генная терапия. Генная терапия история развития генотерапии
 Скачать 1.85 Mb.
|
ГЕННАЯТЕРАПИЯИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ГЕНОТЕРАПИИНачало ХХ века – возникновение учения негативной евгеники; 20-е годы ХХ века – обнаружена зависимость степени проявления действия гена от влияния внешней среды или генотипа; Н.К. Кольцов разрабатвает новое направление – евфеника; 1934 г. – С.Н. Давиденков выявил гетерогенность наследственных заболеваний, т.е. одно и то же фенотипическое проявление болезни может быть обусловлено мутациями в разных генах или разными мутациями внутри одного гена; Годы после Второй мировой войны – дальнейшее развитие генетики, молекулярной биологии; 1980 г. – генетические опыты со стволовыми клетками крови на лабораторных животных; 1989 г. – первые опыты по генной терапии рака; 1995 г. – первый случай излечения наследственной болезни (недостаточность аденозиндезаминазы) методами генной терапии НАСЛЕДСТВЕННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯобусловлены нарушениями в процессах хранения, передачи и реализации генетической информацииНАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ ГЕННЫЕ ХРОМОСОМНЫЕ ХРОМОСОМНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ ИЗМЕНЕНИЕ ЧИСЛА ХРОМОСОМ МОНОСОМИЯ ТРИСОМИЯ МОНОГЕННЫЕ ПОЛИГЕННЫЕ МУЛЬТИ ФАКТОРИАЛЬ - НЫЕ А -ДОМИНИРУЮЩИЕ А - РЕЦЕССИВНЫЕ Х - СЦЕПЛЕННЫЕ У - СЦЕПЛЕННЫЕ ТИПЫ НАСЛЕДОВАНИЯБолезнь в каждом поколении Оба пола поражаются одинаково Болезнь у гомозигот протекает тяжелее, чем у гетерозигот Вероятность рождения больного ребенка, если болен один из родителей, равна 50% Болезнь Хантингтона, полидактилия, витилиго, рак молочной железы I типа аутосомно-доминантное аутосомно-рецессивное наследование Больной ребенок рождается у клинически здоровых родителей Болеют братья и сестры Оба пола поражаются одинаково Если больны оба супруга, то все дети будут больными Болезни обмена веществ – муковисцидоз, фенилкетонурия, гемохроматоз и др. Х-сцепленное наследование Болеют только мальчики по линии матери (зависит от наследования) Больной мужчина не передает заболевание, но все его дочери являются носительницами В браке женщины-носительницы с больным мужчиной 50% дочерей и 50% сыновей больны Гемофилия, дальтонизм, недостаточность Г-6-ФД, мукополисахаридоз II типа ПОНЯТИЕ ГЕНАГЕН - это ограниченный участок геномной ДНК (или РНК для некоторых вирусов), отвечающий за определенную и специфическую функциюГЕН - наследуемая часть генома, оказывающая влияние на какой-либо фенотипический признакГЕНЫРегуляторные Белок-кодирующие РНК-кодирующие Структурные гены СТРОЕНИЕ МОЛЕКУЛЫ ДНКФормирование двойной спирали происходит за счет водородных связей расположенных друг против друга оснований. Аденин взаимодействует с тимином образуя "слабую связь" (две водородных связи), а гуанин с цитозином образуя "сильную связь" (три водородных связи). СХЕМА ГЕНА ЭУКАРИОТЛЕЧЕНИЕ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙСимптоматическое лечение проявлений болезни (диета при фенилкетонурии) Замещающая терапия (введение белка свертываемости крови при гемофилии) Трансплантация органов и тканей Хирургическое вмешательство И др. МНОГОКРАТНОЕ ДОРОГОЕ СИМПТОМАТИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ МАЛООЭФФЕКТИВНО! КОНЦЕПЦИЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИПричины генетических заболеваний:мутация в зародышевой линии клеток, которая передается по наследству при наследственных заболеваниях, соматическая мутация, которая вызывает, например, рак, появления в клетке чужеродного генетического материала, например, в результате вирусной инфекции. Способ борьбы с генетическими изменениями:искусственное введение в пострадавшую клетку новой генетической информации, призванной поправить ту, с которой связана болезньНаиболее радикальный способ борьбы с разного рода заболеваниями, вызываемыми изменениями генетического содержания клеток - исправление или уничтожение самой генетической причины заболевания, а не ее следствий ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ: подходыфетальная генотерапия: чужеродную ДНК вводят в зиготу или эмбрион на ранней стадии развития; при этом ожидается, что введенный материал попадет во все клетки реципиента (и даже в половые клетки, обеспечив тем самым передачу следующему поколению) соматическая генотерапия: генетический материал вводят только в соматические клетки и он не передается половым клеткам.Технология in vivo – локальное введение генетической информации Технология ex vivo – трансплантация собственных клеток организма: МЕТОДЫ ДОСТАВКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КОНСТРУКЦИИ
Основные методы доставки новых генов: Биологические (на основе векторных систем) Химические Физические (безвекторный перенос).
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВПЛЮСЫэффективно переносят гены как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки не встраиваются в геном, обеспечивают высокие титры рекомбинантного вируса и высокий уровень экспрессии вводимых генов МИНУСЫвызывают неспецифическое воспаление и антивирусную реакцию клеточного иммунитета, что сокращает длительность экспрессии до недель или месяцевАденовирусные векторы Ретровирусные векторы ПЛЮСЫ эффективное встраивание чужеродной ДНК в геном и постоянство генетических изменений МИНУСЫ встраиваются только в делящиеся клетки могут вызывать инсерционные мутации дают сравнительно низкие титры рекомбинантного вируса, а экспрессия встроенного гена часто уменьшается до очень низкого уровня через несколько месяцев ГЕНОМ РЕТРОВИРУСОВ Компоненты начала сборки вируса ψ ψ «ПАКУЮЩИЕ ЛИНИИ»Выделение терапевтического гена в контексте регуляторных последовательностей с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выбор или создание векторной ДНК, удовлетворяющей поставленной цели. Выделение или искусственный синтез регуляторных элементов. Лигирование фрагментов ДНК (ДНК вектора, гена, регуляторных элементов, маркерных участков) в нужной последовательности и ориентации. Клонирование конструкции в оптимальных клетках и отбор рекомбинантных клонов. Проверка эффективности экспрессии гена и свойств его продукта. НЕДОСТАТКИ ВИРУСНЫХ СИСТЕММалое количество псевдовирусных частиц Прониквение ретровируса в клетку носит строго рецепторное взаимодействие Зависимость экспрессии генов от положения в клетке ЛИПОСОМЫКомплексы липосома-ДНК положительно заряжены Облегченное проникновение через билипидный слой Но!В частицах не содержится информации,направляющей их прямиком в ядроПУТИ РЕШЕНИЯ:Коньюгация липосом с антителами или лигандами (например, с трансферрином)Коньюгация липосом с вирусными частицами (например, вирус Сендай) Создание «суперлипосом» (комплекс липосома-антитела-вирус) Создание вирусом (вирусные частицы, содержащие векторные молекулы нуклеиновых кислот, целиком заключенные в липосомы разнообразной структуры ) ПРЯМОЕ ВВЕДЕНИЕ ДНК-КОНСТРУКЦИЙ: БАЛЛИСТИЧЕСКАЯ ТРАНСФЕКЦИЯА - дробовое ружье: 1 - пороховой заряд, 2 - войлочный пыж, 3 - дробь; Б - пороховой ускоритель Клейна и Стэнфорда: 1 - пороховой заряд, 2 - макроноситель (аналог пыжа), 3 - микрочастицы вольфрама, несущие вводимую ДНК, 4 - стопорная диафрагма для остановки микрочастиц: В - ускоритель Колесникова: 1 - заряд гремучей ртути, 2 - макроноситель, 3 - смесь микрочастиц золота и вольфрама, покрытых вводимой ДНК, 4 - стопорная диафрагма для остановки микрочастиц, 5, 6 - сетчатые диафрагмы для удаления частей разрушенного макроносителя и дезинтеграции конгломерата микрочастиц соответственно КЛЕТКИ - СРЕДСТВА ДОСТАВКИГематопоэтические стволовые клетки – клетки-предшественники зрелых клеток крови; Гепатоциты - дифференцированные и неделящиеся (в обычных условиях) клетки печени; Астроциты – первичные клетки нервной системы; Фибробласты – первичные клетки кожи; Фетальные стволовые клетки ТРИ СТРАТЕГИИ ГЕННОЙ ТЕРАПИИКоррекция дефекта клетки геннымимодификациями этой же клетки путем1.Восстановление функции «больного» гена2.Подавление функции «больного» генаМодификация гена с целью усиления иммунного ответа организма путем3. Повышения иммунного ответа (иммунизация антигенов или аутологических клеток)1-я стратегия – ВОССТАНОВЛЕНИЕ ФУНКЦИИ ГЕНАТаргетинг - встраивание генотерапевтической конструкции в определенное место генома Пополняющая генная терапия - введение здоровых генов при условии сохранения в клетке больного гена Использование одноцепочечных олигонуклеотидов – создание дополнительных водородных связей обуславливает способность ингибировать транскрипцию за счет перекрывания сайтов связывания транскрипционных факторов 2 стратегия – ПОДАВЛЕНИЕ ФУНКЦИИ ГЕНААнтисмысловая РНК - получаемый искусственно или природный полирибонуклеотид, комплементарный определенной мРНК и подавляющий ее биологическую активность за счет образования с ней дуплекса, что препятствует трансляции мРНК на рибосомах РИБОЗИМЫсодержат внутри себя антисмысловые участки и участки, осуществляющие ферментативную реакциюАПТАМЕРЫ небольшие молекулы нуклеиновых кислот, которые могут выполнять функции высокоспецифичных рецепторов низкомолекулярных органических соединений 3-я стратегия – ИММУНИЗАЦИЯГенная терапия опухолей. Потенциальные стратегии борьбы с раком:Увеличение иммуногенности опухолевых клеток путем введения генов, кодирующих чужеродный для этих клеток антиген (цитокиновых генов, генов, кодирующих главный комплекс гистосовместимости, лимфоцитарных лигандов) Поощрение клеток иммунной системы для увеличения их антиопухолевой активности, путем внесения в опухолевые клетки генов цитокинов. Введение в опухолевые клетки генов-убийц, которые синтезируют продукт, приводящий в определенных условиях к гибели опухолевых клеток Блокирование экспрессии онкогенов с помощью внутриклеточной иммунизации путем введения в клетки конструкций, программирующих синтез антисмысловых РНК или антител к онкобелкам Введение в опухолевые клетки генов-супрессоров (p53) Предохранение стволовых клеток от токсических эффектов химиотерапии путем введения в них генов устойчивости к лекарствам (MDR-1) Блокирование механизмов, с помощью которых опухолевые клетки избегают уничтожения иммунной системой путем введения генов, кодирующих РНК антисмысловую по отношению к IGF-1 Направленное убийство опухолевых клеток введением генов, кодирующих токсины под контролем промоторов, специфически экспрессирующихся в опухолевых клетках ГЕННО-ИНЖЕНЕРНАЯ МОДИФИКАЦИЯ T-ЛИМФОЦИТОВ ДЛЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ РАКАЗабор т-лимфоцитов, инфильтрующихся в опухоль (TIL) Модификация с помощью ретровирусного вектора Выращивание TIL в культуре с фактором роста интерлейкином-2 Введение обратно пациенту ПЛЮСЫ МИНУСЫ1. Доставка Т-лимфоцитов 1. Сложности с трансформациейнепосредственно 2. Низкая экспрессия цитокиновв опухоль2. Отсутствие побочныхэффектовПОВЫШЕНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТАМолекулы B7 экспрессируются на мембране антигенпрезенти-рующих клеток. Связываясь с белком CD28 на поверхности презентирующей Т-клетки, обеспечивает начало пролиферацииТ- клеток и иммунный ответ |