Биохимия. ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЕ ВОПРОСЫ ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ. Экзаменационные вопросы по биологической химии для студентов лечебного, педиатрического и медикопрофилактического факультетов
 Скачать 6.22 Mb.
|
|
конститутивные, присутствующие в клетках в постоянных количествах независимо от метаболического состояния организма (например, ферменты гликолиза); индуцируемые, их концентрация в обычных условиях мала, но может возрастать в 100Q раз и более, если, например, в среду культивирования клеток добавить субстрат такого фермента; репрессируемые, т.е. ферменты метаболических путей, синтез которых прекращается при добавлении в среду выращивания конечного продукта этих путей. Теория оперона На основании генетических исследований индукции β-галактозидазы, участвующей в клетках Е. coli, в гидролитическом расщеплении лактозы, Франсуа Жакоб и Жак Моно в 1961 г. сформулировали гипотезу оперона, которая объясняла механизм контроля синтеза белков у прокариотов. В экспериментах гипотеза оперона получила полное подтверждение, а предложенный в ней тип регуляции стали называть контролем синтеза белка на уровне транскрипции, так как в этом случае изменение скорости синтеза белков осуществляется за счёт изменения скорости транскрипции генов, т.е. на стадии образования мРНК. У Е. coli, как и у других прокариотов, ДНК не отделена от цитоплазмы ядерной оболочкой. В процессе транскрипции образуются первичные транскрипты, не содержащие нитронов, а мРНК лишены "кэпа" и поли-А-конца. Синтез белка начинается до того, как заканчивается синтез его матрицы, т.е. транскрипция и трансляция протекают почти одновременно. Исходя из размера генома (4×106 пар нуклеотидов), каждая клетка Е. coli содержит информацию о нескольких тысячах белков. Но при нормальных условиях роста она синтезирует около 600-800 различных белков, а это означает, что многие гены не транскрибируются, т.е. неактивны. Гены белков, функции которых в метаболических процессах тесно связаны, часто в геноме группируются вместе в структурные единицы (опероны). Согласно теории Жакоба и Моно, оперонами называют участки молекулы ДНК, которые содержат информацию о группе функционально взаимосвязанных структурных белков, и регуляторную зону, контролирующую транскрипцию этих генов. Структурные гены оперона экспрессируются согласованно, либо все они транскрибируются, и тогда оперон активен, либо ни один из генов не "прочитывается", и тогда оперон неактивен. Когда оперон активен и все его гены транскрибируются, то синтезируется полицистронная мРНК, служащая матрицей для синтеза всех белков этого оперона. Транскрипция структурных генов зависит от способности РНК-полимеразы присоединяться к промотору, расположенному на 5'-конце оперона перед структурными генами. Связывание РНК-полимеразы с промотором зависит от присутствия белка-репрессора на смежном с промотором участке, который называют "оператор". Белок-репрессор синтезируется в клетке с постоянной скоростью и имеет сродство к операторному участку. Структурно участки промотора и оператора частично перекрываются, поэтому присоединение белка-репрессора к оператору создаёт стерическое препятствие для присоединения РНК-полимеразы. Большинство механизмов регуляции синтеза белков направлено на изменение скорости связывания РНК-полимеразы с промотором, влияя таким образом на этап инициации транскрипции. Гены, осуществляющие синтез регуяяторных белков, могут быть удалены от оперона, транскрипцию которого они контролируют. Механизмы регуляции экспрессии генов у эукариотов Эукариотические организмы (и особенно млекопитающие) устроены значительно сложнее прокариотов и нуждаются в более сложном аппарате регуляции. Так, в организме человека имеется более 200 различных типов клеток, существенно различающихся по структуре и функциям. В то же время различными методами исследования ДНК (прежде всего, методом молекулярной гибридизации) доказано, что количество и структура ДНК практически всех клеток организма одинаковы (за исключением лимфоцитов), т.е. все клетки организма содержат один и тот же геном. У высших организмов по сравнению с прокариотическими существенно возрастает содержание ДНК на гаплоидную клетку: с 4,2×106 пар нуклеотидов у Е. coliдо 3,3×109 пар нуклеотидов в клетках человека. Организация хроматина в дифференцированных клетках многоклеточного организма.В клетках млекопитающих наряду с адаптивной регуляцией, обеспечивающей приспособление организма к меняющимся условиям внутренней и внешней среды, существуют механизмы, которые сохраняют стабильную (существующую на протяжении всей жизни клетки и даже многих её генераций) репрессию одних генов и депрессию других. В ядрах дифференцированных клеток хроматин имеет такую укладку, что только небольшое число генов (часто менее 1%) доступно для транскрипции. Различают участки гетерохроматина, в которых ДНК упакована очень компактно и недоступна для транскрипции, и участки эухроматина, имеющие более рыхлую укладку и способные связывать РНК-полимеразу. В разных типах клеток в область эухроматина попадают разные гены, а это означает, что в разных тканях транскрибируются разные участки хроматина. Стойкая репрессия генов гетерохроматинаобеспечивается: пространственной укладкой ДНК, при которой гетерохроматин находится в высококонденсированном состоянии; метилированием дезоксицитидина ДНК-ме-тилазами в 5'-CG-3' последовательностях ДНК. Эта модификация сильно меняет кон-формацию хроматина и препятствует активной транскрипции; связыванием с гистонами и образованием нуклеосом, которые также снижают транскрипционную активность ДНК. Исследования показали, что области эухроматина, в которых расположены активно транскрибируемые гены, обладают некоторыми структурными особенностями: они более чувствительны к действию ДНК-аз, чем остальные участки ДНК; молекулы гистонов, связанные с ДНК в этих участках, модифицированы: е-аминогруппа лизина метилирована или ацетилирована; метилированы некоторые остатки аргинина и гистидина в гистонах Н2А и Н2В, являющихся коревыми белками нуклеосом. Некоторые молекулы Н2А образуют прочный комплекс с белком убиквитином. В гистоне HI фосфорилируются остатки серина. Результат этой серии ковалентных модификаций - снижение суммарного, положительного заряда гистонов и ослабление сродства нуклеосом к ДНК. к областям "активного" хроматина присоединяется группа негистоновых HMG-бел-ков, или белков с высокой подвижностью при гель-электрофорезе. Эти белки содержат много положительно заряженных аминокислотных остатков, связывание с которыми ослабляет взаимодействие ДНК и гистонов и вызывает дополнительное повышение транскрипционной активности генов. Разнообразие клеток и возросшая сложность клеточных процессов нуждаются в большом разнообразии механизмов регуляции. Показано, что разный набор и количество белков в эукариотических клетках может регулироваться: изменением количества структурных генов; перестройкой генов в хромосомах; эффективностью транскрипции разных участков генома; характером посттранскрипционных модификаций первичных транскриптов; на уровне трансляции; с помощью посттрансляционных превращений вновь синтезированных полипептидных цепей. Изменениеколичествагенов. Геном эукариотов обнаруживает высокую пластичность, играющую важную роль в регуляции активности некоторых генов и увеличивающую разнообразие клеточных ответов. У млекопитающих реализуются следующие варианты изменений в структуре генов: Амплификация (или увеличение числа) геновиспользуется организмом в том случае, когда возникает необходимость увеличить синтез определённого генного продукта. Многие гены, кодирующие белки или РНК, необходимые организму в больших количествах (например, гистоны, рРНК, тРНК), постоянно присутствуют в амплифицированном соетрянии. Так, у человека 20% общего генома состоит из участков, кодирующих рибосомные, транспортные и ядрышковые РНК, последние из которых обеспечивают посттранскрипционные модификации РНК. Амплифицированные участки могут располагаться друг за другом (тандемно) в хромосоме или образовывать внехромосомные фрагменты ДНК, называемые двойными мини-хромосомами, их размер колеблется от 100 до 1000 килобаз (1 килобаза = 1000 пар нуклеотидов). Описано более 20 генов, способных амплифицироваться при определённых условиях. К числу генов, для которых обнаружена амплификация, относят ген металлотионеина. Продукт экспрессии этого гена - низкомолекулярный белок металлотионеин, обладающий способностью связывать тяжёлые металлы (медь, цинк, кадмий, ртуть) и защищать клетки от отравления этими соединениями. Установлено, что в ответ на повышение концентрации тяжёлых металлов в крови в клетках происходит амплификация гена металлотионеина.Другими примерами генов, количество которых увеличивается под влиянием лекарственных препаратов, являются ген дигидрофолатредуктазы и ген Р-гликопротеина, ответственный за синтез белка, обеспечивающего множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток. Утрата генетического материала - довольно редкий способ регуляции. Наиболее яркий пример потери всех генов за счёт разрушения ядра - процесс созревания эритроцитов. Нестабильны амплифицированные гены, двойные хромосомы. Они, как правило, исчезают в последующих генерациях. Утрата генетического материала происходит в процессе созревания лимфоцитов и образования плазматических клеток разных клонов, синтезирующих секретируемые формы иммуноглобулинов. Перестройкагенов. У высших организмов, так же как и у прокариотов, отмечают процесс обмена, перемещения генов между хромосомами или внутри хромосомы, объединение генов с образованием изменённой хромосомы, которая после таких структурных изменений способна к репликации и транскрипции. Этот процесс получил название "генетическая рекомбинация". У эукариотов рекомбинации наблюдают: при половом слиянии яйцеклетки и сперматозоида; при перемещении подвижных генетических элементов - транспозонов, в состав которых входят отдельные гены или группа генов, с исходной позиции в какое-либо другое место той же или другой хромосомы; при формировании в лимфоцитах "библиотеки" генов, кодирующих антитела или иммуноглобулины. Рассмотрим более подробно механизмы, обеспечивающие образование в организме каждого человека около 10 млн (107) различных антител, т.е. количества значительно большего, чем число всех других белков, существующих у каждого индивидуума. Антитела с одинаковыми антигенсвязывающими свойствами синтезируются В-лимфоцитами, принадлежащими к одному определённому клону (т.е. группе клеток, возникшей из одной родоначаль-ной клетки), При попадании в организм любого антигена среди имеющегося набора В-лимфоцитов всегда найдётся такой клон клеток, антитела которого имеют комплементарный ему активный центр. Антитела встроены в плазматическую мембрану В-лимфоцитов, и их антигенсвязывающие участки локализованы на поверхности клеток. Антиген, присоединяясь к активному центру антитела, вызывает пролиферацию клеток и превращение В-лимфоцитов в плазматические клетки, в которых идут активный синтез и секреция не связанных с мембраной антител.Изучение вопроса о происхождении антител позволило сделать вывод о том, что огромное многообразие белков иммунной системы кодируется ограниченным количеством генетического материала, изменения в котором обеспечиваются рекомбинациями и соматическими мутациями (или изменениями в структуре ДНК, которые сохраняются при последующих делениях клеток). Вспомним, что мономерные антитела - доменные белки, состоящие из двух идентичных тяжёлых (Н) цепей и двух идентичных лёгких (L) цепей. Лёгкие цепи имеют двухдоменную структуру и включают вариабельный (VL) и константный (CL) домены. Тяжёлая цепь состоит из 4-5 доменов: одного вариабельного (VH) и, как правило, трёх константных (СH). Иммуноглобулины - гликопротеины; их углеводная часть присоединяется к константной области Н-цепей. В связывании антигенов участвуют 2 активных центра антитела, образованные вариабельными областями Н-цепей (VH) и L-цепей (VL). L-цепи бывают двух типов: λ (лямбда) и κ (каппа), значительно различающиеся по первичной структуре С-областей. Наличие в антителах С- и V-областей позволило предположить, что гены, обеспечивающие синтез L- и Н-цепей, образуются в результате соединения двух участков гена, один из которых кодирует вариабельную область, а второй - константную. И действительно вскоре было установлено, что в зародышевых клетках и соматических клетках, не синтезирующих иммуноглобулины, участки гена, кодирующие V- и С-области L-цепей λ-типа, разделены протяжёнными нуклеотидными последовательностями, но сближены в зрелых В-лимфоцитах, синтезирующих Lλ Из этого следовал вывод о том, что в процессе дифференцировки В-лимфоцита из зародышевой клетки происходит "вырезание" протяжённого участка генетического материала, обеспечивающее сближение VL- и Cλ-областей с образованием полного гена L-цепи иммуноглобулина. Этот процесс перестройки в геноме получил название соматической рекомбинации, так как он связан с созреванием лимфоцитов и не передаётся по наследству. Описано 3 разных семейства генных фрагментов, или сегментов, кодирующих строение L- и Н-цепей Ig. Два семейства ответственны за синтез лёгких цепей: сегменты, кодирующие строение L-цепей типа λ, расположены в хромосоме 22, генетический материал L-цепей типа к (каппа) - в хромосоме 2, а информация о всём разнообразии Н-цепей локализована в хромосоме 14. Полные гены L-цепей λ и κ типов в ходе дифференцировки собираются из 3 сегментов: вариабельного (VL), соединительного (JL) и константного (CL). Так, для L-цепей к типа обнаружено около 300 сегментов, кодирующих N-концевой вариабельный (Vκ) участок полипептидной цепи длиной в 95 аминокислотных остатков, 5 сегментов, в которых содержится информация об остальных 13 аминокислотах Vκ области, и 1 сегмент константной области. В зародышевых клетках 300 сегментов Vκ расположены в хромосоме последовательно на расстоянии 7 килобаз друг от друга. Каждый V-сегмент состоит из 2 экзонов, разделённых коротким интроном: лидирующий экзон (L) кодирует сигнальный пептид (20-25 аминокислотных остатков), а экзон Vκ - основную часть вариабельного домена. Семейство Vκ-сегментов отделено от группы соединительных сегментов (Тк) участком ДНК размером в 20 килобаз. Между последним из Jκ-сегментов и Сκ-экзоном, кодирующим домен константной области, расположен интрон размером в 2,4 килобазы. В ходе дифференцировки В-клеток один из вариабельных VL-сегментов путём соматической рекомбинации переносится из отдалённого участка в участок той же хромосомы, рядом с одним из сегментов JL. Например, сегмент V2 объединяется с соединительным мини-сегментом J4, и формируется полный ген L-цепи. Он состоит из 3 экзонов и 2 нитронов, расположенных в гене в следующем порядке: 5'L-I1-V2-J4-J5-I2-С-3', где L - лидерная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, I, - интрон V2-сегмента, а 12 - интрон между семейством JL-сегментов и Сκ-экзоном. После транскрипции гена в ходе сплайсинга из первичного транскрипта удаляются интроны I1, I2и лишний сегмент J5, а все кодирующие последовательности соединяются в единую информационную молекулу зрелой мРНК. В процессе синтеза L-цепи на рибосоме лидерный участок, состоящий в основном из гидрофобных аминокислот, обеспечивает прохождение белка через мембрану ЭР и затем отщепляется. Образуется L-цепь, имеющая аминокислотный состав, характерный для L-цепи κ-типа в молекуле Ig. Расчёты показывают, что из имеющихся сегментов κ-гена в организме можно синтезировать 4500 полных генов, кодирующих L-цепи κ-типа. Формирование полных генов L-цепей λ-типа происходит так же, как L-цепей κ-типа. Ещё большее разнообразие вариантов возникает при сборке полных генов тяжёлых (Н) цепей Ig. Н-цепи кодируются четырьмя сегментами: VH, DH (от англ, diversity) сегментами разнообразия, JH и СH. У человека обнаружено около 500 VH, 15 DH и 4 JH сегментов. Каждый VH сегмент содержит информацию об аминокислотной последовательности сигнального пептида и около 100 аминокислот VH домена. В сегменте DH закодирован участок полипептидной цепи, содержащий от 2 до 13 аминокислот, а в сегменте JH - 4-6 аминокислот. Полный ген вариабельного домена образуется путём соединения VH, DH и JH сегментов. При формировании полного гена вариабельной части Н-цепи Ig, состоящей из VH, D и JHсегментов, происходит 2 рекомбинационные состыковки: на первом этапе удаляется участок между выбранными Dx и Jy кодирующими последовательностями, а на втором - между Vi и DxJy сегментами. Экзонов, кодирующих константную область Н-цепей, описано 10: Сμ, Сσ, Сγ3, Сγ1, Сα1, Сγ2α, Сγ2β, Сγ4, Сε и Сα2, они определяют классы и подклассы иммуноглобулинов - IgM, IgG, IgA и т.д. Первыми в иммунном ответе появляются IgM, поскольку к полному гену вариабельного домена ближе всех остальных С-экзонов находится Cμ, сегмент Н-цепи. Активированные В-клетки могут синтезировать мембранно-связан-ную и секретируемую формы IgM. Кроме того, они могут переключаться с синтеза IgM на образование антител других классов. Перед каждым СH экзоном имеется участок ДНК, называемый "участок переключения", или "свич-сайт" (от англ, swich site), построенный из повторяющихся нуклеотидных последовательностей. Эти участки облегчают протекание дополнительной рекомбинации, в ходе которой удаляются С-сегменты между полным геном вариабельной области и С-сегментом того класса, который должен быть включён. Исследование нуклеотидных последовательностей генов некоторых подклассов L-цепей к-типа и Н-цепей показало, что разнообразие структуры сегментов, закодированных в зародышевой клетке, увеличивают соматические мутации. Мутации происходят в дифференцированных клетках на участках VL-JL и VHDHJH сегментов в процессе или после рекомбинаций, делая, таким образом, количество антител практически неограниченным. Очень важно, что мутации происходят в областях, ответственных за узнавание антигенов, обеспечивая более полное соответствие активного центра антитела антигену. Таким образом, перестройки генетического материала в процессе формирования полных генов Ig происходят в несколько этапов, каждый из которых приурочен к строго определённой стадии дифференцировки В-лимфоцитов. Из сегментов, которые кодируют различные участки полипептидной цепи, входящей в вариабельные домены, и одного из экзонов константного домена собираются полные гены тяжёлых и лёгких нитей Ig. Сборка L-цепей включает одну соматическую рекомбинацию, а сборка Н-цепей происходит с помощью двух соматических рекомбинаций. Когда В-лимфоциты синтезируют Ig не класса М, то это сопровождается ещё одним дополнительным рекомбинационным событием. Соматические мутации, происходящие в зрелых В-лимфоцитах, делают многообразие антител неисчерпаемым. Аналогичные процессы наблюдают и в ходе дифференцировки Т-лимфоцитов. Регуляция транскрипции. Регуляция транскрипции генов высших организмов сходна с регуляцией экспрессии генов прокариотов. Основное различие состоит в значительно большем количестве участков ДНК и регуляторных факторов, контролирующих этот процесс. У животных и человека различные гены экспрессируются в разные моменты времени и с разной интенсивностью. Здесь, так же, как у прокариотов, есть гены "домашнего хозяйства", транскрибирующиеся конститутивно, т.е. постоянно и во всех тканях. Это гены гликолиза, синтеза РНК и некоторых белков (например, альбумина). Существуют гены, транскрибирующиеся только в специализированных клетках, т.е. имеет место тка-неспецифическая экспрессия. Например, экспрессия генов α- и β-цепей глобина происходит только в клетках-предшественниках эритроцитов. Многие гены подвергаются адаптивной регуляции и являются объектами индуцибельных воздействий или негативного контроля. Ранее уже говорилось о том, что минимальный синтез любого белка поддерживается в том случае, если к ТАТА-участку промотора присоединяется ТАТА-связывающий белок, факторы транскрипции и РНК-полимераза, образующие инициирующий комплекс, осуществляющий синтез небольшого количества мРНК. Формирование комплекса - многоступенчатый процесс, от образования которого зависит скорость инициации транскрипции. Идентифицировано более 100 различных белков, способных взаимодействовать со специфическими регуляторными последовательностями ДНК, влияя главным образом на процесс сборки транскрипционного комплекса и скорость транскрипции. Эти белки имеют один или несколько доменов, обеспечивающих выполнение регуляторных функций. |