Экспериментальные анемии и их патофизиологическая оценка. Экспериментальные анемии и их патофизиологическая оценка
 Скачать 91.5 Kb.
|
Методическая разработкапрактического занятия для преподавателей и студентов3 курса всех факультетов(кафедра патологической физиологии)1. Раздел курса: Патофизиология системы крови. 2. Тема занятия: Экспериментальные анемии и их патофизиологическая оценка. 3. Цель занятия: Изучить качественные и количественные сдвиги в периферической крови при экспериментальных анемиях. 4. Планируемый уровень усвоения: 2-3 уровни.5. Длительность занятия в академических часах: 3 часа все факультеты. 6. Место проведения занятий: залы кафедры патофизиологии.7. Вопросы к занятию: Определение анемии. Принципы классификации анемий. Количественные показатели при анемиях. Методы определения: кол-ва эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, подсчет цветного показателя. Качественные показатели при анемиях. Методы определения: приготовленные и окраска мазка по Лейшману, подсчет полихроматофилов, суправитальный метод окраски на ретикулоциты и их подсчет. 5. Методы получения экспериментальных анемий. 8. Практическая частьБерут кровь больного человека и определяют следующие гематологические показатели: кол-ва эритроцитов, гемоглобина, вычисляют цветной показатель, изготавливают и окрашивают мазки по Романовскому-Гимза и методом пожизненной окраски для выявления ретикулоцитов. Подсчитывают в мазках и выражают в % кол-во полихроматофилов на 1000 эритроцитов (ориентировочно такое кол-во содержится в 5 полях зрения микроскопа). Определяют наличие ядерных форм эритроцитов, изменение формы, величина, окраски эритроцитов и степени этих изменений. Зарисовывают отдельные элементы красной крови, дают патофизиологическую оценку анемии по: Цветовому показателю. Типу эритропоэза. Степени и качеству регенерации красных кровяных элементов. Величине эритроцитов и степени их дегенерации. 5. Патогенезу. Дают положительное заключение о данной анемии. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ЛЕЙКОЦИТОВПодсчет кол-ва лейкоцитов входит в состав общего клинического анализа крови. Существует 2 методики. В счетной камере Горяева и с помощью счетчика. Берут сухую пробирку, наливают в неё 0,4 мл 3% уксусной кислоты (подкрашенной метиленовой синей) и добавляют туда 0,02 мл крови взятой микропипеткой от гемометра Сали. Смешивают, готовят камеру Горяева и также заполняют её. Количество лейкоцитов считают под малым увеличением микроскопа в 100 больше не разграфленных квадратах, т.е. по всей сетке. Конденсатор опустить, диафрагму закрыть. Дальше рассчитывают по формуле: Лейк. = а * 4000 * 20 = Х = а * 50, где 1600 а – число лейкоцитов в 100 больших квадратах норма лейкоцитов 4 – 9 * 10 л. 20 – разведение – объём малого квадрата 4000 1600 – малых квадратов. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ЭРИТРОЦИТОВ В пробирку наливают 4мл 0,9% раствора NaCL с помощью пипетки. Затем берут чашечку Петри с гепарином, а затем микропипеткой от гемометра Сали до круговой метки (верхней) 0,2 мл добавляют кровь в пробирку. Смешивают и заполняют камеру Горяева с помощью глазной пипетки или стеклянной палочки. Подсчет эритроцитов производят под микроскопом в 5 больших квадратах, распределенных по диагонали. Количество эритроцитов подсчитывают по формуле: Эр = а * 4000 * в, где б Эр – кол-во эритроцитов в мкл. а – число эритроцитов, сосчитанных в 5 больших квадратах. б – число малых квадратов. в - разведение крови в 200 раз. 1/4000 – объем малого квадрата, умножая его на 4000, приводим к объёму 1 мм³ крови. Пример: в пяти больших квадратах (80 малых) сосчитано 450 эритроцитов кол-во эритроцитов в 1 мкл равно: 450 * 4000 * 200 = 45000000 80 или в 1л 4,5 * 1012/л, т.к. 1 * 10 мкл. В настоящее время пользуются фотометрическими и самыми прогрессивными электронно–автоматическими методами. Принцип фотометрического метода основан на фотометрическом изменении степени погашения света определенных волн взвесью эритроцитов. Процент задержанного света прямо пропорционально числу (концентрации) эритроцита МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ЛЕЙКОЦИТОВ. Подсчет количества лейкоцитов входит в состав общего клинического анализа крови. Существует 2 методики - в счетной камере Горяева и с помощью счетчика. Берут сухую пробирку, наливают в неё 0,4 мл 3% уксусной кислоты (подкрашенной метиленовой синей) и добавляют туда 0,02 мл крови взятой микропипеткой от гемометра Сали. Смешивают, готовят камеру Горяева и также заполняют её. Количество лейкоцитов считают под малым увеличением микроскопа в 100 больше не разграфленных квадратах, т.е. по всей сетке. Конденсатор опускают, диафрагму закрывают. Дальше рассчитывают по формуле: Лейк. = а * 4000 * 20 = Х = а * 50, где 1600 а – число лейкоцитов в 100 больших квадратах норма лейкоцитов 4 – 9 * 10 л. 20 – разведение 4000 - – объём малого квадрата 1600 – малых квадратов. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛ-ВА ГЕМОГЛОБИНА. Методика определения концентрации гемоглобина. Наиболее распространенными и простыми методами являются методы калометрические. Гематитовый метод Сали. Принцип: от прибавления крови НCI Hb превращается в солянокислый гематин (коричневого цвета), интенсивность которого пропорциональна содержанию гемоглобина. Полученный раствор солянокислого гематина разводят одной до цвета стандарта, соответствующего известной концентрации гемоглобина. Определение проводят в упрощенном калориметро-гемометре Сали. В мерную пипетку от гемометра набирают 0,02 мл крови (до метки) и осторожно выливают на дно градуированной пробирки, в которую заранее помещают 0,1 нормальной HCI до метки «2» с помощью глазной пипетки. Пипетку трижды промывают HCI, смесь встряхивают и дают отстояться в течение 5 минут. Образующийся солянокислый гематин скрашивает содержимое пробирки в коричнево-желтый цвет. Прибавляют дистиллированной воды, с помощью глазной пипетки, выравнивают цвет жидкости с цветом эталона и получают ответ в грамм-процентах (г %). Чтобы перевести в г/л, надо г % на *10. Этот метод прост, но неточен. Есть более совершенный унифицированный гемоглобин цианидный метод. 1) принцип: гемоглобин окисляют в мет Hb железосинеродистым калием (красная кровяная соль). Образующийся окрашенный цианид метгемоглобин определяют калометрически на ФЭКе. Можно определить содержание Hb с помощью счетчика и гематологического аппарата. В норме Hb 132-164 г/л у мужчин и 115-145 г/л у женщин. Фракции гемоглобина В норме три основных типа Hb: а) примитивный – Р – в раннюю эмбриональную стадию. б) фетальный – F – до 2% в) взрослый – А – они в свою очередь на подтипы: А1 – основная фракция 96-98 % А2 – приблизительно до 2 % А3 – следы. Определение фракции спектрофотометрические. Разница их в разной структуре полипептидной цепи. Реакции A и F отличаются по устойчивости к щелочам. На этом основано определение. Патологические формы Hb. Их более 200, когда в полипептидных цепях заменены или отсутствуют несколько аминокислот. Исследования трудоемки и проводятся в специальных лабораториях. В клинической практике используют различные расчетные характеристики, отражающие физико-химические свойства эритроцитов. Наиболее широко распространен расчет цветного показателя, который отражает относительное содержание Hb в эритроцитах. В норме Ц./п. в пределах 0,86-1,05. Определение среднего содержания Hb в 1 эритроците производится делением концентрации НВ на число эритроцитов в одинаковом объеме крови (в мкл - мм). Например: кол-во эритроцитов в 1 мкл крови = 5000000, концентрация Hb – 166 г/л 16,6 г %. Расчет – 1 мкл крови содержится 0,000166 г Hb или 166 мкл, а в одном эритроците – 166 мкл, 5000000 = 0,000033 мкл или 33 пг (пикограмм) или гамма грамм/1пг – 1*10г/. Практически среднее содержание Hb в одном эритроците можно вычислять по формуле: Hb в г/л - 166 г/л =33 или пикограммЧисло эр. в млн 5 млн Это число условно берут за 1,0 и обозначают как цветной показатель. Вычисление цветного показателя. 1. 3 * Hb в г/л =3 * 166 = 0,99 или 1,0 три первых числа эр. в мкл 500 2. 3 * Hb в г% = 3*16,6 = 1,0 два первых числа эр. в мкл 50 Величина цветного показателя и среднего содержания Hb в одном эритроците зависит от объема эритроцитов в степени насыщенности их Hb. В норме ц/п колеблется от 0,86 до 1,1, а среднее содержание Hb в одном эритроците от 27 до 33,3 или пг. Морфологию эритроцитов исследуют с помощью приготовления окраски мазков крови и излучения их под иммерсионным микроскопом. Приготовление и окраска мазка по Лейшману или Романовскому – Гимза. Подсчет полихроматофилов. Методика: Тщательно вымытым и обезжиренным предметным стеклом недалеко от его края прикасаются к капле крови на месте укола. Мазок делают шлифовальным стеклом, поставив его под углом 45 к предметному стеклу впереди капли. Подведя стекло к этой капле, ждут, пока кровь расплывается вдоль его ребра, затем быстрым движением проводят шлифовальное стекло вперед, не отрывая его от предметного стекла раньше, пока не иссякнет капля крови. Правильно приготовленный мазок имеет желтоватый цвет, тонкий, не достигает краев и заканчивается в виде следа (усов). Мазок высушиваем и без фиксации заливаем краской по Лейшману на 30-40 сек., после промывания проточной водой, высушиваем и смотрим под иммерсией. Обращаем внимание на форму (пойкилоцитов), величину (анизоцитоз), интенсивность окраски (гипо-, гиперхромия, анизохромия), на внутриядерные включения (эритроциты с ядром, тельца Жолли, кольца Кабота, базофильная зернистость). Обращаем внимание на наличие полихромафилов и подсчитываем их. Суправитальный метод окраски на ретикулоциты. Для определения более точного количества молодых эритроцитов в мазке крови применяют данный метод, который позволяет выявить в цитоплазме зернисто-нитчатую субстанцию, представляющую агрегированные рибосомы и митохондрии. Эта субстанция выявляется при суправитальном методе без фиксации мазка. Методика: Берут пробирку, в равном соотношении вносят в нее кровь и специальную краску. Пробирку ставят на 2-3 часа для окраски. Затем делают мазок на предметное стекло. Высушивают и смотрят под иммерсией. В мазках при суправитальной окраске эритроцитов окрашены в желтовато-зеленый цвет, а зернистая субстанция – в синий или фиолетовый. Методика подсчета полихроматофилов и ретикулоцитов. Подсчет производят на 1000 эритроцитов. Для облегчения подсчета ретикулоцитов используют счет окошечком. Из бумаги вырезают кружочек по размерам окуляра микроскопа. В центре кружочка прорезают отверстие размером 1,5 * 1,5 мм. Кружок, вложенный в окуляр, ограничивает поле зрения и этим значительно облегчает подсчет. Считаем, 1000 эритроцитов и количество ретикулоцитов, встречающихся при этом. Выражаем в %. Пример: на 1000 эритроцитов 150 ретикулоцитов (15 %). Полихроматофилы подсчитываются также, только в мазке крови, окрашенной по Романовскому-Гимза или по Лейшману. В норме у здорового человека 0,2-1,2%. Можно подсчитать количество ретикулоцитов при помощи люминесцентного микроскопа. Принцип метода: Использование способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови скрединовым оранжевым. Метод прост и очень быстро т.к. ярко-красную субстанцию легко подсчитать. Схема протокола.
В конце занятия дать патофизиологическую оценку данной анемии. 9. ЛИТЕРАТУРА: 1. Учебник по патофизиологии. Стр. 282-290. 2. Н.И. Зайко. Патологическая физиология. Стр. 352-369. 3. И.А. Кассирский, Г.А. Алексеев. Клиническая гематология. 1970. 4. Н.Д. Стаженко, Д.Н. Яновский. Атлас клинической гематологии. 5. В.А. Вейер. Краткое пособие по гематологии. 1967. 6. Гематология под редакцией Воробьева. Практикум по патофизиологии. Стр. 181. Просмотреть методики определения количества эритроцитов, лейкоцитов, Hb, понятие о цветном показатели в практикуме по нормальной физиологии. Лекции. 5. Таблицы. Принести цветные карандаши. 10. Методика проведения занятия. Проверка присутствующих 5 минОпрос 20 мин Диктовка методички 15 мин Практика 40 мин Выводы 10 мин Обратить внимание! Краску по Лейшману после окраски мазков сливать обратно в банку. 11. ТЕМЫ РЕФЕРАТОВ: 1. Этиология и патогенез мегабластической анемии (леч/фак.) 2. Этиология и патогенез гемолитической анемии у детей (педфак.) 3. Изменение состояния слизистой оболочки рта при заболеваниях крови (стом/фак.) |