геномика. Геномика и протеномика их значение в создании новых лекарственных средств
 Скачать 69.5 Kb.
|
Геномика и протеномика их значение в создании новых лекарственных средств.Надо сделать: Пройти лекцию до конца К настоящему времени Вы заработали баллов: 0 из 0 возможных. 1Успехи генетики, молекулярной биологии и биохимии привели к формированию в девяностых годах XX века двух новых фундаментальных дисциплин: геномики и протеомики. ГЕНОМИКА Название геномика происходит от слова геном, то есть совокупности всех генов организма. Геномика выделилась из генетики. Этапы развития геномики 1. 1900 – 1940гг. Формальная генетика. Исследования велись на уровне ген-признак (открытие законов Менделя). Метод исследование – генеалогический анализ (изучение родословной).Существование гена было постулировано, но материальная его природа оставалась неизвестной. 2. 1940 – 1980 гг. Молекулярная генетика. Концепция Уотсона и Крика, были установлены размеры отдельных генов, функционально различные участки в гене; установление матричного механизма белкового синтеза с передачей генетического кода от ДНК к белку. Этап изучения групп сцепления.Методы изучения – генеалогический, цитогенетический (изучают хромосомы) и метод гибридизации соматических клеток. 3. С 1980 по сегодняшний день. Этап изучения локализации генов в геноме и расшифровка их нуклеотидной последовательности. Методы изучения – биохимические, иммунологические (серологические – исследование сыворотки крови и др. биол. субстратов для выявления антител и антигенов). Этот этап начал формироваться в 1980-х годах с развитием молекулярно-генетических методов и технологии генной инженерии. Процесс познания генома углубился до выделения гена в чистом виде и его секвенирования (установления нуклеотидной последовательности). Октябрь 1990г – запущен трехмиллиардный проект «Геном человека». Инициатор: нобелевский лауреат Уотсон. Рабочий черновик человеческого генома был опубликован в 2000г, а полный геном – к 2003 г. Полученные результаты в области исследования генома легли в основы выпущенного в США Кэнтором и Смит в 2000 году первого учебника для ВУЗов «Геномика». Задачи геномики: • установление количества содержащихся в клетке генов и их последовательности, • установление количества нуклеотидов в каждом гене и их последовательности, • установление функций каждого гена Т.об., геномика позволяет выразить сущность организма – его видовые (и даже индивидуальные) отличия от других организмов, его потенциальные возможности, предвидеть его реакцию на внешние воздействия, зная последовательность нуклеотидов в каждом из его генов и зная число генов. Минимальные геномы у некоторых видов микроорганизмов состоят из нескольких сотен генов. Геном человека приближается к ста тысячам генов. Размеры отдельных генов варьируют – примерно от одной тысячи пар нуклеотидов и выше. Т. об., количество пар нуклеотидов, составляющих индивидуальный геном измеряется как минимум сотнями тысяч, обычно же многими миллионами пар нуклеотидов. СЕКВЕНИРОВАНИЕ Метод Эдмана Первым методом секвенирования был метод Эдмана (1950-е годы). Суть метода заключается в обработке исследуемого пептида определенным набором реагентов, что приводит к отщеплению одной аминокислоты с N-конца последовательности. Циклическое повторение реакции и анализ продуктов реакций дают информацию о последовательности аминокислот в пептиде. В настоящее время практически не применяется из-за многих присущих ему недостатков (неколичественное протекание реакции, множественные побочные процессы). Метод Сэнгнера Севенирование по Сэнгеру (дидезоксинулеотидный методы, метод «обрыва цепи»). Происходит гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17—20 звеньев со специфическим участком одной из цепей секвенируемого участка. Этот олигонуклеотид является праймером (затравкой для синтеза комплиментарной цепи с помощью ДНК-полимеразы) Раствор с праймером распределяют по четырём пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — меченный радиоактивным изотопом) и один из четырёх 2',3'-дидезоксинуклеотидов. Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырёх пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырёх дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК. В более современном варианте дидезоксинуклеотиды метят четырьмя разными флуоресцентными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. Затем во время электрофореза в полиакриламидном геле луч лазера в определённом месте геля возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Современные приборы используют для секвенирования ДНК капиллярный электрофорез. Секвенаторы второго поколения: «Illumina» 1. Копии ДНК разрезаются в случайных местах на большое число небольших участков. 2. К каждому участку с двух сторон добавляют специальные адаптеры – заранее известные небольшие последовательности нуклеотидов. 3. Затем полученная смесь помещается на специально подготовленную подложку, из которой в виде решётки «растут» участки ДНК, комплементарные адаптерам. Таким образом, они способны «привязать» снабжённые адаптерами участки ДНК к этим местам. Кроме того, адаптеры также содержат праймеры. 4. На шаге 3 разные участки ДНК случайным образом «присасываются» к разным местам в решётке. Теперь мы многократно клонируем каждый участок вокруг своего места, получая тем самым целые «кластеры». 5. Участки ДНК денатурируют – в результате из узлов решётки на подложке «растут» разные участки ДНК, состоящие из одной нити. 6. Подложка помещается в раствор, содержащий ДНК-полимеразу и специально помеченные нуклеотиды, происходит репликация. Используют флуоресцентные метки. 7. Цикл повторяется В США и Великобритании были разработаны и внедрены автоматические приборы по секвенированию геномов. Их назвали геномотроны.В них осуществляется более 100 000 полимеразных реакций в час. Это означает, что в течение недели может быть просеквенирован участок (или участки) длиной в несколько миллионов пар нуклеотидов. Большую роль на этом этапе играют вычислительная техника и информационные системы. Они позволяют решать вопросы накопления информации (базы данных) из разных источников, хранить и оперативно использовать эту информацию. Более того, для этого служат специальные базы (банки) данных. Некоторые из них имеют статус международных. Широкую известность имеют базы данных института геномных исследований (США), Гейдельбергского Университета (Германия). Общаясь с такими базами, исследователи, секвенирующие конкретный геном конкретного организма, могут сопоставить свои данные с тем, что уже известно, сделать объективные выводы в отношении своей работы, пополнить базы данных новыми сведениями и т.п. Геномика таким образом, теснейшим образом связана с биоинформатикой, которая базируется на базах данных и компьютерной технике. Эрик Лендер подсчитал, что по сравнению с прошлым десятилетием цена расшифровки ДНК снизилась на сотни тысяч долларов. При расшифровке последовательности геномов в проэкте «Геном человека» использовали метод Сендера, что заняло 13 лет и стоило 3 млрд долл. Сейчас, используя последние устройства для расшифровки от фирмы «Illumina», человеческий геном может быть прочитан за 8 дней, и стоить это будет около 10 тыс. долл. Другая калифорнийская фирма, разработала способы, позволяющие прочитать геном всего с одной молекулы ДНК. Направления геномики 1. структурная геномика. Ее задача – идентификация генов с помощью специальных компьютерных программ. Фактически – это составление генетических карт организмов. Геном человека состоит из 3,2 млрд нуклеотидов. 2. сравнительная геномика – сравнительные исследования содержания и организации геномов различных организмов. Формируются соответствующие базы данных. Сравнительная геномика позволяет относительно быстро, связавшись с базой данных, установить, является ли изученный ген уникальным, или он уже был идентифицирован в другой лаборатории. Сравнительная геномика дает возможность: • получить сведения о степени гомологии родственных генов • получить ответ на вопрос об эволюционной близости одного организма другому • получить ответы на вопросы практического характера. Например: • если ведется поиск ингибиторов данного гена у патогенного микроорганизма с целью создания на их основе лекарственных средств, важно знать есть ли ген с такой или близкой последовательностью нуклеотидов в организме хозяина. Это позволяет строить предположения о степени безопасности создаваемых лекарств. Сравнительная геномика предусматривает оценку вероятности развития определенного наследственного заболевания у разных людей. Например, сравнительная геномика позволяет оценить генетические признаки развития таких болезней, как ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия и сахарный диабет. Это выясняется в зависимости от наличия определенных генов и их последовательностей. 3. функциональная или метаболическая геномика идентифицирует функцию каждого гена и участка генома, их взаимодействие в клеточной системе. Одна из важнейших задач геномики создать, так называемую «генную сеть» - взаимосвязанную работу генов. Например, генная сеть системы кроветворения включает в себя работу не менее 500 генов, они взаимосвязаны между собой и другими генами. Здесь также есть специализированные базы данных. Применительно к функциональной геномике надо отнести понятие так называемых "модельных" организмов – прежде всего это некоторые микроорганизмы, т.е. прокариоты и низшие эукариоты с полностью секвенированным геномом и досконально изученным метаболизмом, то есть микроорганизмы, у которых прослежены связи между генами и кодируемыми этими генами белками. Примерами таких модельных микроорганизмов могут служить Escherichia coli (прокариот) и Saccharomyces cerevisiae (так называемые пекарные дрожжи, у эукариот). Сопоставление гена у изучаемого организма с близким по степени гомологии геном у модельного организма позволяет делать заключение или, по крайней мере, строить предположения о функции гена-объекта исследования. Отсутствие гомологии указывает на необходимости специального изучения функций нового гена. Особое значение применительно к фармации, функциональная геномика имеет при установлении так называемой существенности отдельных генов. Под существенностью подразумевается необходимость гена (кодируемого им продукта) для жизнедеятельности клетки. Так при создании антимикробных лекарственных препаратов именно существенные гены (кодируемые этими генами продукты) должны быть мишенями для практически ценных антимикробных веществ. Но иногда ген приобретает значение существенности только в особых условиях, в которых может оказаться патогенный микроорганизм. 4. медицинская геномика – решает прикладные вопросы клинической и профилактической медицины на основе знания геномов человека и патогенных организмов. Геномика человека является основой молекулярной медицины. Если раньше предполагали, что наследственная патология, связана с определёнными генами или регуляторными зонами, то сейчас, всё большее внимание привлекают нуклеотидные последовательности, располагающиеся в межгенных промежутках. Они долгое время считались «молчащими». В настоящее время накапливается всё больше сведений об их влиянии на экспрессию генов. ПРОТЕОМИКА Название протеомики (появилось в 1997г) как научной дисциплины происходит от слова протеом – совокупность всех белков клетки, синтезирующихся в клетке или другом объекте (органе, организме). Протеомика выделилась из химии белка. Протеомика базируется на функциональной геномике, являясь следующим, после нее этапом познания живого уже на белковом уровне. Если геномика имеет целью получить информацию о всех потенциальных свойствах клетки, которые не реализуются на данный момент, например, молчащие гены, то протеомика дает возможность охарактеризовать клетку именно в данный конкретный момент, зафиксировав все находящиеся в ней белки. Это, своего рода, моментальная фотография функционального состояния клетки на уровне ее протеома, то есть совокупности всех ферментных и структурных белков, которые работают, в отличие от неэкспрессирующихся генов. Оъем информации, который в связи с этим предстоит обработать, не имеет аналогов в истории и, на несколько порядков по сложности и объему превышает проект “Геном человека”. Ведь число протеинов в человеческом теле достигает сотен тысяч, а это в десятки раз больше, чем количество генов (около 40 тысяч). Кроме того, набор генов в любой клетке один и тот же, набор белков для каждой клетки индивидуален. В отличие от генома протеом меняется в соответствии с состоянием клетки – реагирует на все внешние воздействия. Предложение нарисовать белковый атлас человека прозвучало еще в 1982 году (инициатор: американский биолог Андерсон). Но в начале 1980-х попытки тотального изучения белков казались просто далекой фантастикой, и проект не получил финансирования. Лишь после расшифровки генома протеомика обрела второе дыхание. В 2001 году международным консорциумом ученых, политиков и бизнесменов была создана организация HUPO (Human Proteom Organization). В ее задачи входит изучение структуры и функций человеческих белков. Изначально, в протеомике был взят медицинский уклон: в первую очередь стали изучать те белки, которые важны для понимания механизма заболевания и его диагностики. В частности, появились исчерпывающие базы данных, содержащие последовательности всех белков человека, а также их протеолитических фрагментов, полученных в стандартных условиях. Это позволяет идентифицировать белки по молекулярной массе их фрагментов методом масс-спектрометрии. Если геномика появилась прежде всего в результате развития техники секвенирования, то для протеомика основана на техникедвухмерного электрофореза – разделение белков в одном направлении по молекулярной массе, а в другом по изоэлектрической точке. Протеомика позволяет следить за белковыми взаимодействиями. Это относится, например, к передаче сигналов от поверхности клетки к факторам избирательной транскрипции в ядре. С ее помощью может быть преобразована, таким образом, не только технология скрининга иммуносупрессоров, но и ингибиторов сигнальной трансдукции в целом. Этапы протеомных исследований: 1. Чтобы получить сведения о протеоме, необходимо сначала его выделить и очистить от других молекул. Поскольку число белков во всем протеоме (т.е. во всем организме) весьма велико, обычно берут только часть организма (его орган или ткань) и различными методами выделяют белковую компоненту (подготовительный этап). 2. Проводят двумерный электрофорез экстрактов нормальной ткани и если необходимо одновременно патологически измененной, например из опухолевых клеток. Двумерный электрофорез разделяет молекулы белка на спец. носителе по двум направлениям – по разнице молекулярной массы и по разнице в электрическом заряде белковых молекул. В результате на специальном носителе одинаковые молекулы группируются, образуя макроскопические пятна различного размера, причем в каждом пятне содержатся только одинаковые молекулы. Число пятен, т.е. число разных белков или пептидов, может составлять многие тысячи (до 10 тыс.), и для их исследования используются автоматические устройства для обработки и анализа. 3. После того как устанавливается, количество каких белков в патологически измененной ткани уменьшилось или увеличилось, эти белки идентифицируются. Во-первых, это важно для установления диагноза, а во-вторых, именно идентифицированные белки могут быть молекулярными мишенями для новых лекарств. 4. Идентификацию проводят с помощью масс-спектрометрии: определяется молекулярная масса этих молекул и, если это необходимо, обычно в случае появления новых неизвестных белков, их секвенируют (определяют аминокислотную последовательность). 5. Для наиболее значимых белков с помощью методов рентгеноструктурного анализа или ЯМР-спектроскопии проводят определение трехмерной структуры. |