Лекция. Иммуно-химические методы. Иммунохимические методы

• Название: Иммунохимические методы
• Дата: 04.07.2020
• Размер: 479.5 Kb.
• Имя файла: Лекция. Иммуно-химические методы.doc
• Тип: Документы; #133704

Иммунохимические методы
Иммунохимические методы на протяжении нескольких десятилетий успешно применяются для обнаружения вирусов, токсинов, гормонов, лекарственных препаратов, наркотиков, экотоксикантов в биосредах человека и животных. Используются в различных областях медицины, (биотехнологии), микробиологии, пищевой промышленности.
При введении чужеродного соединения (антигена АГ) в организм животного и человека в последнем вырабатываются молекулы антител (АТ), связывающие введенный антиген. Антитела представляют собой глобулярные белки иммуноглобулины, которые чрезвычайно специфично реагируют с соответствующими антигенами: АГ + АТ = (АГ-АТ). Антитела получают из крови иммунизированных животных (продуцируются лимфоцитами млекопитающих). В роли антигена могут выступать различные вещества. В том числе ядовитые, наркотические, психотропные.

Проблема заключается в том, каким способом определить (детектировать, увидеть) прошла ли указанная реакция? Если прошла, то сколько было антигена в пробе?

Для детектирования результатов один из компонентов реакции, чаще АГ, метят специальной меткой (АГ*) и прибавляют к анализируемой пробе в определенном количестве.

Обычно в иммунологических методах определения веществ используются так называемые субстехиометрические реакции, при которых к раствору смеси определяемого соединения (АГ) и его аналога, содержащего метку (АГ*), АТ добавляют в количестве, меньшем необходимого по уравнению реакции. Как меченое, так и немеченое соединения взаимодействуют с добавленным в недостатке антителом абсолютно одинаково: АГ + АТ = (АГ-АТ) и АГ* + АТ = (АГ*-АТ). Они конкурируют за ограниченное число мест связывания с АТ и часть меченого и немеченого антигенов в конце реакции остаются свободными. Таким образом, соотношение концентраций меченого и немеченого соединений будет одним и тем же в растворе и в связанном с реагентом состоянии. Изучают продукты реакции и определяют количество токсиканта в пробе.

В зависимости от природы применяемой метки и способа ее детектирования выделяют несколько видов иммунохимического анализа.

Метод	Способ детектирования
Радиоиммунный анализ (РИА)	Радиоактивность
Иммуноферментный анализ (ИФА)	Ферментная активность
Поляризационный флуроиммуноанализ (ПФИА)	Поляризация флуоресцесценции
Люминесцентный иммуноанализ (ЛИА)	Интенсивность люминесценции
Металлоиммуноанализ (МИА)	Атомарные спектры поглощения, D
Иммуносенсорные методы	Электрический сигнал

При выполнении РИА введение метки осуществляется путем добавления антигена, содержащего радиоактивный изотоп (тритий, ¹⁴С, ¹²⁵J) К антителу добавляют антиген анализируемой пробы и определенное количество меченного радиоактивным изотопом антигена. Идет конкурентная реакция взаимодействия меченого и немеченого антигенов с антителом. Высокая концентрация определяемого (немеченого) соединения в пробе будет способствовать тому, что с антителом свяжется небольшое количество меченого антигена. Следовательно, степень радиоактивности выделенного комплекса АГ*-АТ является мерой концентрации антигена в пробе. Зависимость обратная: высокая радиоактивность комплекса соответствует низкой концентрации определяемого (немеченого) вещества в пробе.

В повседневной работе радиоактивные изотопы стараются не применять из-за их опасности. Широко используются другие методы (см. табл.):

Поляризационный флуроиммуноанализ (ПФИА) - в качестве метки используют флуоресцирующие группировки (обычно остаток флуоресцеина). По окончании реакции измеряют интенсивность флуоресценции комплекса АГ-АТ.

В люминесцентном иммуноанализе молекулы определяемого вещества метят хемилюминисцентным маркером, например, вводят остаток изолюминола.

Введение электрохимически активных группировок используется в иммуносенсорных методах.

Современные иммунохимические методы отличаются:

• 
  высокой чувствительностью, специфичностью (10^-15М);
  
• 
  простотой исполне­ния,
  
• 
  позволяют одновременно анализировать большое число проб,
  
• 
  не требуют дополнительной или специальной очистки пробы или концентрирования и поэтому очень удобны для скрининг-диагностики.
  

С помощью этого метода определяют различные классы лекарственных веществ в биологических жидкостях, в том числе и с целью диагностики острых отравлений (стероиды, сердечные гликозиды, производные бензодиазепина, карбамазепин, серотонин, никотин, наркотические и одурманивающие средства).

Иммунохимические методы широко используются при проведении аналитического скрининга на первом этапе исследования, когда требуется высокочувствительный метод. Пробы, давшие положительный результат в дальнейшем исследуются более специфическими хроматографическими, масс-спектральными методами. Это позволяет значительно сократить объем работы.

В настоящее время выпускаются готовые коммерческие наборы реагентов, позволяющих выявлять основные классы одурманиваю­щих средств (опиаты, каннабиноиды, барбитураты, кокаин и др.), с гарантированным пределом обнаружения 300 — 500 нг/мл — диагностикумы фирм "Сива" (США), "Хоффман-ла Рош" (Швейца­рия), ИФАВ РАН (РФ), "Эбботт" (США) и др.
Иммуноферментный анализ
В качестве меток широко применяют ферменты (ИФА). Как правило, они представляют собой различные оксидазы, способные окислять специальное химическое вещество - хромогенный субстрат с образованием окрашенных продуктов. По интенсивности окраски и судят о присутствии и количестве токсического вещества в анализируемой пробе.

В реакции участвуют: АТ, АГ и АГ*. Немеченый антиген - это токсикант в исследуемой пробе (АГ). Меченый антиген (АГ*) – это вещество, аналогичное токсиканту по химической природе с прикрепленным к нему ферментом. С антителами взаимодействует как свободное (АГ), так и меченое вещество (АГ*), причем в результате реакции с АТ меченого АГ*, активность фермента подавляется. Чем выше концентрация немеченого (определяемого) вещества, тем он больше занимает мест связывания с АТ. Значит меченому ферментом АГ* достается небольшое количество мест связывания с АТ, он остается в растворе свободным и активно окисляет хромогенный субстрат с образованием окрашенного продукта.

По технике выполнения различают два типа иммуноферментного анализа: гомогенный и гетерогенный. Аппаратура для проведения иммуноферментного метода выпускается серийно: гомогенный ИФА ("Сива", ЭМИТ) и гетерогенный (ИФАВ РАН, "Хоффман-ла Рош") и др.

В гомогенном ИФА все компоненты реакции: антитело, определяемое вещество, меченое определяемое ве­щество, хромогенный субстрат - находятся в растворе. На первой стадии анализа в реакционной среде присутствуют одновременно три компонента:

• 
  аликвота анализируемой биопробы с определяемым веществом- антиген АГ ,
  
• 
  веще­ство с ферментной меткой - меченый антиген, АГ*
  
• 
  антитело АТ.
  

Определя­емое вещество биопробы и меченый антиген конкурируют между собой за ограниченное число мест связывания АТ.

На второй стадии анализа к реакционной смеси добавляется хромогенный субстрат, который под действием свободного не вступившего в связь с АТ меченого антигена претерпевает химическое изменение, превращаясь в окрашенное соединение. Меченый антиген, связанный с антителом, не дает окраски вследствие потери активности фермента за счет пространственных затруднений.

Окраска анализируемого раствора прямо пропорциональна концентрации не вступившего в связь с АТ меченого антигена а, следовательно, концентрации конкурента – токсического вещества, находящегося в биопробе. Полученная окраска регистрируется визуально или с помощью приборов, например, фотоэлектроколориметра.

В гомогенном ИФА в качестве метки используются следующие ферменты: лизоцим, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа.
Вариант гомогенного иммуноферментного анализа.

Вариант гетерогенного иммуноанализа.
В наиболее распространенных случаях гетерогенного ИФА ан­титело иммобилизуется на каком-либо твердом носителе, например, полистирольных планшетах, пробирках (внутренняя поверхность), бусах, гранулах.

Первая стадия анализа выполняется аналогично - проводится конкурентное связывание антигенов (меченого и немеченого) с антителом, находящемся на твердой основе. Затем производится отмывка, т.е. разделение раствора с непрореагировавшими реагентами и твердого носителя.

На второй стадии добавленный хромогенный субстрат взаимодействует с ферментом-меткой, связанным с антителом, им­мобилизованным на твердом носителе, и образует соответствующую окраску. Здесь наблюдается обратная зависимость – чем выше концентрация токсического вещества в пробе, тем менее интенсивной будет окраска. Если концентрация определяемого вещества в пробе зна­чительно превышает концентрацию антигена, меченного ферментом, то после удаления последнего из реакционной смеси в результате отмывания, как не вступившего в реакцию, хромогенный субстрат не будет образовывать окраски (положительный ответ). (На сорбенте полностью отсутствует фермент-метка.)
Вариант гетерогенного иммуноферментного анализа.


Гомогенный ИФА более экспрессный, время проведения анализа занимает от 1 до 30 минут, включая обработку результатов. Предел обнаружения составляет от 10^-6до 10^-9г/мл. Гомогенный ИФА часто используется при скрининге большого количества образцов для предварительного установления факта употребления одурманива­ющих средств. Недостатком гомогенного анализа является доста­точно высокий фон.

Гетерогенные методы характеризуются высокой чувствительно­стью (10^-9- 10^-11 г/мл), но он более длителен (от 2 до 4 часов).

В настоящее время чувствительность достигает 10^-15М.
Поляризационный флуороиммуноанализ (ПФИА)
Явление поляризации флюоресценции было впервые описано Перреном в 1926 г. и затем подробно изучено Вебером в 1952-1953 гг. В дальнейшем Дандликер с соавт. предложили использовать поляризацию флю­оресценции в иммунохимических исследованиях.

Метод получил распространение после создания полностью автоматизированного анализатора TDx фирмы Abbott (США) и его широ­кого коммерческого применения, с 1980 г. метод ПФИА стал применяться для мониторинга лекарств.

В настоящее время метод используется для определения лекарств, для определения ионов металлов, для определения микотоксинов, наркотиков, пестицидов. Фирмой Abbot и др. выпускаются наборы реактивов для анализа порядка 100 лекарственных веществ методом ПФИА. Методики анализа ряда наркотиков, пестицидов, детергентов впервые разработаны в МГУ.

Поляризация флуоресценции обусловлена взаимосвязью между ориентацией молекул и поглощением и испусканием ими света. В процессе возбуждения флуоресценции специфические центры молекул становятся осциллирующими электрическими диполями. Их называют осцилляторами поглощения и эмиссии соответственно. В растворе неупорядоченно ориентированных молекул вещества поляризованный свет будут поглощать, те молекулы, осцилляторы, которых параллельны плоскости поляризации. Если молекула в момент эмиссии будет относительно устойчива, не будет быстро менять ориентацию в пространстве, то эмиссия флуоресценции будет также частично поляризована. Степень поляризации эмиссии флуоресценции измеряют с помощью приборов.

Маленькие молекулы в водной среде вращаются очень быстро и между поглощением и эмиссией равновероятно принимают любую ориентацию, что приводит к полной деполяризации сигнала эмиссии.

Большие молекулы при эмиссии частично сохраняют ту же ориентацию, что они имели при поглощении света, поэтому их флуоресценция в большой степени поляризована.

При облучении голубым светом (длина волны 492 нм) молекула флюоресцеина поглощает квант света и переходит в возбужденное состояние. Среднее время жизни в возбужденном состоянии для молекулы флюоресцеина составляет примерно 4·10^-9 секунды и является оптимальным для измерения поляризации флуоресценции в растворе. Поэтому для метода ПФИА в качестве флюорофора (метки), чаще всего применяют флуоресцеин.

Так как молекулы в растворе хаотично ориентированы, то результирующая поляризация флю­оресценции такой маленькой молекулы, как флюоресцеин, будет приблизительно равна нулю, а для большой молекулы, например, им­мунного комплекса антитело-антиген, меченного флюоресцеином, будет большой.

Степень поляризации зависит от многих факторов, в частности от размера молекулы, температуры и вязкости раствора. При постоянной температуре и вязкости раствора поляризация флюоресценции будет зависеть только от размера флюоресцирующих молекул. На этом принципе построено изуче­ние реакции взаимодействия антиген-антитело.



Принцип поляризации флюоресценции.

а — быстрое вращение, низкая поляризация флюоресценции: б — медленное вращение, высокая поля­ризация флюоресценции.

F — флюоресцентная метка; Ag — антиген: Аb — антитело; F-Ag — трейсер — меченное флюоресцентной меткой производное определяемого вещества.

Степень поляризации количественно характеризуется величиной Р, которая изменяется в пределах от 0 до 0,5. В расчетах обычно используют величину милиполяризации флуоресценции mP (mP=1000Р). Степень поляризации фиксируют с помощью специальных анализаторов – флюоресцентных ридеров.




Флуоресцирующий раствор возбуждают светом, поляризованным в вертикальной плоскости, а эмиссию флюоресценции измеряют в перпендикулярном по отношению к лучу возбуждения направлении с помощью второго поляризатора, у которого плоскость поляризации может быть расположена или вертикально, или горизонтально.
Применительно к иммуноанализу метод поляризации флуоресценции основан на конкурентном связывании анализируемого антигена и антигена, меченного флуоресцентной меткой (трейсера), со специфическими антителами. (две известные реакции):

АГ + АТ = (АГ-АТ) и АГ* + АТ = (АГ*-АТ). В качестве метки чаще всего используют флюоресцеин. Поляризация флюоресценции свободного трейсера в растворе имеет низкое значение, и возрастает при связывании трейсера в иммунный комплекс с антителами. Таким образом, поляризация (величина mP) реакционной смеси отражает соотношение связанной и свободной фракций трейсера и обратно пропорциональна концентрации анализируемого антигена (токсиканта). Нужно внимательно рассмотреть рисунок.



Чем выше концентрация определяемого антигена (токсиканта) в пробе, тем в большей степени меченый антиген в реакционной смеси будет находиться в свободном состоянии и ниже значение поляризации флюоресценции. Определение концентрации токсиканта проводят по калибровочному графику.




Имерение флуоресценции проводится на специальных высокоавтоматизированных флюоресцентных ридерах фирм Abbot, Perkin-Emler и др. В устройство входят поляризаторы на жидких кристаллах, точность измерения 0,005 единиц mP.

Метод ПФИА является гомогенным, осуществляется в одной системе и не требует механического разделения образовавшихся соединений. Для его выполнения требуется несколько минут.

Достоинства и недостатки:

• 
  Универсальность применения для низкомолекулярных веществ.
  
• 
  Проводится в однофазной системе и не требует механического разделения образовавшихся соединений,
  
• 
  Можно определять одно соединение и группу веществ в зависимости от специфичности АТ,
  
• 
  Высокая чувствительность и правильность
  

Но чувствительность на 2-3 порядка ниже, чем ИФА.
Иммунохроматография на тест-полосках
Этот метод основан на протекании иммунной реакции антиген-антитело при движении тестируемого образца жидкости по полоске за счет капиллярных сил и визуальной детекции образования окрашенных зон в различных участках полосок с иммобилизованными иммуно-реагентами.

Поскольку антитела специфичны к соединению определенной структуры, то наборы выпус­каются отдельно на каждую группу наркотических средств и их метаболитов (опиаты, кокаин, каннабиноиды, барбитураты и т.д.). Таким образом, при обнаружении неизвестного наркоти­ческого средства исследуемый биообъект необходимо последовательно проанализировать на все группы наркотических средств.

Тест-зона Контрольная

зона

В отличие от других ИХМ, проведение ИХА на тест-полосках не

требует никаких допол­нительных реагентов — все необходимые иммуно- реагенты находятся на тест-полоске. Весь анализ сводится к простому погружению тест-полоски в тестируемую жидкость (например, мочу), и визуальной регистрации окрашивания зон на тест-полоске. Обычно время проведения анализа составляет 5-10 мин.

Тест-полоска изготавливается из полистирола, на который приклеивается целлюлоза, пропитанная соответствующими реактивами.

1). На нижний участок полоски, который будет погружаться в биологическую жидкость (мочу, кровь), наносят растворимые моноклональные антитела к исследуемому антигену, конъюгированные ("сшитые") с коллоидным золотом - красителем, который можно легко идентифицировать даже в самых малых концентрациях.

2). В тест-зоне иммобилизованы искусственные антигены, способные специфически связываться со свободными антителами.

3). На верхнем участке в контрольной зоне тест-полоски. находятся жестко иммобилизованные вторичные (антивидовые)антитела к моноклональным антителам.

Если исследуемый антиген (наркотик) НЕ присутствует в физиологической жидкости, участки связывания антител остаются свободными, и они, перемещаясь вверх способны связываться с искусственными антигенами в тест-зоне, образуя окрашенную полосу за счет конъюгированного красителя. Далее, избыток меченных золотом антител перемещается дальше и образует окрашенный комплекс с вторичными антителами в контрольной зоне. Таким образом, получается две окрашенных полосы.

Соответственно если исследуемый антиген присутствует в жидкости, то антитела, связавшись с ним, уже не могут взаимодействовать с антигенами в тест-зоне и образования окрашенной полосы там не происходит. Иммунный комплекс антигена с антителом, меченным коллоидным золотом, будет продвигаться дальше до контрольной зоны, где идет образование окрашенной полосы за счет иммунной реакции с вторичными антителами.

Таким образом, в обоих случаях (если анализ проведен правильно) происходит связывание "окрашенных" антител с вторичными антителами в контрольной зоне и образование там темной полосы. Возможные варианты при проведении анализа: одна полоса - положительный результат, две полосы - отрицательный результат, нет полос - анализ проведен неправильно.

Основными преимуществами использования иммунохроматографических тест полосок являются:

1. 
   Простота и быстрота.
   
2. 
   Надежность - достоверность тестов достигает 92-99,8%, при этом каждый тест имеет встроенный внутренний контроль
   
3. 
   Экономичность - минимальные затраты на приобретение теста и экономия времени на проведение обследования.
   

Применение метода эффективно при использовании на первом этапе ХТА в качестве предварительного теста при поиске неизвестного яда. Используются наборы тест-полосок на группы токсикантов: барбитураты, трициклические соединения, производные бензодиазепина, опиаты, каннабиноиды. Оцениваются результаты и выбирается направление химико-токсикологического анализа.
ИММУНО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Теория селекции клонов австралийского исследователя, лауреата Нобелевской премии Ф.М. Бернета (1899—1985)? дала ответ на вопрос, почему, попадая в организм, антиген вызывает синтез именно тех антител, которые специфично реагируют только с ним.

Бернет утверждал, что одна клетка синтезирует лишь один тип антител, которые локализуются на ее поверхности. Последующие эксперименты полностью подтвердили положение о том, что антитела формируются до и независимо от встречи с антигеном.

Предназначение антигена заключается в том, чтобы отыскать нужную клетку, несущую на своей мембране антитело, реагирующее именно с ним, а затем активировать эту клетку. Активированный лимфоцит вступает в деление и дифференцировку, что приводит к возникновению из одной клетки 500—1000 генетически идентичных клеток (клонов), синтезирующих один и тот же тип антител, способных специфически распознавать антиген и соединяться с ним.

ИХМ основаны на связывании определяемого соединения со специфическими антителами, полученными специально на данный аналит, и дальнейшей детекции образовавшихся комплексов с помошью различных меток и методов определения.

В основе ИХМ анализа лежит обратимое нековалентное связывание антигена со специфическими антителами. Эта реакция подчиняется закону действующих масс:

АГ+АТ = АГ-АТ

где Ат — специфические антитела;

Аг — антиген;

Аг:Ат комплекс антиген—антитело;

К₁ константа скорости образования комплекса,

К₂, — константа скорости диссоциации комплекса.

Реакция обычно протекает до установившегося и системе равновесия, когда концентрации антигена, присутствующего в свободной и связанной фракциях, остаются постоянными.

Реакция антигена с антителом используется для определения концентрации одного из этих реагентов.

Антиген — вещество, способное вызывать биосинтез специфических антител (высокомолекулярные вещества — белки, полисахариды и т.д.).

Антигенная детерминанта функциональные группы на поверхности антигена.

Антитела — специфические антитела крови (иммуноглобулины).

Поликлональные антитела — гетерогенные по структуре активного центра и физико-химическим свойствам.

Моноклональные — гомогенные по специфичности и физико-химическим свойствам.

Гаптены — низкомодскулярные вещества, не способные вызывать образование антител, но приобретающие иммуногенные свойства после коньюгирования с высокомолекулярными носителями.

Антитела являются ключевым компонентом всех ИХМ, так как именно они в значительной степени определяют чувствительность и специфичность анализа. Антитела характеризуются наличием в своей структуре специфических антигенсвязывающих центров, которые способны с высокой специфичностью распознавать молекулы антигена и взаимодействовать с ними.

Антитела - иммуноглобулины, продуцируемые лимфоцитами млекопитающих в ответ на инородные вещества, введенные в организм. Этот биологический феномен был использован для введения определяемых веществ гиперчувствительным животным с последующим сбором сыворотки крови, содержащей специфичные к этим соединениям антитела. Антитела специфически связывают антигены, основываясь на молекулярной структуре антигена и пространственной ориентации молекул.

Качество антитела существенно влияет на чувствительность и специфичность анализа. Антитела будут игнорировать многие вещества, которые не похожи на антигены, но также будут связывать многие вещества, которые структурно родственны. Связывание структурно родственных веществ называется перекрестной реактивностью.

В зависимости от типа антител используют разных животных и разные методы иммунизации. Использование антител как природного инструмента распознавания и выделения анализируемого вещества имеет ряд преимуществ. Антитела легкодоступны, могут быть произведены в любом количестве и при небольших затратах. Для проведения ИХМ требуется настолько малое количество антител, что иммунной сыворотки, например, от одного кролика достаточно для определения аналита в более чем 5 млн проб.

Иммуноферментный анализ
Первой стадией в любом варианте ИФА является узнавание анализируемого соединения специфичным к нему антителом.

Вторая стадия — формирование связи меченного ферментом соединения со специфическим комплексом или свободными центрами связывания.

Последним обязательным этапом ИФА является трансформация ферментной метки в соответствующий сигнал, измеряемый различными физико-химическими методами. Эта стадия осуществляется реакцией фермента с субстратами.

В качестве ферментной метки используют пероксидазу (пероксидазу хрена), реже щелочную фосфатазу, иногда β-галактозидазу или глюкозооксидазу, способы детекции активности ферментов: СФМ, хемилюминесцентный и флуоресцентный методы.
Комментируя приведенную классификацию, необходимо отметить следующее.

1.Для количественной оценки образовавшихся иммунных комплексов существует два подхода:

• прямое измерение концентрации иммунных комплексов:

• определение концентрации оставшихся свободными, т.е. не вступивших в реакцию, антител или антигенов.

2. Классификацию методов ИФА можно осуществить также по типу реагентов, используемых на первой стадии анализа. Если присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и антитела), то метод является неконкурентным. Если на первой стадии анализа в системе одновременно присутствуют анализируемое вещество и его аналог (меченое ферментом или сорбированное на твердой фазе соединение), конкурирующие за имеющиеся центры специфического связывания, то метод называется конкурентным.

Принцип этого метода состоит в конкурентном взаимодействии меченого антигена и определяемого вещества за ограниченное число центров связывания специфических антител. Необходимым условием конкурентного метода является недостаток специфических центров связывания по отношению к суммарной концентрации анализируемою соединения и его аналога, так как в противном случае каждый процесс образования специфического комплекса может проходить независимо друг от друга, аследовательно, определяемая концентрация метки не будет зависеть от концентрации анализируемого соединения.

3. Другим принципом классификации методов ИФА является их разделение по типу реакций, проводимых на каждой из иммунохимических стадий. В соответствии с этим все методы можно разделить на две группы: гомогенные и гетерогенные (рис. 6-5). Если в ходе анализа все стадии, включая ферментативную, проходят в растворе, то метод является гомогенным. В нем отсутствует стадия разделения иммунохимических комплексов и свободных компонентов. Определение концентрации анализируемого соединения основано на эффекте изменения каталитической активности фермента-метки, возникающем при комплексообразовании с исследуемым лигандом или центрами специфического связывания.