|
|
жоспар. Жоспар І Кіріспе ІІ Негізгі бөлім 1. Жоспар і кіріспе іі негізгі блім А. Полимеразалы тізбекі реакция . Птр ге ажетті компоненттер Б. Птр ды сатылары В. Птрды р трлілігі Г
Жоспар І Кіріспе ІІ Негізгі бөлім А. Полимеразалық тізбекі реакция Ә. ПТР- ге қажетті компоненттер Б. ПТР - дың сатылары В. ПТР-дың әр түрлілігі Г. ПТР - дың мәні ІІІ Қорытынды VІ Пайдаланған әдебиеттер тізімі
Дезоксиринбонуклеин қышқылы (ДНҚ) -тірі организмдердің қызметету туралы генетикалық ақпараттардың іске асырылуын және ұрпақтанұрпаққа берілуін, сақталуын қамтамасыз ететін нуклеиндік қышқылдардыңекі түрінің бірі болып табылады. Талшықтағы ДНҚ-ның негізгі рөлі РНҚжәне ақуыздардың құрылымы туралы ақпараттарды ұзақ уақыт сақтау.Химиялық тұрғыдан алғанда ДНҚ - бұл мономер-нуклеотидтердентұратын полимер. Әрбір нуклеотид азот негізінен, қанттан (дезоксирибоз)және фосфант топтардан тұрады. ДНҚ-да азот негіздерінің төрт түрі ( аденин, гуанин, тимин және цитозин) кездеседі. Нуклеотидтар арасындағы байланыс дезоксирибоз және фосфат топтары есебінен құралады. Көпшілік жағдайда ДНҚ бір-біріне азот негіздерімен болжамданған екі тізбектен тұрады. Тізбектердің бірінің азот негіздері келесі тізбектің азот негіздерімен сутегі байланыстарымен байланысқан, комплемантарлық принципке сәйкес аденин тек тиминмен, гуанин тек цитонинмен байланысады. Бұл қос тізбекті молекула спиралды түрде байланысқан. Бұл ретте тізбектер антипарарллель болып табылады, яғни бір тізбектің 5-шеткі ұшы келесі тізбектің 3-шеткі ұшына қарсы орналасады. Нуклеотидтардың кезектілігі РНҚ-ның тҥрлі типтері туралы мәліметтерді кодтауға мҥмкіндік береді, олардың ішінде аса маңыздысы ақпараттық, немесе матрикалық (мРНҚ), рибосомалық (рРНҚ) және көліктік (тРНҚ) болып табылады. РНҚ осы барлық түрлері ДНҚ матрицасында РНҚ кезектілігінде ДНҚ кезектілігін көшіру есебінен синтезделеді. ДНҚ кезектілігі жазбасының жалпы қабылданған нысаны 5-тен 3- шетіне дейінгі нуклеотидтер жазбасы болып табылады. ДНҚ қыздыру кезінде су текті байланыстар жарылады және қосарлы спиралдағы жіптер ажырайды. Қыздыру процессі ДНҚ қызуы деп аталады, бұл ретте А-Т және Т-Ц жұптары арасындағы байланыс бұзылады. ДНҚ А- Т жұбы қаншалықты көп болса, бір-бірімен байлау жіптерінің мықтылығы аз болғандықтан, ДНҚ еріту жеңіл болады. Полимеразды тізбекті реакция (ПТР) - ДНҚ тұтас фрагментінің көп қырлы ферментативті ампликациясына, биологиялық материалдағы анықталатын нуклеин қышқылдарындағы (ДНҚ) аз концентрациялы фрагменттердің айтарлықтай ұлғайтылуын қамтамасыз ететін молекулярлық биологиядағы эксперименталды әдіс. Полимеразды тізбекті реакцияны 1983 жылы американ ғалымы Кэри Мюллис ойлап тапты. Ол кейіннен осы еңбегі үшін Нобель сыйлығын алды. ПТР әдісі негізіне зерттеуші таңдап алған ДНҚ бөлігінің көп қырынан қосарлану алынды. Нәтижесінде көзбен детекциялауға жеткілікті ДНК көлемі жасалады. ДНҚ амплификациялаудан басқа ПТР нуклеин қышқылдары мен көптеген басқа да әрекеттерді (мутацияны енгізу, ДНҚ фрагменттерін өсіру) жүргізуге мүкіндік береді және биологиялық және медициналық практикада кеңінен қолданылады. ПТР өткізу үшін, микорценртлік приборкаға ДНҚ-матрицаны, нуклеотиды,ДНҚ полимеразы, ферменттерге арналған буферді араластырады. Бұл реакция су ерітіндісінде жүргізіледі. Полимераздық тізбектік реакция әдісі (ПТР) соңғы кездерде молекулалық биологияда, генетикада, экологияда, медицинада әр алуан мәселелерді шешу үшін кеңінен қолданылады. Бұл әдіс локустардағы ДНҚ полиморфизмін анықтауға, ДНҚ және РНҚ фрагменттерін клондауға, генетикалық карта құруға қолданылады. Полимераздық тізбектік реакцияның екі негізгі нұсқасы бар:1 ПТР туынды праймерлермен мысалы, RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA), АР- РСR (Arbitrarily Primed PCR) немесе DAF (DNA Amplification Fingerpriming) маркеры; 2 ПТР арнайы праймерлер қолданумен (ұзындығы 20-27 нуклеотидтер), белгілі нуклеотидті тізбекке құрылған: STS (Sequenасе Tagged Sites) маркерлер ;Реакция компоненттеріПТР-ды ең қарапайым жағдайда жасау үшін келесі компоненттер керек болады: * Амплификация жасалатын ДНҚ үлескісі бар ДНҚ-матрица * Талап етілетін ДНҚ фрагменті әр түрлі тізбектерінің ұштарына комплиментарлы екі праймер * Жоғары температураға тұрақты ДНҚ-полимераза - ДНҚ полимеризациясын катализдейтін фермент. * Дезоксирибонуклеозидтрифосфаттар (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) * Полимеразаның қызметіне қажетті Mg2+ иондары * Реакцияға қажетті жағдайларды (pH, ерітіндінің иондық күші) қамтамасыз ететін буферлік ерітінді. Праймерлер - бұл ДНҚ-ның бірцепті шағын ферментері, матрицаның түрлі цептерінің коплементарды бөлігі, бірі-бірінен алыс емес қашықтықта орналасқан . Праймерлерге негізгі талаптар * Праймерлер ұзындықтары 18-30 нуклеотидтерден GC құрамы 45-55%, матрица құрамындағы GC санына жақын болуы керек * Праймерлердің жабысуы t 5 ° C жоғары болмауы керек * -димердің, қайталанудың, екіншілік құрылымның болмауын; * -ПЦР өнімнің өлшемі 200-600 мкм арасында болуыLeptospira interrorgans генінен алынған праймерлердің сипатамасыTaq полимераза E coli штамынан бөлінген рекомбинатты фермент . Агароза -- полисахаридтер тізбегі, агардың бейтарап құрауышы, кезектесе орналасқан β-D-галактопиранозалардың және 3,6-ангидридо-α-1-галактопиранозала рдың қалдықтарынан тұрады. Биополимелердің сірне-электрофорезі мен сірне хроматографиясында тасымалдаушы ретінде қолданылады. Агароза лабораториялық зерттеулерде гель жасау үшін қолданылады. Трис ацетоттық буфер - TAE буфері - ерітінді. Бұл гель молекулярлы биологияда нуклеин қышқылдарының фрагменттерін бөлу үшін элетрофорезде қолданылады.50 краттық ТАЕ буферін дайындау үшін қажетті компонеттерТрис 24,22 гЭДТА тұзы 1,862 гСірке қышқылы 8,96 млН₂ О (дистелденген )73,3 гТАЕ буфері қолданылады:-Электрофорез жүргізу үшін -ДНҚ өнімдерін талдау үшін-ДНҚ үзінділерін бөлу үшін Электрофорездің түрлері. Электрофорез - ДНҚ фрагменттерін көлемге (фрагменттің ұзындығына) бөлу мүмкіндігін беретін аналитикалық әдіс. Электрофорездің екі түрі бар: агароздық гель электрофорезі және полиакриламидті гель электрофорезі. ДНҚ-ны фрагменттердің ұзындығы бойынша бөлу үшін екі түрді де қолайлы. Алайда агарозды гельде тек ірі ДНҚ үзінділері 50 базалық будан және 10 000 базалық жұптан бастап тиімді бөлуге болады Агарозды бөлудің оңтайлы өлшемі 500-ден 5000 базалық жұптарға тең. Полиакриламидті гельде тек кішкене фрагменттерді бөлуге болады - 10-нан 1000-ға дейінгі базалық жұптарға, үзінділердің оңтайлы диапазоны 50-ден 200 базалық жұптарға дейін. Полиакриламидті гельдегі фрагменттерді бөлудің дәлдігі өте жоғары, 1-нуклеотидтің сезімталдығына (мысалы, 200 және 201 базалық жұптың үзінділері) жетуге жеткілікті ұзын үзінділері бар. Aгароздық гелі 1 нуклеотид айырмашылығы бар бөліктерді ажыратуға мүмкіндік бермейді. Бірнеше базалық жұптардан (Метафор агарозасы) ерекшеленетін үзінділерді ажырататын агароздың ерекше түрлерін шығаратын фирмалар бар.ПТР - сы ондаған циклдардан құралады, әр қайсысы үш сатыны шығарады. Бірінші саты - ДНҚ-нің денатурациясы. Ол реациялық сместердің +93, +95 градуста қызығанда пайда болады. Бұл этапта азоттық негіздер арасындағы су байланыстары бұзылады. Тізбек ізі бойынша ДНҚ айналасында бір-бірін ұстауды тоқтатады. Екінші саты - праймерлердің жануы. Отжиг Праймерлердің маңызды сипаттамасы - праймер-матрица комплексінің құбылысының температурасы (t). Ол температура ретінде жартысы бос болмауымен анықталады. T мына формуламен анықтауға болады: t=2 А+Т)+4(G+С). егер праймер қысқа болса, t аз болса, онда праймер басқа матрицалық ДНҚ аймағына жайлап ауысады, ал ол спецификалық емес өнімдердің пайда болуына әкеп соғады. Жоғарыда температура полимераза оптимумымен өлшенеді. Үшінші саты - элонгация (ДНҚ тізбектерінің ұзаруы). Праймермен гибридизацияның матрицасынан кейін соңғы матрицалардың тізбектерінің қорытындысына әкеледі Полимеразаны тізбекті реакцияның бір циклінде фрагменттердің көлемі 2 есе ұлғаяды. ... жалғасы
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Ұқсас жұмыстар
|
|
| |
|
|
Скачать 22.55 Kb.