Бактериофаги (вирусы бактерий) Бактериофаги(от бактерия

• Название: Бактериофаги (вирусы бактерий) Бактериофаги(от бактерия
• Дата: 05.07.2019
• Размер: 71.5 Kb.
• Имя файла: Bakteriofagi.doc
• Тип: Документы; #83690

Бактериофаги (вирусы бактерий)

Бактериофаги(от «бактерия» и греч. phagos— пожирающий)—вирусы бактерий, специфичес­ки проникающие в бактерии, паразитирующие в них вплоть до гибели (лизиса) бактериальной клетки.

Строение бактериофагов изучают с помощью электронной микроскопии образцов, контрастированных напылением металлов или фосфорно-вольфрамовой кислотой.

В зависимости от формы и структурной организации фаги подразделяют на несколько морфологических типов:

1. 
   нитевид­ные;
   
2. 
   мелкие кубические (некоторые из них име­ют аналоги отростков), без отростка, с коротким отростком, с длинным отростком;
   
3. 
   фаги сперматозоидной формы, т. е. с кубической головкой и хвостовым отростком, имеющие сокращающийся или не сокращающийся чехол отростка.
   

Размеры фагов колеблются от 20 до 800 нм (нитевидный тип).

Наиболее изучены крупные бактериофаги, имеющие форму сперматозоида и сокраща­ющийся чехол отростка, например, колифаги Т2, Т4, Т6. Они состоят из головки икосаэдрического типа размером 65—100 нм и хвосто­вого отростка длиной более 100 нм (рис. 3.14).

Хвостовой отросток имеет внутри полый ци­линдрический стержень, сообщающийся с головкой, а снаружи — чехол, способный к сокращению, наподобие мышцы. Чехол присоединен к воротничку, окружающему стер­жень около головки. На дистальном конце отростка имеется шестиугольная базальная ,пластинка с шипами, от которых отходят нитевидные структуры — фибриллы.

Бактериофаги содержат или ДНК, или РНК. Нуклеиновые кислоты фагов могут быть двунитевыми, однонитевыми, линейными, коль­цевыми. Большинство фагов содержит двунитевую ДНК, замкнутую в кольцо.

У фагов, имеющих форму сперматозоида, одна молекула двунитевой суперспирализованной ДНК находится внутри головки и за­щищена капсидом. Капсид состоит из белко­вых молекул — идентичных полипептидных субъединиц, уложенных по икосаэдрическому (кубическому) типу симметрии. В состав головки также входит полипептид, состоя­щий из аспарагиновой, глутаминовой кислот и лизина. У некоторых фагов внутри головки находится внутренний гистоноподобный бе­лок, обеспечивающий суперспирализацию ДНК. Сокращающийся чехол хвостового от­ростка образован также белковыми субъеди­ницами, уложенными по спиральному типу симметрии, содержащими АТФ и ионы Са²⁺. У некоторых фагов (например, Т2) в дистальной части отростка содержится фермент лизоцим.

Антигенные свойства. Бактериофаги содер­жат группоспецифические и типоспецифические антигены, обладают иммуногенными свойствами, вызывая синтез специфических антител в организме. Антитела, взаимодейс­твуя с бактериофагами, могут нейтрализовать их литическую активность против бактерий. По типоспецифическим антигенам фаги де­лят на серотипы.

Резистентность. По сравнению с ви­русами человека бактериофаги более ус­тойчивы к факторам окружающей среды. Инактивируются под действием температуры 65-70 °С, УФ-облучения в высоких дозах, ио­низирующей радиации, формалина и кислот. Длительно сохраняются при низкой темпера­туре и высушивании.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой. Бактериофаги инфицируют строго определенные бактерии, взаимодействуя со специфическими рецепторами клетки.

По специфичности взаимодействия различают следующие бактериофаги:

1. 
   поливалентные,взаимодействующие с родственными видами бактерий;
   
2. 
   моновалентные,взаимодействую­щие с бактериями определенного вида;
   
3. 
   типо­вые,взаимодействующие с отдельными типа­ми (вариантами) бактерий данного вида.
   

Взаимодействие фагов с бактериями может протекать, как и у других вирусов, по:

1. 
   продук­тивному,
   
2. 
   абортивному
   
3. 
   интегративному ти­пам.
   

При продуктивномтипе взаимодействия образуется фаговое потомство, бактерии лизируются; при абортивном типе — фаговое по­томство не образуется и бактерии сохраняют свою жизнедеятельность; при интегративномтипе — геном фага встраивается в хромосому бактерии и сосуществует с ней.

В зависимости от типа взаимодействия различают вирулент­ные и умеренные бактериофаги.

1. 
   Вирулентные бактериофагивзаимодейс­твуют с бактерией по продуктивному типу. Проникнув в бактерию, они репродуцируются с образованием 200—300 новых фаговых частиц и вызывают лизис бактерий. Взаимодействие бактериофага с бактерией напоминает взаимо­действие вирусов человека с клеткой хозяина. Специфическая адсорбция фагов на бактери­альной клетке происходит при наличии ком­плементарных рецепторов липопротеиновой или липополисахаридной природы в ее кле­точной стенке. На бактериях, лишенных кле­точной стенки (протопласты, сферопласты), бактериофаги не адсорбируются. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют поло­вые пили бактерий.
   

Фаги, имеющие хвостовой отросток, при­крепляются к бактериальной клетке свобод­ным концом отростка (фибриллами, базальной пластинкой). Проникновение фаговой нуклеиновой кислоты в бактерию наиболее изучено у бактериофагов, имеющих отрос­ток с сокращающимся чехлом. В результате активации АТФ чехол хвостового отростка сокращается, и стержень с помо­щью лизоцима, растворяющего прилегающий фрагмент клеточной стенки, как бы просверливает оболочку клетки. При этом ДНК фа­га, содержащаяся в его головке, проходит в форме нити через канал хвостового стержня и инъецируется в клетку, а капсид фага остается снаружи бактерии.

Некоторые мелкие кубические фаги, спо­собные адсорбироваться на половых пилях, вводят свою нуклеиновую кислоту через ка­нал этих пилей. ДНК нитевидных фагов про­ходит в бактерию вместе с одним из капсид-ных белков.

Инъецированная внутрь бактерии нукле­иновая кислота подавляет биосинтез компо­нентов клетки, заставляя ее синтезировать нуклеиновую кислоту и белки фага. Эти про­цессы схожи с репродукцией вирусов чело­века. После образования компонентов фага происходит самосборка частиц: сначала пус­тотелые капсиды головок заполняются нук­леиновой кислотой, затем сформированные головки соединяются с хвостовыми отростка­ми. В результате изменения внутриклеточного осмотического давления и действия фагового лизоцима происходит разрушение оболочки, лизис бактерии и выход фагов из нее. Весь литический цикл от адсорбции бактериофага на бактерии до его выхода из нее занимает 20-40 мин.

2. 
   Умеренные бактериофагив отличие от ви­рулентных взаимодействуют с чувствитель­ными бактериями либо по продуктивному, либо по интегративному типу. Продуктивный цикл умеренного фага идет в той же последовательности, что и у ви­рулентных фагов, и заканчивается лизисом клетки. При интегративном типе взаимодейс­твия ДНК умеренного фага встраивается в хромосому бактерии, реплицируется синх­ронно с геномом размножающейся бактерии, не вызывая ее лизиса. ДНК бактериофага, встроенная в хромосому бактерии, называется профагом,а культура бактерий — лизогенной.Такое сосуществование бактерии и умерен­ного бактериофага называется лизогенией(от греч. lysis — разложение, genea — происхож­дение). Профаг, ставший частью хромосомы бактерии, при ее размножении передается по наследству потомкам.
   

Каким образом нуклеиновая кислота при­соединяется к бактериальной хромосоме?После проникновения в бактерию ДНК уме­ренного фага приобретает форму кольца, а затем интегрирует по типу кроссинговера в строго определенную гомологичную область хромосомы клетки.

Итак, при лизогении образование фагового потомства не происходит. В основе «сдер­живающего» механизма репродукции фагов лежит образование в бактерии специфическо­го репрессора — низкомолекулярного белка, подавляющего транскрипцию фаговых генов. Биосинтез репрессора детерминируется ге­нами профага. Наличием репрессора можно объяснить способность лизогенных бактерий приобретать иммунитет (невосприимчивость) к последующему заражению гомологичным или близкородственными фагами. Под им­мунитетом в данном случае понимается такое состояние бактерии, при котором исключа­ется процесс вегетативного размножения вы­шеуказанных фагов и лизис клетки. Однако термин «лизогения» отражает потенциальную возможность лизиса бактерии, содержащей профаг. Действительно, профаги некоторой части лизогенной культуры бактерий могут спонтанно (самопроизвольно) или направ­ленно под действием ряда физических или химических факторов дерепрессироваться, исключаться из хромосомы, переходить в ве­гетативное состояние. Этот процесс заканчи­вается продукцией фагов и лизисом бактерий. Частота спонтанного лизиса бактерий в лизогенных культурах невелика (10², 10⁶), т. е. не захватывает все клетки, обладающие иммуни­тетом. Частоту лизиса бактерий можно значи­тельно увеличить, воздействуя на лизогенную культуру индуцирующими агентами (УФ-лучи, ионизирующее излучение, перекисные соеди­нения, митомицин С и др.). Сам же фено­мен воздействия, приводящий к инактивации репрессора, называется индукцией профага. Явление индукции используют в генной ин­женерии. Однако спонтанный лизис лизогенных культур может нанести вред микробиоло­гическому производству. Так, если микроорга­низмы — продуценты биологически активных веществ оказываются лизогенными, сущест­вует опасность перехода фага в вегетативное состояние, что приведет к лизису производс­твенного штамма этого микроба.

Геном профага может придавать бактерии новые, ранее отсутствовавшие у нее свойс­тва. Этот феномен изменения свойств мик­роорганизмов под влиянием профага получил название фаговой конверсии(от лат. conver-sio— превращение). Конвертироваться могут морфологические, культуральные, биохими­ческие, антигенные и другие свойства бакте­рий. Например, наличие профага в дифтерий­ной палочке обусловливает ее способность продуцировать дифтерийный экзотоксин.

Умеренные фаги могут быть дефектными, т. е. неспособными образовывать зрелые фа­говые частицы ни в естественных условиях, ни при индукции. Геном некоторых умеренных фагов (Р1) может находиться в цитоплазме бактериальной клетки в так называемой плаз-мидной форме, не включаясь в ее хромосому. Такого рода умеренные фаги используют в качестве векторов в генной инженерии.

Практическое применение фагов. Бактерио­фаги используют в лабораторной диагнос­тике инфекций при внутривидовой иденти­фикации бактерий, т. е. определении фаговара (фаготипа). Для этого применяют метод фаготипирования, основанный на строгой специфичности действия фагов: на чашку с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя, на­носят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, ко­торый вызвал ее лизис (образование сте­рильного пятна, «бляшки», или «негативной колонии», фага). Методику фаготипирова­ния используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидеми­ологическое маркирование). Выделение бак­терий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения.

По содержанию бактериофагов в объектах окружающей среды (например, в воде) можно судить о присутствии в них соответствующих патогенных бактерий. Подобные исследова­ния проводят при эпидемиологическом ана­лизе вспышек инфекционных болезней.

Фаги применяют также для лечения и про­филактики ряда бактериальных инфекций. Производят брюшнотифозный, сальмонел-лезный, дизентерийный, синегнойный, ста­филококковый, стрептококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др). Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парен­терально или местно в виде жидких, таблетированных форм, свечей или аэрозолей.

Бактериофаги широко применяют в генной инженерии в качестве векторов для получе­ния рекомбинантных ДНК.

Качественный метод определения фагов E.coli. Чашку Петри с питательным агаром засевают суточной бульонной культурой кишечной палочки газоном и подсушивают при 37 "С в течение 10—15 мин. Затем на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чаш­ку, отмечая наличие зоны лизиса по месту стекания капли фага.

Количественный метод — определение титра фага по методу Грациа. Для постановки опыта предварительно: а) разливают питательный агар в чашки Петри, подсушивают в термостате; б) приготовленный полужидкий (0,7 %) питательный агар, разлитый по 3—4 мл в пробирки, растапливают в водяной бане. Делают 10-кратные разведения исследуемого фага (10²—10⁷ в зависимости от предполагаемого титра) в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл из последнего разведе­ния фага (10⁷) смешивают с таким же объемом суточной бульонной культуры чувствительных к фагу бактерий и выли­вают в пробирку с полужидким агаром, охлажденным до 45 "С. Смесь быстро выливают на поверхность агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя. Так же готовят смесь из следующего разведения фага (10⁶) с бактериями и полу­жидким агаром и выливают на поверхность агара в другой чашке, затем — из разведения 10⁵. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37 *С, затем подсчитывают число негативных колоний фага. Число этих колоний соответст­вует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Исходя из него, можно вычислить количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии фага. Эта величина, характеризую­щая концентрацию фага, называется его титром (табл. 5.3.1).

Определение спектра литического действия фага. Чашку с пи­тательным агаром делят на квад­раты по числу испытуемых бак­териальных культур. На каждый квадрат петлей наносят каплю со­ответствующей бульонной куль­туры и распределяют ее по агару в пределах данного квадрата. За­тем на каждый засеянный квад­рат петлей или пастеровской пи­петкой наносят по одной капле испытуемого фага. После суточ­ной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая те квадраты, где имеется сплош­ной лизис бактерий или так на­зываемые стерильные пятна набактериальном газоне. Количество различных бактериальных культур, которые лизируются испытуемым фагом, определяет широту спектра его литического действия.

Фаготипирование бактерий. Испытуемую суточную бульон­ную культуру бактерий засевают на поверхность питательного агара в чашке Петри, слегка подсушивают в термостате, затем делят на квадраты, на которые пастеровской пипеткой наносят по одной капле различных типоспецифических фагов. После суточной инкубации отмечают на чашке те квадраты, в кото­рых имеется сплошной лизис бактерий. Фаготип бактериаль­ной культуры определяется тем типом фага, который вызывает ее лизис.

Определение лизогении. Исследуемую суточную бульонную культуру центрифугируют для отделения фага от бактерий. В том случае, если бактерии спонтанно продуцируют фаг, последний будет содержаться в надосадочной жидкости. Для выявления фага надосадочную жидкость засевают на газон индикаторной (чувствительной) бактериальной культуры, на котором через

1 сут инкубации при 37 "С образуются очаги лизиса — "сте­рильные" пятна. При отрицательном результате опыта иссле­дуемую бактериальную культуру предварительно подвергают УФ-облучению с целью индукции содержащегося в ней профага. Затем поступают так же, как и в предыдущем опыте.