животных и оценке эффективности иммунизации.
- У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных АГ линии преципитата сливаются; у неидентичных АГ - пересекаются.
Радиальная иммунодиффузия по Манчини - Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло.
- После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях.
- Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок.
- Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена.
- Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.
Зависимость диаметра кольца преципитации от количества аг
Иммуноэлектрофорез - Иммуноэлектрофоретический анализ представляет собой сочетание электрофореза в агаровом геле с иммунодиффузией.
- Принцип ИЭФ состоит в следующем:
- Вначале проводят электрофоретическое разделение белков в забуференном геле агара;
- после разделения в канавку, которая идет в направлении миграции белков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку.
- АГ и АС диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации, число, положение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов.
Реакция нейтрализации токсина Тип иммунологической реакции, основанный на способности специфических антител – антитоксинов подавлять биологическую активность экзотоксинов бактерий при образовании комплекса аг-ат.
РОНГА, РНАт
Контрольная группа (Вводят исслед.материал
Исслед.материал+ ат против токсина А
Исслед.материал+ ат против токсина В
Исслед.материал+ ат против токсина Е
Проба Шика проводится для оценки состояния антитоксического иммунитета;
внутрикожно вводят минимальное количество токсина:
- При наличии антител против дифтерийного токсина видимых изменений не будет
- При отсутствии антитоксического имммунитета наблюдается воспалительная реакция
- Реакция флоккуляции основана на способности токсина или анатоксина при смешивании в определенныхсоотношениях с антитоксической сывороткой образовывать помутнение- инициальную флоккуляцию
- Механизм реакции флоккуляции аналогичен таковому реакции преципитации.
- Применяется для титрования антитоксических сывороток и определения типа токсина
- Специфическую активность или силу анатоксина определяют в реакции флоккуляции в так называемых единицах флоккуляции— (Lf) .
- Силу антитоксической сыворотки выражают в международных антитоксических единицах – МЕ
- Одна антигенная единица анатоксина обозначается Limes flocculationis (Lf — порог флоккуляции), это то количество анатоксина, которое вступает в реакцию флоккуляции с одной единицей антитоксина.
- То есть, условие инициальной флоккуляции: nLF=n МЕ
Реакция нейтрализации токсина in vitro
Реакция флоккуляции
- В данном опыте помутнение – инициальная флоккуляция – происходит в пробирке №3
- Каждая пробирка содержит 2х20=40Lf токсина
- Поскольку условие инициальной флоккуляции: nLF=n МЕ, то в данной пробирке 40 МЕ сыворотки
- Если 0,4 мл сыворотки содержат 40МЕ, то 1мл- 100МЕ
- Штаммы возбудителя дифтерии — С. diphtheriae могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными.
- Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина.
- При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность — продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре
- Главное преимущество – отсутствие необходимости выделения чистой культуры
Реакция нейтрализации токсина in vitro
Реакция преципитации в геле
Реакция нейтрализации токсина in vitro. РНГА - Учет результатов РНГА, поставленной с целью обнаружения ботулотоксина.
- Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е.
- Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками.
- Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е.
- Контролем служит нормальная сыворотка.
Учет.
- В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (зонтик), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.
Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.
Реакция нейтрализации токсина in vitro. РОНГА, РНАТ - РОНГА - применяют антительный эритроцитарный диагностикум - эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Антиген –дифтерийный токсин
«+» «-»
Реакция нейтрализации токсина in vitro. РОНГА, РНАТ - РНАТ позволяет быстро выявить неизвестный антиген.
- Компоненты реакции:
- Эритроцитарный диагностикум с дифтерийным анатоксином
- Стандартная противодифтерийная сыворотка (антитела против дифтерийного токсина)
- Исследуемая сыворотка ?
Принцип метода - Результаты:
- При отсутствии антигена в исследуемой сыворотке
диагностикум взаимодействует со стандартной сывороткой и наблюдаем гемагглютинацию - При наличии антигена в исследуемой сыворотке антитела в нашей диагностической сыворотке будут нейтрализованы и агглютинации эритроцитов не будет
+
?
(
)
+
«-» «+»
Реакции с участием комплемента - Сущность этих реакций состоит в том, что при взаимодействии специфических антител с антигенами клеток (эритроцитов, бактерий), на их поверхности образуется комплекс антиген-антитело, который активирует комплемент по классическому пути, вследствие чего наступает лизис этих клеток.
- Нативная сыворотка обладает бактерицидной активностью,
- В иммунной сыворотке в присутствии специфических антител-бактериолизинов и комплемента лизис бактерий идет существенно интенсивнее
- Под воздействием бактериолизинов в присутствии комплемента микробы теряют подвижность, меняют форму (набухают), распадаются и, наконец, совсем растворяются.
- Реакция бактериолиза применяется с целью идентификации холерных вибрионов (р. иммобилизации вибрионов холерными сыворотками) и определения вибриолизинов в сыворотке; при сифилисе (р. иммобилизации трепонем), при лептоспирозе (р. агглютинации-лизиса).
Реакция иммунного гемолиза - Как видно из результатов опыта, гемолиз происходит только в присутствии аг (эритроциты барана), соответствующих антител и комплемента
- В отсутствии одного из ингредиентов гемолиза не наблюдается
- РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген - антитело.
- Первая система – специфическая :антиген, антитело (испытуемая сыворотка) и комплемент (сыворотка морских свинок)
- Вторая система – неспецифическая индикаторная – гемолитическая (эритроциты барана с гемолитической сывороткой, лишенной собственной активности комплемента).
- PCK проводят в две фазы 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним.
- При соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), таким образом происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная)
- Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).
-
+
РСК. Титрование комплемента В приведенном примере титр комплемента в разведении 1:10 равен 0,15 мл. В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это - рабочая доза. В приведенном примере она равна 0,2 мл комплемента в разведении 1:10.
Для приготовления гемолитической системы смешивают равные объемы гемолитической сыворотки и взвеси эритроцитов.
Так как все компоненты, участвующие в РСК, должны быть взяты в равных объемах (в нашем примере он равен 0:5 мл), необходимо к рабочей дозе комплемента (0,2 мл 1:10) добавить 0,3 мл изотонического раствора
РСК. Основной опыт
1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 К1 К2 К3 К4
Специфическая система:
- Антитела (сыворотка в различных разведениях).
- Антиген - диагностикум
- Комплемент по 0,5 мл
Смешивают, инкубируют 60 минут при 37°С.
Индикаторная система Добавляют по 2 мл гемолитической системы (ГС)
Смешивают, инкубируют 30 минут при 37°С.
Учитывают результаты реакции.
К1 – контроль сыворотки (сыворотка + комплемент+ГС
К2 – контроль антигена (антиген+комплемент+ГС)
К3- контроль гемолитической системы (2мл ГС+физраствор)
К4 – контроль комплемента (2 мл ГС+ 0,5мл комплемента)
В нашем примере результат положительный.
Титр сыворотки 1:80
Микрореакция связывания комплемента (МРСК) - Пример МРСК с парными сыворотками
- В сыворотке, взятой через 5 дней после первого исследования титр выше, что свидетельствует о развитии иммунного ответа на данный антиген
Реакция радиального гемолиза (РРГ) - Реакцию радиального гемолиза (РРГ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент.
- После внесения в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них, в результате радиальной диффузии антител, образуется зона гемолиза.
- Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом.
- Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после чего к этому комплексу присоединяются компоненты комплемента, вызывая гемолиз
- Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - качественный метод выявления специфических Аг с помощью Ат, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
- Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.
- Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике.
- Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.
- Различают две разновидности метода: прямой, непрямой.
- Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.
- Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
АГС (антиглобулиновая
сыворотка)
Пневмококки
- Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом.
- Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают специфическими антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки.
- Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами.
- В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом.
- Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе..
Treponema pallidum
Иммуноферментный анализ (англ. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) - Лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело.
- Метод основан на использовании антител с использованием фермента в качестве метки.
С помощью ИФА определяют наличие антигенов возбудителей различных инфекций, но значительно чаще метод ИФА применяется для определения наличия антител классов IgA, IgM, IgG к антигенам различных возбудителей болезней.
Иммуноферментный анализ Прямой твердофазный ИФА
Результат ИФА.
Желтый цвет раствора в лунке является положительным результатом.
Фотография микропланшета
- При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом.
- После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат)
- Связанный с антителом фермент обнаруживают по изменению цвета раствора после добавления субстрата (перекись водорода) и хромогена
Иммуноферментный анализ Непрямой твердофазный ИФА - Этот вариант ИФА используют обычно для выявления специфических антител.
- В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген и инкубируют с образцами сыворотки или другого биологического материала, полученного от больного (спинномозговая жидкость, слюна и др.).
- Специфические антитела, связавшиеся с антигеном на твердой фазе, выявляют с помощью антиглобулинового конъюгата(антиглобулиновая сыворотка с ферментной меткой).
- В зависимости от цели анализа используют разные антиглобулиновые реагенты, выявляющие антитела всех изотипов, либо специфичные к отдельным классам и подклассам иммуноглобулинов.
- Основное достоинство метода состоит в универсальности конъюгата. Один и тот же коньюгат может служить для выявления антител человека к самым разным антигенам в любых образцах.
Иммуноферментный анализ Конкурентный ИФА - Этот вариант анализа основан на конкуренции меченых (конъюгат) и немеченых (исследуемых) антител за связывание с антигеном, адсорбированным на твердой фазе.
- Количество фермента, присоединившегося к твердой фазе, уменьшится пропорционально содержанию в смеси свободных антител.
- Для определения антигена используется тот же вариант, но в этом случае искомый антиген конкурирует с меченым, стандартным антигеном за связывание с антителами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы
Искомый антиген(1)
и меченый ферментом антиген(2)
конкурируют друг с другом за антитела (3), сорбированные на твердой фазе.
Иммуноферментный анализ Общая схема
Анализатор иммуноферментный
полуавтоматический
Иммуноферментный автоматический анализато
Радиоиммунологический анализ - Принцип. В основе РИА лежит феномен конкуренции: связывание антител с антигеном, меченным радиоактивным изотопом, подавляется в присутствии немеченного антигена. Методика РИАпроста и включает следующие основные этапы:
- А. К раствору антител добавляют меченный антиген и пробу (содержащую неизвестное количество немеченного антигена). Концентрацию антител в реакционной смеси подбирают так, чтобы число мест связывания было намного меньше общего числа антигенов. Концентрация меченного антигена должна превышать максимальную возможную концентрацию антигена в пробе.
- Б. Реакционную смесь инкубируют при определенной температуре. Меченный и немеченный антигены конкурентно связываются с антителами, при этом образуются иммунные комплексы, содержащие либо меченный, либо немеченный антиген. Таким образом, к концу инкубации в реакционной смеси присутствуют меченные и немеченные иммунные комплексы, а также свободные меченные и немеченные антигены. Количество меченных иммунных комплексов обратно пропорционально количеству немеченного антигена в пробе.
- В. Чтобы оценить количество меченных иммунных комплексов, их отделяют от свободного меченного антигена. Иммунные комплексы, имеющие большую молекулярную массу, чем свободные антигены, осаждают центрифугированием и измеряют радиоактивность осадка.
- Г. Определяют концентрацию антигена в пробе по калибровочной кривой.
Рис. 8. Радиоиммунологический анализ:1 - антиген; 2 - антитело; 3 - радиоактивная метка.
Радиоиммунологический анализ:
1 - антиген;
2 – стандартныйантиген с радиоактивной меткой;
3 - антитело.
РИА - один из самых чувствительных методов иммунодиагностики. Его применяют для выявления антигена вируса гепатита В , у больных вирусным гепатитом.
1
2
3
Иммуноблоттинг - Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле,
- затем переносят их (блоттинг - от англ, blot, пятно) из геля на активированную бумагу (1) или нитроцеллюлозную мембрану
- и проявляют с помощью ИФА.
- Фирмы выпускают такие полоски с "блотами" антигенов. На эти полоски (стрипы) наносят сыворотку больного (2). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом (3).
- Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата (4), изменяющего окраску под действием фермента.
Пример: Лайн-блот для диагностики TORCH-инфекций (Токсоплазмоз, Краснуха, Цитомегаловирус, ВПГ 1 и ВПГ 2)
Спасибо за внимание |
Скачать 6.6 Mb.