Развитие атомной микроскопии. Перспективы
История развития
Развитие микробиологии, как науки, изучающей строение, жизнедеятельность и экологию микроорганизмов, невозможно представить без микроскопических методов исследования. В микробиологии оптическая микроскопия является бесспорным лидером среди всех методов визуализации в силу доступности, относительной простоты приготовления исследуемых образцов, а также возможности изучения биологических структур в близких к природным условиях. Слабой стороной оптических приборов является ограниченная дифракционным пределом разрешающая способность. Именно поэтому ультраструктуру микроорганизмов удалось изучить и описать лишь с появлением электронной микроскопии в 40е годы XX века. Однако, электронная микроскопия, до настоящего времени являющаяся единственным методом визуализации нанометрового разрешения, имеет целый ряд недостатков, главные из которых – сложность приготовления препаратов и необходимость проведения исследований в условиях высокого вакуума.
В 1981 году был изобретен сканирующий зондовый микроскоп, в основе работы которого лежит регистрация взаимодействия, возникающего между сенсором (зондом) и поверхностью образца при сканировании. Результатом сканирования является цифровое трехмерное изображение поверхности изучаемых структур с нанометровым латеральным и пространственным разрешением. В настоящее время существует целое семейство зондовых микроскопов, один из которых атомно-силовой микроскоп (АСМ), наиболее активно используется для изучения биообразцов микронного и субмикронного уровня организации благодаря простой процедуре пробоподготовки и возможности визуализации объектов практически в любой среде исследования.
Многочисленные исследования, проводимые в течение последних десятилетий, позволили переосмыслить возможности и раскрыть новые аспекты использования АСМ. Так АСМ уже является не просто методом визуализации, а нанотехнологическим инструментом, позволяющим манипулировать отдельными атомами, исследовать межмолекулярные силы взаимодействия, а также картировать физико-химические и иные свойства поверхности отдельных молекул и микроорганизмов.
Принцип работы АСМ
Принцип действия атомно-силового микроскопа заключается в сканировании поверхности образца атомарно острой иглой (зондом), расположенной на конце упругой консоли, именуемой кантилевером. Силы взаимодействия, возникающие между поверхностью исследуемого образца и зондом при их сближении, приводят к изгибу консоли. Передвижение иглы по трем координатам осуществляется прецизионным пьезоэлектрическим двигателем. Деформацию консоли обычно регистрируют с помощью оптической системы, состоящей из лазера, излучение которого падает на тыльную зеркальную сторону кантилевера, и четырехсегментного фотодетектора, на который падает отраженный луч. Любые возвышенности или впадины, встречающиеся на пути поступательно движущейся иглы, вызывают изгиб кантилевера, что приводит к отклонению луча. Регистрируемая таким образом величина изгиба в процессе сканирования позволяет формировать трехмерный рельеф поверхности образца в режиме реального времени. Разрешающая способность данного метода составляет примерно 0,1–1 нм по горизонтали и 0,01 нм по вертикали.
Режимы работы АСМ
В зависимости от расстояния между иглой и образцом, различают контактный, бесконтактный и полуконтактный режимы работы атомно-силового микроскопа.
При контактном режиме расстояние от иглы до образца составляет порядка нескольких десятых нанометра. В этом случае доминирующими являются силы отталкивания, приводящие к изгибу кантилевера.
В бесконтактном режиме (режиме притяжения) кантилевер с помощью пьезокристалла колеблется над изучаемой поверхностью с амплитудой 5 нм, превышающей расстояние между зондом и поверхностью. По изменению амплитуды или сдвигу резонансной частоты колебаний в ходе сканирования поверхности определяется сила притяжения и формируется изображение поверхности.
В полуконтактном режиме, называемом иногда режимом постукивания, кантилевер также совершает вынужденные колебания, но уже с гораздо большей амплитудой
100 нм, при этом слегка касаясь поверхности образца в нижней точке своих колебаний.
Исследование бактериальных клеток
Благодаря своим возможностям, АСМ может быть использован для комплексной оценки состояния бактериальных клеток в различных условиях и при действии различных экологических факторов. Так, например, исследование штаммов Bifidobacterium и Lactobacillus позволило выявить изменения морфологических характеристик в зависимости от используемой среды культивирования1. Известно, что для большинства бактерий характерна вариация формы и размеров в зависимости от фазы роста культуры. При исследовании особенностей процесса старения спорообразующих микроорганизмов Bacillus cereus методом АСМ, на различных этапах их жизненного цикла было продемонстрировано изменение как размерных характеристик, так и упругости, и шероховатости клеточной стенки2. Длительное культивирование сопровождалось сокращением доли жизнеспособных клеток в популяции и появлением морфологически дифференцированных форм покоя – спор. Физиологические перестройки в микроорганизмах, возникающие при воздействии абиотических стрессовых факторов, отражаются в изменениях их морфологии и, поэтому, легко могут быть обнаружены с помощью АСМ. Так на примере клеток Azotobacter chroococcum продемонстрировано изменение размеров и структурированности поверхности в зависимости от величины и времени теплового воздействия3.
Актуальными являются исследования микроорганизмов, подвергнутых действию таких биогенных факторов как антибиотики, ввиду возрастающей глобальной проблемы антибиотикорезистентности. Совершенствование техники и программного обеспечения зондовых микроскопов позволяет в автоматическом режиме выполнять измерения и обрабатывать множества силовых кривых в разных точках сканирования и формировать по полученным результатам изображение, соответствующее распределению локальных значений модуля Юнга или адгезионных сил по сканируемой поверхности. Подобный метод, именуемый методом силового картирования4, был использован для выявления действия четырех антибиотиков (изониазид, этионамид, этамбутол, стрептомицин) на возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота Mycobacterium bovis. Использовался зонд, к поверхности которого были химически привиты углеводородные цепи. Такой кантилевер показывал большее значение адгезии на гидрофобных поверхностях. Было обнаружено, что поверхность клеток M. bovis после обработки антибиотиками становится более гидрофильной, что указывает на разрушение внешнего гидрофобного слоя, состоящего из миколовых кислот, и приводит к росту шероховатости поверхности и увеличению адгезии гидрофобного кантилевера. Указанный подход можно использовать и для выявления расположения сайтов связывания антибиотиков с поверхностью бактериальных клеток.
Заключение
С момента своего возникновения, методы атомно-силовой микроскопии смогли прочно занять важное место в ряду традиционных исследовательских подходов к изучению биологических объектов. Гибкость методик АСМ позволяет находить все новые и новые приложения в биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии. Бесспорны преимущества использования АСМ и в микробиологических исследованиях – нанометровая визуализация в воздушной и жидкой средах в сочетании с качественно новой информацией о механических и поверхностных свойствах, предоставляемой при использовании спектроскопических методик, делают его неоценимым в решении ряда задач. К настоящему времени АСМ успешно применяется для диагностики и быстрой количественной оценки вирусных частиц, идентификации микроорганизмов, исследования влияния различных веществ на жизнедеятельность клеток, визуализации и контроля образования специфических комплексов, контроля размеров, структуры и стабильности различных наноструктур, использующихся для доставки лекарственных средств, визуализации единичных биомолекул и многих других разнообразных задач.
Отмечая достоинства, необходимо упомянуть и о недостатках метода, к которым относят ограниченный размер поля сканирования (в лучшем случае составляет порядка 150×150 мкм), небольшой перепад высот (несколько микрометров) изучаемой поверхности и низкую, по сравнению с растровым электронным микроскопом, скорость сканирования, которая на сегодняшний день достигла 10 кадров в секунду. Очевидно, что совершенствование существующих и разработка новых методик сканирующей микроскопии позволит уже в ближайшем будущем следить за трансформациями, происходящими в биосистемах на атомарном разрешении и в режиме реального времени.
1 Цинберг М.Б., Дерябин Д.Г., Денисова И.В., Никиян А.Н. Ростовые и морфологические характеристики производственных штаммов Bifidobacterium и Lactobacillus при использовании гидролизатно-молочной и гидролизатно-соевой сред // Антибиотики и химиотерапия. – 2003. – Т. 48. – №12. – С. 9–13.
2 Васильченко А.С., Яруллина Д.Р., Никиян А.Н., Тесля А.В. Морфофункциональные характеристики бактерий Bacillus cereus на различных этапах жизненного цикла // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2012. – №10. – С. 66–71.
3 Олюнина Л.Н., Мацкова Ю.А., Гончарова Т.А., Гущина Ю.Ю. Оценка терморезистентности Azotobacter chroococcum методом атомно-силовой микроскопии // Прикладная биохимия и микробиология. – 2009. – Т. 45. – №1. – С. 45–50.
4 Филонов А., Яминский И. Обработка и анализ данных в сканирующей зондовой микроскопии: алгоритмы и методы // Наноиндустрия. – 2007. – №2. – С. 32–34
|
Скачать 24.57 Kb.