Химичекий синтез олигонуклеотидов. Химический синтез днк
 Скачать 103.11 Kb.
|
|
ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ДНК. В настоящее время наиболее распространен фосфорамидитный синтез олигонуклеотидов. Этот метод позволил автоматизировать процесс синтеза. Исходными соединениями являются модифицированные дезоксирибонуклеотиды, у которых 3'-фосфитная группа несет диизопропиламиногруппу, которая в свою очередь защищена метильным остатком, а 5'-гидроксильная группа остатка дезоксирибозы и аминогруппы пуриновых и пиримидиновых оснований также блокированы. Такая защита нуклеозидов предотвращает нежелательные реакции в ходе синтеза олигонуклеотида. Первый нуклеозидный компонент в котором 5'-гидроксильная группа защищена диметокситритильной группой, фиксируют на инертном твердом носителе.  При снятии защиты с 5'-гидроксила к нему присоединяется следующий нуклеозид в виде фосфорамидита, активированного тетразолом. Образовавшаяся триэфирная связь нестабильна, поэтому эфир окисляют в присутствии йода до пятивалентного фосфотриэфира.  Такой цикл синтеза ДНК, который в отличие от природного процесса происходит в направлении 3' →5' повторяется, пока не будет получен олигонуклеотид с искомой последовательностью. Затем все защитные группы удаляют, а однонитевой олигонуклеотид очищают методом гель-электрофореза или ВЭЖХ. Даже если продуктивность каждого цикла составляет 98%, при синтезе 20-звенного олигонуклеотида только 67% полученных олигонуклеотидов будут иметь нужную длину, а при синтезе 40-звенного фрагмента выход составит лишь 45%. Для синтеза более длинных олигонуклеотидов или целых генов, как правило, используют метод ПЦР. Если в лабораторной работе необходимы фрагменты ДНК, значительно превышающие 100 п.н., как правило, обращаются к услугам специализированных химических фирм, которые гарантируют быстрый, недорогой и точный синтез олигонуклеотидов. |