Бактериальные и вирусные препараты для профилактики, лечения и диагностики инфекционных заболеваний. Бактериальные и вирусные препараты для профилактики, лечения и д. Бактерийные и вирусные препараты для профилактики, лечения и диагностики инфекционных заболевании (учебнометодическая разработка для студентов) Москва 1981
 Скачать 217.5 Kb.
|
|
в пределах семейства, группы и рода. Поэтому в настоящее время большинство агглютинирующих сывороток выпускаются адсорбированными, монорецепторными и адсорбированными поливалентными, содержащими только типовые или видовые антитела и соответствующими или определенному типу или виду микроорганизма. Эти сыворотки не подлежат разведению. Для получения таких сывороток нрименяют метод Кастеллани — метод адсорбции, который состоит в том, что при насыщении агглютинирующей сыворотки родственными гетерогенными бактериями происходит адсорбция групповых антител, а специфические антитела остаются в сыворотке. В зависимости от полноты истощения групповых агглютининов можно получить монорецепторные сыворотки — сыворотки, имеющие антитела только к одному рецептору-антигену или адсорбированные, поливалентные, дающие реакции агглютинации с двумя — тремя родственными бактериями, имеющими общий антиген, в отношении которого проводилась адсорбция. Адсорбированные сыворотки применяют при идентификации выделенных возбудителей в реакции агглютинации на стекле (пластинчатый метод). Агглютинирующие сыворотки наиболее широко применяются при диагностике заболеваний, вызываемых бактериями семейства Enterobacteriaceae. Так, при идентификации эшерихий используются поливалентные и типовые ОК-сыворотки; при дифференциации сальмонелл — набор сывороток: агглютинирующая адсорбированная поливалентная сальмонеллез-ная О-сыворотка (групп А, В, С, Д, Е) — для определения принадлежности к роду Salmonella, при положительном результате — определяют отдельно с каждой сывороткой (входящей в смесь) серологическую группу и в заключение определяется серологический тип выделенного возбудителя с моно-рецепторными Н-сыворотками сальмонелл, входящих в данную группу. Преципитирующие сыворотки Преципитирующие сыворотки получают иммунизацией кроликов убитыми микроорганизмами, антигенами бактерий, экстрактами микробов и т. п. Иммунизация проводится длительно в течение нескольких месяцев по определенным схемам. По одной из схем иммунизацию начинают со 100 млн. бактериальных клеток в 1 мл, увеличивая дозу в 2 раза, заканчивая введением 10—20 млрд. в 1 мл, проводя 10—12 инъекций с интервалом в 4—6 дней. Титром преципитирующей сыворотки называется то максимальное разведение антигена, которое преципитируется цельной сывороткой. Сыворотки выпускают с титром не меньше 1 : 100 000. Это связано с тем, что антиген, определяемый в реакции преципитации, имеет микроскопическую величину и в единице объема его может содержаться больше, чем в таком же объеме антител. Специфические преципитирующие сыворотки применяются при диагностике инфекционных заболеваний (менингит, сибирская язва, чума, туляремия, полиомиелит и др.); в судебно-медицинской практике для определения видовой принадлежности белка крови; в санитарной практике для обнаружения соответствующих белковых веществ в продуктах (при подозрении на фальсификацию). Реакция преципитации может быть поставлена в виде кольцепреципитации или реакции преципитации в геле, последняя дает возможность изучать тонкую антигенную структуру бактерий и вирусов. Гемолитическая сыворотка Гемолитическую сыворотку получают путем 3—4-кратной иммунизации кроликов взвесью эритроцитов барана с интервалом в 2—3 дня. Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, которое в объеме 0,5 мл в присутствии комплемента вызывает гемолиз 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов барана в течение часа при температуре 37°С. Титр должен быть не ниже 1 : 1200—1 : 1500. Гемолитическая сыворотка применяется в реакции связывания комплемента (РСК) в индикаторной системе (гемолитическая сыворотка + эритроциты барана). Противовирусные сыворотки Иммунные противовирусные сыворотки, применяющиеся при идентификации вирусов, получают от различных животных в зависимости от вида вируса. Так, например, сыворотку против вируса вакцины, оспы и аденовирусов получают иммунизацией соответствующими вирусами кроликов; против вируса гриппа — белых хорьков, крыс, кур, мышей; против вируса кори — морских, свинок и т. п. В некоторых случаях предпочтительнее сыворотка реконвалесцентов, например, при диагностике полиомиелита, хотя против каждого отдельного типа вируса сыворотки можно получить иммунизацией обезьян. Необходимость строгого выбора животного для получения иммунных сывороток связана с учетом содержания в них неспецифических ингибиторов, которые подавляют активность вирусов и неспецифических агглютининов. Поэтому перед проведением реакций обязательно освобождают иммунные сыворотки от термолабильных (прогреванием при 56°С — 30 мин.) и термостабильных (ферментированием, обработкой углекислотой и др. методами в зависимости от вида вируса) ингибиторов и проверяют на наличие, неспецифических агглютининов. Иммунные диагностические противовирусные сыворотки применяются для определения вида или типа вируса, в, реакциях торможения гемагглютинации (РТТА), связывания комплемента (РСК), реакции нейтрализации на лабораторных животных, в культурах клеток и развивающихся куриных эмбрионах. Люминесцирующие сыворотки Люминесцирующие сыворотки представляют собой иммунные сыворотки, содержащие специфические антитела, меченные флюоресцирующими красителями. При приготовлении люминесцирующих сывороток проводят присоединение к глобулиновой фракции иммунной сыворотки различных флюорохромов путем прочной химической связи. Микроорганизмы, обработанные люминесцирующими сыворотками, приобретают способность светиться при просмотре препаратов с помощью люминесцентных микроскопов. Для маркирования антител люминесцирующих сывороток чаще всего применяется изотиоцианат флюоресцеина, дающий ярко-зеленое свечение по периферии клеток с характерной для данного вида бактерий морфологией; реже — различные производные родамина, которые придают оранжево-красное свечение. Приготовление препаратов для люминесцентной микроскопии несложно: исследуемую взвесь, содержащую микроорганизмы, наносят на предметное стекло, высушивают, фиксируют в жидком фиксаторе (этанол, ацетон и др.), окрашивают люминесцирующей сывороткой в течение времени, указанного на этикетке ампулы с сывороткой. Просматривают препараты в падающем свете люминесцентного микроскопа с иммерсионной системой. Интенсивность свечения оценивается по четырехплюсовой системе: + + + + — очень яркое свечение по периферии бактерий, контрастируемое с темным телом микроорганизма; + + + — яркая флюоресценция периферии изучаемого микроорганизма; + + или + — слабое свечение периферии клетки, не контрастируемое с телом бактерии. Метод люминесцентной микроскопии широко используется с диагностической целью — для выявления патогенных микроорганизмов в патологическом материале от больного, обнаружения бактерий непосредственно в объектах внешней среды (воды, смывы, почвы и т. д.), а также при определении и титровании антител в сыворотке больных. Люминесцентно-серологический метод (метод Кунса) для выявления микроорганизмов и антител используется в 2 модификациях: прямой и непрямой метод. 1. Прямой метод заключается в том, что исследуемый препарат обрабатывается люминесцентной сывороткой, специфической в отношении изучаемого микроорганизма. В результате образуется флюоресцирующий комплекс антиген — антитело. В настоящее время выпускаются люминесцирующие сыворотки: колиэнтеритные, брюшнотифозные, паратифозные А и В, дизентерийные Флекснера и Зонне, холерная, бруцеллезная, туляремийная, сибиреязвенная, чумная. 2. Непрямой метод может быть использован как для выявления бактерий, так и определения антител. Сущность непрямого метода состоит в том, что сначала проводится обычная иммунная реакция между антигенами и специфическими к ним антителами, затем этот комплекс обрабатывается люминесцйрующей антисывороткой, специфичность антител которой направлена против белков сыворотки того вида животного, от которого получена иммунная сыворотка. Результатом является флюоресцирующий комплекс: антиген — антитело — антиантитело. Для постановки непрямого метода выпускаются люминесцирующие сыворотки против глобулинов кролика, человека, лошади и др. Этот метод имеет определенное преимущество перед прямым, так как является в 10—12 раз более чувствительным и для его постановки можно в лаборатории иметь ограниченный набор люминесцирующих сывороток. Следует подчеркнуть те несомненные преимущества метода люминесцирующих антител, благодаря которым в настоящее время он широко применяется в практике. Во-первых, реакция позволяет наблюдать соединение антигена бактерий с антителами буквально на одной особи и, следовательно, характеризуется высокой чувствительностью, во-вторых, реакция является универсальной (так как может использоваться для обнаружения бактерий, вирусов, риккетсий и их растворимых антигенов), и в-третьих, реакция характеризуется простотой приготовления препаратов и быстрым получением ответа, и, наконец, позволяет исследовать не только живые, но и погибшие микроорганизмы. Люминесцентная микроскопия используется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний. III. ДИАГНОСТИКУМЫ В диагностических целях при обнаружении антител в сыворотке крови больных, реконвалесцентов и бактерионосителей используются серологические реакции. Для постановки таких реакций применяются диагностикумы-препараты, содержащие взвесь обезвреженных микроорганизмов или определенные антигены. Необходимость использования диагностикумов для серологических реакций связана не только с явным их преимуществом перед живыми культурами микробов (безопасность в работе), но еще и потому, что для приготовления диагностикумов подбираются штаммы микроорганизмов с высокой чувствительностью к антителам и способностью длительно сохранять антигенные свойства. Для инактивации микроорганизмов при приготовлении диагностикумов чаще всего используются химические вещества, особенно формалин, являющийся лучшим консервантом. Убитые нагреванием микробы хуже сохраняют антигенные свойства и применяются редко. В серологических реакциях (реакции агглютинации, реакции пассивной гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации) для выявления специфических антител применяются: бактериальные, эритроцитарные и вирусные диагностикумы. Бактериальные диагностикумы могут содержать инактивированную микробную взвесь или отдельные антигенные компоненты бактерий: О, Н или Vi-антигены и используются в реакциях агглютинации. Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с адсорбированными на них антигенами, извлеченными из бактерий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выявления антигена в выделениях больных, в тканях и др., применяют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сенсибилизированные антителами. Вирусные диагностикумы — препараты, содержащие инактированные вируссодержащие жидкости (культуральные, из куриных эмбрионов или организма животных, зараженных соответствующим вирусом), применяются в РСК (реакции связывания комплемента), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации. В настоящее время в лабораториях используются следующие диагностикумы. 1 .Бактериальный диагностикум сальмонелл тифа (или сальмонелл паратифа А и В, шигелл Флекснера, Зонне и др. бактерий семейства Enterobacteriaceae) является 3-млрд. взвесью бактерий, инактивированных формалином, и применяется в реакции агглютинации для обнаружения антител в сыворотке больных. 2. Сальмонеллезные О-диагностикумы содержат О-антигены различных групп сальмонелл (инактивированных 15%-ным раствором глицерина). Применяются для выявления О-антител при сальмонеллезных инфекциях в реакции агглютинации с сывороткой больных. 3. Сальмонеллезные Н-монодиагностикумы (Н-антигены 1 и 2-й фазы) — представляют собой жгутиковые антигены 1-й фазы (а, в, с, е, eh и др.) и 2-й фазы (1, 2, 5, 6, 7), выделенные путем обработки 0,5—0,75%-ным формалином из бульонной культуры сальмонелл соответствующих видов и используются в реакции агглютинации для определения заболевания в прошлом (анамнестическая реакция агглютинации) и реже с диагностической целью. 4. Vi — брюшнотифозный диагностикум — препарат, полученный из S. typhi в Vi — форме воздействием формалина, применяется в реакции агглютинации при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства. 5. Единый бруцеллезный диагностикум — взвесь бруцелл (инактивированных фенолом), подкрашенная метиленовым синим. Единый диагностикум применяется для определения антител в сыворотках крови больных бруцеллезом людей и животных в реакциях агглютинации Райта и Хеддльсона. 6. Эритроцитарный сальмонеллезный О-диагностикум — взвесь эритроцитов с адсорбированными на них О-антигенами различных групп сальмонелл. Используется для постановки РПГА с сывороткой больного при уточнении клинического диагноза сальмонеллезной инфекции. 7. Эритроцитарный Vi-диагностикум — эритроциты, сенсибилизированные очищенным Vi-антигеном S. typhi, применяется в РПГА при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства. 8. Гриппозный диагностикум представляет собой аллантоисную жидкость инфицированных вирусом гриппа (типов А, В) куриных эмбрионов и инактивированную мертиолатом или формалином. Диагностикумы необходимы при постановке РТГА с парными сыворотками больных для уточнения клинического диагноза и циркулирующего типа вируса гриппа. 9. Диагностикум вируса клещевого энцефалита получают из суспензии мозга белых мышей, зараженных вирусом клещевого энцефалита. Суспензию подвергают центрифугированию (для осветления) и инактивируют химическими веществами. Диагностикум используется в РТГА и РСК с сывороткой больных при диагностике заболевания. IV. АЛЛЕРГЕНЫ И ТОКСИНЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ КОЖНЫХ ПРОБ Аллергены бактериальные или инфекционные представляют собой взвесь убитых микробных клеток или извлеченных из них различных фракций и применяются в качестве диагностических препаратов для выявления повышенной чувствительности организма к возбудителям инфекционных заболеваний. Бактериальные экзотоксины (дифтерийный, скарлатинозный), используются для кожных проб при определении антитоксического иммунитета к этим заболеваниям. Аллергические кожные пробы применяются с целью диагностики при многих инфекционных заболеваниях, сопровождающихся аллергической перестройкой организма. В зависимости от способа введения аллергена кожные пробы могут быть аппликационные — при определении чувствительности к некоторым лекарственным, химическим веществам; скарификационные — при определении чувствительности к бытовым, пыльцевым, эпидермальным аллергенам и внутрикожные — при определении чувствительности к бактериальным и грибковым аллергенам. Диагностическое значение реакций организма на аллергены различно в течение инфекционного процесса. В начале инфекционного процесса положительная реакция свидетельствует только о зараженности определенным возбудителем и состоянии аллергии к нему и не может расцениваться как диагностическая. В разгар заболевания аллергическая проба учитывается как диагностическая. После некоторых инфекционных болезней остается аллергия к соответствующему возбудителю в течение нескольких лет, обнаружение которой свидетельствует о перенесенной инфекции. При положительной реакции на аллерген, учитываемой через 20 минут, а затем через 24 и 48 часов (редко 7 суток), ощущается чувство жжения на месте введения препарата, появляется покраснение, отек, может быть везикула. Аллергены, применяемые с диагностической целью, разнообразны по химической природе и методам получения. Ниже приводится описание некоторых диагностических препаратов, вошедших в широкую практику. 1. Туберкулин. В настоящее время выпускаются три препарата для проведения аллергических туберкулиновых проб: альттуберкулин Коха, сухой очищенный туберкулин (РРД) и очищенный туберкулин в стандартном разведении. Альттуберкулин Коха (АТК) — желтовато-коричневая жидкость, получаемая в результате выпаривания до 1/10 первоначального объема 5—6-недельной культуры микобактерий, выращенной на глицериново-мясопептонном бульоне. Старый туберкулин Коха содержит продукты жизнедеятельности и распада микобактерий и питательную среду. Препарат должен содержать не менее 90000 ТЕ (туберкулиновых единиц) в 1 мл. Альттуберкулин рекомендуется применять только для накожных проб Пирке. Сухой очищенный туберкулин (РРД) — (Derivatum proteinos purificatum tuberculini mammalinii) представляет собой белковый препарат, полученный из фильтрата культуру микобактерий туберкулеза осаждением химическими веществами с последующей очисткой. В 1 мл очищенного сухого туберкулина содержится 50000 ТЕ. Препарат применяется для внутрикожных проб по Манту, подкожной пробы Коха и других тестов. Очищенный туберкулин в стандартном разведении (РРД-2) приготовлен из порошка-туберкулина разведением его в растворителе (твин-80), обеспечивающим стабилизацию биологической активности препарата — 2 или 5 ТЕ в 0,1 мл. Применяется только для постановки внутрикожных проб по Манту. Преимуществом очищенных туберкулинов является их большая чувствительность и стандартность. Туберкулиновая диагностика проводится с целью определения инфицированности населения, особенно детей и подростков, туберкулезом; при отборе людей, подлежащих прививкам против туберкулеза; определения эффективности вакцинации и т. д. При массовой туберкулиновой диагностике применяют внутрикожную пробу Манту, используя очищенный туберкулин в стандартном разведении. При отсутствии у обследуемого человека инфицированности микобактериями туберкулеза наблюдается отрицательная реакция; при размере инфильтрата 2—4 мм — проба сомнительная, поэтому реакцию следует повторить через 3—4 недели. Если инфильтрат более 5 мм — реакция расценивается как положительная. 2. Тулярин содержит убитые нагреванием при 70°С микроорганизмы в 3%-ном глицерине, применяется для внутрикожного введения при диагностике туляремии, начиная с 3—5-го дня болезни. Проба с тулярином применяется также для определения поствакцинального иммунитета. |