ферменты. Классификация и номенклатура ферментов. Характеристика классов. Шифр ферментов. Примеры
 Скачать 0.87 Mb.
|
|
Рис. 2-29. Внутриклеточная локализация ферментов. 1. Регуляция количества молекул фермента в клетке Известно, что белки в клетке постоянно обновляются. Количество молекул фермента в клетке определяется соотношением 2 процессов - синтеза и распада белковой молекулы фермента:  Синтез и фолдинг белка - многостадийный процесс. Регуляция синтеза белка может происходить на любой стадии формирования белковой молекулы. Наиболее изучен механизм регуляции синтеза белковой молекулы на уровне транскрипции, который осуществляется определёнными метаболитами, гормонами и рядом биологически активных молекул (см. раздел 4). Что касается распада ферментов, то регуляция этого процесса менее изучена. Можно только предполагать, что это не просто процесс протеолиза (разрушения белковой молекулы), а сложный механизм, возможно, определяемый на генетическом уровне. 2. Регуляция скорости ферментативной реакции доступностью молекул субстрата и коферментов Важный параметр, контролирующий протекание метаболического пути, - наличие субстратов, и главным образом - наличие первого субстрата. Чем больше концентрация исходного субстрата, тем выше скорость метаболического пути. Другой параметр, лимитирующий протекание метаболического пути, - наличие регенерированных коферментов. Например, в реакциях дегидрирования коферментом дегидрогеназ служат окисленные формы NAD+, FAD, FMN, которые восстанавливаются в ходе реакции. Чтобы коферменты вновь участвовали в реакции, необходима их регенерация, т.е. превращение в окисленную форму. 3. Регуляция каталитической активности ферментов Важнейшее значение в изменении скорости метаболических путей играет регуляция каталитической активности одного или нескольких ключевых ферментов данного метаболического пути. Это высокоэффективный и быстрый способ регуляции метаболизма. Основные способы регуляции активности ферментов: аллостерическая регуляция; регуляция с помощью белок-белковых взаимодействий; регуляция путём фосфорилирования/дефосфорилирования молекулы фермента; регуляция частичным (ограниченным) протеолизом. Аллостерическая регуляция Аллостерическими ферментами называют ферменты, активность которых регулируется не только количеством молекул субстрата, но и другими веществами, называемыми эффекторами. Участвующие в аллостерической регуляции эффекторы - клеточные метаболиты часто именно того пути, регуляцию которого они осуществляют. Роль аллостерических ферментов в метаболизме клетки. Аллостерические ферменты играют важную роль в метаболизме, так как они чрезвычайно быстро реагируют на малейшие изменения внутреннего состояния клетки. Аллостерическая регуляция имеет большое значение в следующих ситуациях: при анаболических процессах. Ингибирование конечным продуктом метаболического пути и активация начальными метаболитами позволяют осуществлять регуляцию синтеза этих соединений; при катаболических процессах. В случае накопления АТФ в клетке происходит ингибирование метаболических путей, обеспечивающих синтез энергии. Субстраты при этом расходуются на реакции запасания резервных питательных веществ; для координации анаболических и катаболических путей. АТФ и АДФ - аллостерические эффекторы, действующие как антагонисты; для координации параллельно протекающих и взаимосвязанных метаболических путей (например, синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, используемых для синтеза нуклеиновых кислот). Таким образом, конечные продукты одного метаболического пути могут быть аллостерическими эффекторами другого метаболического пути. Аллостерические эффекторы.Эффектор, вызывающий снижение (ингибирование) активности фермента, называют отрицательным эффектором, или ингибитором. Эффектор, вызьгоаюший повышение (активацию) активности ферментов, называют положительным эффектором, или активатором. Аллостерическими эффекторами часто служат различные метаболиты. Конечные продукты метаболического пути - часто ингибиторы аллостерических ферментов, а исходные вещества - активаторы. Это так называемая гетеротропная регуляция. Такой вид аллостерической регуляции очень распространён в биологических системах. Более редкий случай аллостерической регуляции, когда сам субстрат может выступать в качестве положительного эффектора. Такая регуляция называется гомотропной (эффектор и субстрат - одно и то же вещество). Эти ферменты имеют несколько центров связывания для субстрата, которые могут выполнять двойную функцию: каталитическую и регуляторную. Аллостерические ферменты такого типа используются в ситуации, когда субстрат накапливается в избытке и должен быстро преобразоваться в продукт. Выявить ферменты с аллостерической регуляцией можно, изучая кинетику этих ферментов. Эти ферменты не подчиняются законам Михаэлиса-Ментен, они имеют характерную S-образную кривую зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. Особенности строения и функционирования аллостерических ферментов: обычно это олигомерные белки, состоящие из нескольких протомеров или имеющие доменное строение; они имеют аллостерический центр, пространственно удалённый от каталитического активного центра; эффекторы присоединяются к ферменту нековалентно в аллостерических (регуляторных) центрах; аллостерические центры, так же, как и каталитические, могут проявлять различную специфичность по отношению к лигандам: она может быть абсолютной и групповой. Некоторые ферменты имеют несколько аллостерических центров, одни из которых специфичны к активаторам, другие - к ингибиторам. протомер, на котором находится аллостерический центр, - регуляторный протомер, в отличие от каталитического протомера, содержащего активный центр, в котором проходит химическая реакци аллостерические ферменты обладают свойством кооперативности: взаимодействие аллостерического эффектора с аллостерическим центром вызывает последовательное кооперативное изменение конформации всех субъединиц, приводящее к изменению конформации активного центра и изменению сродства фермента к субстрату, что снижает или увеличивает каталитическую активность фермента (рис. 2-30); регуляция аллостерических ферментов обратима: отсоединение эффектора от регуляторной субъединицы восстанавливает исходную каталитическую активность фермента; аллостерические ферменты катализируют ключевые реакции данного метаболического пути.  Рис. 2-30. Схема, поясняющая работу аллостерического фермента. А - действие отрицательного эффектора (ингибитора); Б - действие положительного эффектора (активатора). Локализация аллостерических ферментов в метаболическом пути. Скорость метаболических процессов зависит от концентрации веществ, использующихся и образующихся в данной цепи реакций. Такая регуляция представляется логичной, так как при накоплении конечного продукта он (конечный продукт) может действовать как аллостерический ингибитор фермента, катализирующего чаще всего начальный этап данного метаболического пути:  Фермент, катализирующий превращение субстрата А в продукт В, имеет аллостерический центр для отрицательного эффектора, которым служит конечный продукт метаболического пути F. Если концентрация F увеличивается (т.е. вещество F синтезируется быстрее, чем расходуется), ингибируется активность одного из начальных ферментов. Такую регуляцию называют отрицательной обратной связью, или ретроингибировани-ем. Отрицательная обратная связь - часто встречающийся механизм регуляции метаболизма в клетке. В центральных метаболических путях исходные вещества могут быть активаторами ключевых ферментов метаболического пути. Как правило, при этом аллостерической активации подвергаются ферменты, катализирующие ключевые реакции заключительных этапов метаболического пути:  В качестве примера можно рассмотреть принципы регуляции гликолиза - специфического (начального) пути распада глюкозы (рис. 2-31). Один из конечных продуктов распада глюкозы - молекула АТФ. При избытке в клетке АТФ происходит ретро-ингибирование аллостерических ферментов фосфофруктокиназы и пируваткиназы. При образовании большого количества фруктозо-1,6-бисфосфата наблюдают аллостерическую активацию фермента пируваткиназы. Регуляция каталитической активности ферментов белок-белковыми взаимодействиями.Некоторые ферменты изменяют свою каталитическую активность в результате белок-белковых взаимодействий. Рассмотрим 2 механизма активации ферментов с помощью белок-белковых взаимодействий: активация ферментов в результате присоединения регуляторных белков; изменение каталитической активности ферментов вследствие ассоциации или диссоциации протомеров фермента. Активация ферментов в результате присоединения регуляторных белков. Этот тип регуляции можно рассмотреть на примере активации фермента аденилатциклазы, локализованной в плазматической мембране клетки. Активный центр аденилатциклазы локализован на цитоплазматической стороне плазматической мембраны. Активированная аденилатциклаза катализирует реакцию образования из АТФ циклического 3',5'-АМФ (цАМФ) - вторичного, внутриклеточного посредника действия гормонов (см. схему ниже). В мембране аденилатциклаза функционирует в комплексе с другими белками: рецептором гормона, выступающего во внеклеточную среду и взаимодействующего с гормонами; с G-белком, занимающим промежуточное положение между рецептором и ферментом аденилатциклазой. G-белок - олиго-мерный белок, состоящий из 3 субъединиц - α, β, γ. α-Субъединица имеет центр связывания и расщепления ГТФ. Поэтому этот белок называется ГТФ-связывающим белком, или G-белком; в результате связывания гормона с рецептором происходит изменение конформа-ции G-белка, уменьшение его сродства к молекуле ГДФ, с которой он связан в отсутствие гормонального сигнала, и увеличение сродства к ГТФ. Присоединение ГТФ вызывает конформационные изменения в G-белке и диссоциацию его на субъединицы: субъединицу α, связанную с ГТФ (α-ГТФ), димер βγ; α-ГТФ имеет высокое сродство к аденилатциклазе, его присоединение приводит к активации последней, поэтому α-ГТФ - регуляторный белок, а данный механизм активации аденилатциклазы называют активацией ферментов в результате присоединения регуляторных белков (рис. 2-32). Регуляция каталитической активности ферментов ассоциацией/диссоциацией протомеров Протеинкиназы - группа ферментов, катализирующих перенос остатка фосфорной кислоты с АТФ на специфические ОН-группы аминокислотных остатков белков (вызывают фосфорилирование белков). Механизмы активации различных протеинкиназ неодинаковы. В качестве примера регуляции каталитической активности ферментов ассоциацией или диссоциацией протомеров можно привести регуляцию активности фермента Протеинкиназы А.  Рис. 2-32. Регуляция активности аденилатциклазы. Гормон (Г), взаимодействуя с рецептором (R) на поверхности клеток, приводит к уменьшению сродства ГТФ-связывающего белка (G-белка, состоящего из протомеров α, β, γ) к ГТФ и увеличению сродства к ГТФ. Присоединение молекулы ГТФ к активному центру G-белка вызывает диссоциацию комплекса на субъединицы α-ГТФ и димер βγ. Комплекс α-ГТФ активирует аденилатциклазу, что способствует синтезу из АТФ внутриклеточных регуляторных молекул цАМФ. АЦ - аденилатциклаза, ПКА - протеинкиназа А, Рi - Н3РО4. Регуляция каталитической активности путем фосфорилирования/дефосфорилирования В биологических системах часто встречается механизм регуляции активности ферментов с помощью ковалентной модификации аминокислотных остатков. Быстрый и широко распространённый способ химической модификации ферментов - фосфорилирование/дефосфорилирование. Модификации подвергаются ОН-группы фермента. Фос-форилирование осуществляется ферментами протеинкиназами, а дефосфорилирование- фосфопротеинфосфатазами. Присоединение остатка фосфорной кислоты приводит к изменению конформации активного центра и его каталитической активности. При этом результат может быть двояким: одни ферменты при фосфорилировании активируются, другие, напротив, становятся менее активными (рис. 2-33). Изменение активности фермента, вызванное фосфорилированием, обратимо. Отщепление остатка фосфорной кислоты осуществляется ферментами фосфопротеинфосфатазами. Активность протеинкиназ и фосфопротеинфосфатаз регулируется гормонами, что позволяет быстро изменять активность ключевых ферментов метаболических путей в зависимости от условий внешней среды. Антагонистичные по функции гормоны противоположным образом влияют на фосфо-рилирование/дефосфорилирование ферментов, вызывая противоположные эффекты изменения метаболизма клетки. Например, под действием глюкагона (в период между приёмами пищи) в клетках происходит уменьшение синтеза энергетического материала - жира, гликогена и усиление его распада (мобилизация), вызванного фосфо-рилированием ключевых ферментов этих процессов. А под действием инсулина (во время пищеварения), наоборот, активируется синтез гликогена и ингибируется его распад, так как взаимодействие инсулина с рецептором активирует сигнальный путь, приводящий к дефосфорилированию тех же ключевых ферментов. Регуляция каталитической активности ферментов частичным (ограниченным) протеолизом Некоторые ферменты, функционирующие вне клеток (в ЖКТ или в плазме крови), синтезируются в виде неактивных предшественников и активируются только в результате гидролиза одной или нескольких определённых пептидных связей, что приводит к отщеплению части белковой молекулы предшественника. В результате в оставшейся части белковой молекулы происходит конформационная перестройка и формируется активный центр фермента. 3. Применение ферментов в медицине. Энзимотерапия. Наибольший вклад современная медицинская энзимология вносит в области: • энзимопатологии, • энзимодиагностики, • энзимотерапии. Ферментопатии. Достижением энзимологии является установление в качестве первопричины ряда заблеваний нарушение синтеза ферментов (ферментопатий). Различают ферментопатии наследственные, в основе лежит генетический дефект синтеза определённого фермента (к такого рода заболеваниям относят гликогенозы и агликогенозы, связанные с дефицитом ферментов распада и ресинтеза гликогена); некоторые виды гемолитических анемий (недостаток глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы, глутатмонредуктазы эритроцитов); фенилпировиноградная олигофрения вследствии дефекта синтеза фенилаланингидроксилазы; приобретенные: 1. Токсические (избирательное угнетение отдельных ферментных систем различными ядами. токсинами); 2. алиментарные (вследствие недостатка в суточном рационе белка, минеральных веществ, гипо- и авитаминзов); Энзимодиагностика ферментам принадлежит большая роль в диагностике заболеваний. Особое значение имеет изучение ферментного состава крови и других биологических жидкостей. Понижение или повышение активности ферментов крови, а также появление в крови ферментов, отсутствующих в ней в норме, служат объективным диагностическим критерием патологических изменении. Достоинства ферментодиагностики: • высокая специфичность; • возможность выявления отклонений на ранних, нередко на доклинических стадиях заболевания. Определение активности ферментов в биологических жидкостях в настоящее время является обязательным компонентом диагностики: • инфаркта миокарда (креатинкиназа, лактатддегидрогеназа и их изоформы); • заболеваний поджелудочной железы (амилаза сыворотки крови и мочи); • патологии печени (аланинаминотрансфераза аспартатаминотрансфераза лактатддегидрогеназа и их изоформы , щелочная фосфатаза. Y-глутамилтрансфераза); • ведённых гемолитических анемий (глюкозо-б-фосфатдегидрогеназа. глутатонредуктаза); • патологии мозга (изоферменты креатинкиназы) • в оценке риска применения дитилина, листенона - миорелаксантов деполяризующего типа действия (холинэстераза сыворотки) 3.9.23. Специфические ферментативные методы количественного ксличественнзго определения определения метаболитов Диагностическая роль ферментов ещё больше возрастает в связи с разработкой специфических ферментативных методов количественного определения важнейших метаболитов биологических жидкостей. Применяются: • глюкозооксидаза (определение глюкозы); • уреаза (определение мочевины); • лактатдегидрогеназа (определение молочной и пировино- традной кислот); • алкогольдегидрогеназа (определение этанола). Иммуноферментный анализ. Принцип. область применения Одним из наиболее часто используемых методов в клинической и экспериментальной биохимии, вирусологии, микробиологии, иммунологии, ветеринарии, контроле технологии производства в медицинской и микробиологической промышленности, охране окружающей среды является в настоящее время иммуноферментный анализ (ИФА), в котором ферменты также выступают в качестве неотъемлемого компонента тест-системы. Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу коньюгата (антивидовото иммуноглобулина, меченного ферментом). Фермент вызывает разложение хромогеного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо фотометрически. Существует множество вариантов постановки ИФА. из которых наибольшее практическое значение получил гетерогенный твердофазный иммуноферментный анализ. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Самым распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция – процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также с помощью образования водородных связей присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые вые планшеты или полистироловые шарики. Для ферментативной метки конъюгата могут быть применены разнообразные ферменты: поероксидаза хрена, щелочная фосфатза, бета-галактозидаза, глюкозооксидаза. Широкое использование стандартной конфигурации 96-луночного планшета позволило унифицировать оборудование, необходимое для проведения иммуноферментного анализа. Принципиальная схема твердофазного неконкурентного иммуноферментного анализа состоит их нескольких стадий. Стадия 1. Специфические антигены пришиты к пластику лунок планшета. В лунку добавляется исследуемая сыворотка, и если в ней есть антитела (эти антитела называются первыми) к данным антигенам, во время инкубации происходит взаимоузнавание, в результате которого образуется принципиально значимая связь антиген/антитело . Стадия 2. После отмывки лунок от не связавшихся (а значит неспецифичных) субстанций в каждую лунку добавляются так называемые вторые антитела. Они узнают человеческие антитела определенного типа (IqA, IqG, IqM). К этим вторым антителам химически пришит активный фермент. Такое комплексное соединение называется конъюгат. Во время инкубации происходит взаимоузнавание первых и вторых антител, в результате чего в лунке образуется структура типа«сэндвич. Стадия 3. После отмывки не связавшегося конъюгата в лунку добавляется бесцветный субстрат, на который действует фермент . В результате субстрат превращается в окрашенный продукт. Количество окрашенного продукта измеряется на фотометре при определенной длине волны. Таким образом, количество цветного продукта прямо пропорционально количеству фермента в лунке, а значит и количеству конъюгата в «сэндвиче». Количество конъюгата прямо пропорционально тому количеству комплекса антиген — антитело, которое получается на стадии 1 ИФА. Следовательно, измерение развившейся цветной реакции на стадии З точно коррелирует с наличием специфических антител в анализируемой сыворотке. Время проведения анализа от 1-гo до 3-х часов. В клинико-диагностических лабораториях иммуноферментный анализ применяется для следующих целей: - диагностика инфекционных и паразитарных заболеваний: - диагностика ин токсоплазмоза, герпеса, хламидиаза, трихомониаза, вирусов гепатитов С и В), коревой краснухи, лямбиоза, микоплаз- ВИЧ-инфекции. - определение содержания гормонов и других биологически активных веществ: лютеинизирующий гормон, фолликулостимулирующий гормон, инсулин, пролактин, тестостерон, прогестерон, эстрадиол, кортизол, тиреотропный гормон, трийодтиронин, тироксин (Т4), определение цитокинов и др.; - диагностика ранних сроков беременности; - пренатальная диагностика пороков развития плода; - определение онкомаркеров: альфа-фетопротеина (для печени), раково-эмбриональный антиген (для кишечника), простатспецифический антиген, нейроспецифический антиген (маркер молочной железы), Ca-125 (для яичников). Энзимотерапия. Применение препаратов ферментов и их ингибиторов в клинической практике. Разработаны лекарственные формы ферментных препаратов. Широко распространена заместительная терапия заболеваний жеудочно-кишечного) тракта (фестал, панкреатин, мезим-форте). Протеазы (трипсин, химотрипсин) широко Лечении: • воспалительных заболеваний; • раневого процесса; • ожогов; • обструктивных состояний дыхательной системы. Ингибиторы протеаз (котрикал, гордокс. трасилол. ингитрил) занимает важное место в лечении деструктивных форм панкреатита, при чрезмерной активности системы фибринолиза; ингибиторы ангиотензииконвертирующего фермента (капотен эналаприл) - - в терапии артериальных гипертензий. З 9.4. Понятие об иммобилизованных ферментах иммобилизованных ферментов. Получение иммобилизованных ферментов (искусственно полученного комплекса фермента нерастворимым в воде носителем), значительно расширило сферу применения биокатализаторов. Различают иммобилизацию ковалентную и нековалентную (иммобилизацию физическими методами). Первый тип основан на ковалентном связывании фермента нерастворимым материалом или молекул фермента между собой с образованием нерастворимых полиферментных комплексов. Нековалентная иммобилизация включает: адсорбцию включение в гели, микроинкапсулирование; в данном случае отметается способность фермента диссоциировать на субъединицы с последующим переходом в раствор не связанных с носителем субъединиц и падением активности фермента. В этом случае приходиться прибегать к дополнительным способам стабилизации - иммобилизованных ферментов: • использованию «поперечно сшивающих» агентов с целью наложения межсубъединичных сшивок, вследствие чего фермент теряет способность к диссоциации; • включению ферментов в гели с подбором таких размеров ор, который был бы меньше размеров субъединиц фермента. При применении так называемой «мягкой» адсорбционнойиммобилизации , включающей предварительную обработку адсорбента липидами, изменяющими степень его гидрофобности, при последующей сорбции фермент связывается с «мягкой» поверхностью липидного слоя, а не с жесткой поверхностью адсорбента. Искусственно связанные с носителями, “иммобилизованные ферменты, сохраняющие свою каталитическую активность, отличаются повышенной термостабильностью и устойчивостью к протеиназам, а, следовательно, увеличением времени жизни и пролонгацией действия, антигенные свойства их значительно снижены. Ряд иммобилизованных ферментов с успехом применяется в: • использование тампонов, бинтов с иммобилизованными на них протеазами— для ускорения заживления ран и ожогов и предотвращения гнойных осложнений; • создание протезов кровеносных сосудов и сердечных клапанов из тромборезистентного материала на основе полимеров с иммобилизованными на них тромболитическими ферментами; • использование иммобилизованных терапевтических белков в экстракорпоральных реакторах (уреазы, фен илаланиламмиаклиазы — в лечении почечной недостаточности, фенилкетонурии). Вариант 12 1. В настоящее время известно более 2400 ферментов. Каждый фермент, как правило, имеет две номенклатуры; одна из них рабочая (тривиальная), а другая - систематическая. Рабочее наименоваие фермента составляют путем прибавления к корню слова латинского , греческого или химического названия субстрата, на который действует фермент, или к названию процесса, катализируемого данным ферментоа окончания “-аза”. Вещество, имеющее это окончание, принимают за фермент. Ферменты, действующие на крахмал (amylum), сахарозу, мочевину (urea), пептиды получили соответственно названия : амилаза, сахараза, уреаза,пептидаза; ферменты, катализирующие процессы гидролиза называют гидролазами, процессы окисления - оксидазами, перенос групп - трнсферазами и т.д. Для некоторых ферментов сохранены названия, неподчиняющиеся этому правилу: пепсин, трипсин, химотрипсин папин и др. В названии ряда ферментов указывают как характер субстрата, так и тип катализируемой реакции. Фермент, катализирующий отнятие водорода от спирта, называют алкогольдегирогеназа. Рабочим названием ферментов пользуются в повседневной практике. В 1961 г. Международная комиссия по ферментам, созданная в 1956 г., предложила новую схему номенклатуры и классификации ферментов, которая была принята Международным биохимическим союзом. Согласно этой схемы каждый фермент имеет как рекомендуемое (рабочее) название, так и систематическое название, которое составляется в определенном порядке и подчеркивает тип катализируемой реакции (см. классы ферментов). В принятой классификации все ферменты на основании катализируемых реакций разделены на шесть классов, расположенных в следующем порядке: 1) оксидоредуктазы, 2) трансферазы, 3) гидролазы, 4) лиазы, 5) изомеразы, 6) лигазы (синтетазы). Каждый класс подразделяется на подклассы, а каждый подкласс - на подподклассы. Индивидуальный фермент имеет кодовое число (шифр) со стоящими перед ним буквами КФ (англ. ЕС). Шифр каждого фермента содержит четыре числа, разделенных точками. Первое число указывает к какому из шести классов принадлежит данный фермент. Второе число обозначает подкласс. Третье число обозначает подподкласс, а четвертое - порядковый номер фермента в данном подподклассе. Например, фермент КФ.1.1.1.1 имеет рекомендуемое (рабочее) название алкогольдегидрогеназа, систематическое название алкоголь:НАД оксидоредуктаза. Этот фермент относится к классу оксидоредуктаз (1), действует на СН-ОН группу доноров (1.1), акцептором водорода служит НАД (1.1.1); четвертая цифра шифра - порядковый номер фермента в пределах подподкласса. Систематическое название и шифр фермента используют в научных публикациях при первом упоминании о нем; при дальнейшем изложении материала пользуются рекомендуемым (рабочим) названием. 2.Регуляция с помощью белок-белковых взаимодействий Некоторые ферменты изменяют свою каталитическую активность в результате белок-белковых взаимодействий. 2 механизма активации ферментов: 1. активация ферментов в результате присоединения регуляторных белков. Пример – активация аденилатциклазы, локализованной в плазматической мембране клетки. Активный центр аденилатциклазы локализован на цитоплазматической стороне плазматической мембраны. Активированная аденилатциклаза катализирует реакцию образования циклической АМФ из АТФ. В мембране аденилатциклаза функционирует в комплексе с другими белками (рецепторами гормонов, с G-белком – состоящим из 3-х субъединиц, α, β, γ. α-субъединица имеет центр связывания и расщепления ГТФ). Гормон, взаимодействуя с рецептором на поверхности клеток, приводит к уменьшению сродства ГТФ-связывающего белка (G-белка) к ГДФ и увеличению сродства к ГТФ. Присоединение молекулы ГТФ к активному центру G-белка вызывает диссоциацию комплекса на субъединицы α-ГТФ и димер βγ. Комплекс α-ГТФ активирует аденилатциклазу, что способствует синтезу из АТФ молекул цАМФ, аденилциклазы, протеинкиназы и фосфорной кислоты. 2. регуляция активности ферментов путем ассоциации-диссоциации протомеров. В тканях присутствуют ферменты, которые в неактивной форме представлены отдельными комплексами, состоящими из нескольких протомеров. При увеличении в клетке концентрации специфических регуляторных молекул они присоединяются к определенным центрам протомеров. Изменение их конформации, вызванное присоединением лигандов, повышает их сродство друг к другу и стимулирует ассоциацию, т.е. образование активной формы фермента. Регуляция путем фосфорилирования/дефосфорилирования фермента Широко распространенный способ химической модификации ферментов фосфорилирование/дефосфорилирование белков осуществляют ферменты протеинкиназы (класс трансферазы). Они катализируют образование сложноэфирной связи между фосфатной группой и ОН-группой аминокислотных остатков серина, треонина и тирозина. Донором фосфатной группы является АТФ. В результате фосфорилирования происходит изменение заряда, конформации фермента, конформации активного центра фермента. повышается сродство фермента к субстрату и возрастает скорость ферментативной реакции. Например – триацилглицерол-липаза (ТАГ-липаза) – внутриклеточный фермент жировой ткани. В дефосфорилированной форме фермент неактивен. Под действием специфической протеинкиназы А фермент фосфорилируется и переходит в активную форму. Для некоторых ферментов, обеспечивающих метаболизм глюкозы, холестерола, гликогена, фосфорилированная форма является неактивной. Например, фермент пируваткиназа, участвующая в катаболизме глюкозы, переходит в активную форму только после отщепления фосфорного остатка. Поэтому в этом случае фосфорилирование вызывает снижение активности, а дефосфорилирование – повышение активности фермента. Дефосфорилирование осуществляют протеинфосфатазы (класс гидролазы) Регуляция протеолизом Целый ряд ферментов вырабатывается клетками организма в каталитически неактивной форме. Активация фермента происходит путем отщепления от него пептида – протеолиз. В результате протеолиза изменяются первичная структура, молекулярная масса, конформация фермента и его активного центра, повышаются сродство к субстрату и скорость ферментативной реакции. Например, в поджелудочной железе трипсин синтезируется в форме неактивного предшественника трипсиногена. В кишечнике происходит отщепление с N-конца молекулы трипсиногена под действием энтеропептидазы. Фермент из неактивной формы переходит в активную. Синтез пептидаз в неактивной форме предотвращает их разрушающее действие на клетки органов, в которых они образуются. 3. Высокая селективность ферментативных методов анализа обусловлена образованием фермент-субстратного комплекса в процессе каталитич. акта, требующим структурного соответствия активного центра фермента и субстрата. Поэтому большинство ферментов активно только в р-циях с субстратом одного определенного типа или с группой субстратов, имеющих общие структурные группы. Напр., фермент глюкозооксидаза катализирует окисление практически только одного вида глюкозы - -глюкозу, к-рую можно определять без разделения сложной смеси моно-и олигосахаридов. В данном случае проявляется субстратная специфичность фермента. Групповую специфичность можно наблюдать в случае действия альдегидоксидазы в р-циях превращения алифатич. альдегидов. Значительно менее селективны методы определения эффекторов, т. к. обычно имеется группа разл. соед., в той или иной степени меняющих каталитич. активность данного фермента. Однако селективность определения эффекторов м. б. и очень высокой. Так, очень малые кол-ва ртути (10 пМ) можно определять по ее ингибирующему действию на пероксидазу хрена на фоне тысячекратных кол-в Bi и Cd и значительно больших кол-в мн. неорг. и орг. в-в. Ферменты как аналитические реагенты широко применяются в практике лабораторных исследований при определении субстратов, нуклеотидов. В настоящее время выпускается ряд наборов для определения глюкозы, этанола, молочной кислоты, АТФ и др. Принцип в исследуемом материале содержится неизвестное количество субстрата. Для его определения вводят фермент, катализирующий превращение только этого субстрата, создают оптимальные условия реакции (pH, Г и др.) и регистрируют скорость реакции (по образованию продукта или изменению кофермента). Затем определяют концентрацию искомого субстрата по скорости реакции, используй калибровочный график. Электрофоретический метод отличается простотой выполнения и избирательностью. Это единственный из известных методов оценки активности рестриктаз, в результате применения которого имеется возможность судить о характере расщепления субстрата — каждая специфическая эндонуклеаза генерирует уникальный набор фрагментов ДНК субстрата, который после проведения электрофоретического их разделения дает определенный, характерный для этого фермента набор зон в геле. Рассмотрение таких картин позволяет судить не только о наличии рестриктазы в исследуемом растворе, но отчасти и об ее активности и субстратной специфичности. Вариант 13 1)Активаторы и ингибиторы ферментов. Виды ингибирования. Каталитическая функция ферментов определяется также присутствием в среде активаторов и ингибиторов: первые повышают скорость реакции, вторые —тормозят. Активаторами ферментов могут быть вещества самой разнообразной природы: НСL - активирует действие пепсина, желчные кислоты — панкреатической липазы. Особенно часто в качестве активаторов выступают ионы двухвалентных металлов, реже одновалентных. Например для К+, N+ - АТФазы, обеспечивающее транспорт одновалентных катионов через клеточную мембрану необходимы ионы магния, калия, натрия. Многие ферменты вообще неактивны в отсутствии металлов (при удалении цинка карбоангидраза практически лишена ферментативной активности). Роль металлов в активирующем действии ферментов. • в ряде случаев выполняют функции простетических груш ферментов; • могут способствовать образованию фермент-сустратного комплекса; • могут выступать в роли аллостерического эффектора Ингибиторы по типу ингибирования делят на 2 группы: обратимого действия - когда комплекс фермент-ингибитор непрочен и быстро диссоциирует, активность фермента при этом восстанавливается (после диализа или Сильного разведения раствора) 2; необратимого действия - в основе стойкие изменения ил модификации функциональных групп фермента По механизму действия ингибиторы ферментов делятся на следующие основные группы: 1) конкурентные 2) неконкурентные : 3) бесконкурентные; 4) субстратные; 5) аллостерические. Конкурентным ингибированием (рис 13) называется торможение ферментативной реакции, вызванной связыванием с активным центром фермента ингибитора, сходного по структуре с субстратом и препятствующего образованию фермент-субстратного комплекса. При конкурентном торможении ингибитор и субстрат, будучи сходными по строению, конкурируют за активный центр фермента. С активным центром связывается то соединение, молекул которого больше. С ферментом связан либо ингибитор, субстрат. Ингибирование наступает вследствие того, что субстратоподобный ингибитор связывает часть молекул фермента, которые уже не способны образовывать фермент-субстратный комплекс. Снять торможение можно избытком субстрата, вытесняющего ингибитор из активных центов ферментных молекул, тем та самым возвращая им способность к катализу. Конкурентными ингибиторами могут быть метаболиты, накопление которых регулирует активность ферментов, и чужеродные вещества. Явление конкурентного ингибирования ферментов имеет практическое применение: • конкурентное ингибирование лежит в основе механизма действия ряда групп фармакологических препарат» (антихолинэстеразные средства: прозерин, физостигмин; средства-антиметаболиты: фторурацил, меркаптопурин) • ингибиторы холинэстеразы необратимого действия (фосфорорганические соединения) используются в качеств инсектицидов. (дихлофос, хлорофос) и как боевые отравляющие вещества (зарин, зоман); • открывает перспективы создания новых лекарственных средств (возможность поиска антиметаболитов, обладающих свойствами конкурентных ингибиторов). Неконкурентным ингибированием ферментов называется торможение, связанное с влиянием ингибитора на каталитическое превращение, но не на связывание фермента и субстрат. Неконкурентный ингибитор или связывается непосредственно каталитическими группами активного центра фермента. или. связываясь с ферментом вне активного центра. изменяет конформацию активного центра, мешая взаимодействию с субстраты. Поскольку неконкурентный ингибитор не влияет на связывание субстрата, то комплекс фермент-ингибитор способен присоединить субстрат, но дальнейшего превращения субстрата не про- исходит, так как каталитические группы заблокированы, Снять действие неконкурентного ингибитора избытком субстрата (ка» действие конкурентного) нельзя, а можно лишь веществами, связывающими ингибитор. Эти вещества называют реактиваторами. Неконкурентными ингибиторами геминового фермента цитохромоксидазы являются цианиды, которые прочно соединяются с трёхвалентным железом. Блокада этого фермента выключает дыхательную цепь, и клетка погибает. К неконкурентным ингибиторам ферментов относятся ионы тяжёлых металлов и их органические кис соединения (ионы тяжёлых металлов ртути, свинца, кадмия, мышьяка). Они блокируют, например, SH - группы, входящие в каталитический участок фермента и являются очень токсичными. Неконкурентные ингибиторы применяются: • как фармакологические средства (ртутные диуретики; препараты висмута для лечения си препараты сурьмы для лечения лейшманиоза); • как инсектициды, фунгициды в сельском хозяйстве; • как боевые отравляющие вещества (синильная кислота, цианиды); Бесконкурентным ингибированием называется торможение торможением иферментативной реакции, вызванное присоединением ингибитора, только к комплексу фермент- субстрат. Бесконкурентный ингибитор не соединяется с ферментом в отсутствие субстрата. Более того, ингибитор облегчает присоединение субстрата, а затем, связываясь сам, ингибирует фермент. Субстратным ингибированием называется торможение ферментативной реакции, вызванное избытком субстрата. Такое ингибирование происходит вследствие образования ферментного комплекса, не способного подвергаться каталитическим превращениям. Субстратное торможение снимается при снижении концентрации субстрата. Аллостерическое ингибирование характерно только для особой группы ферментов, имеющих аллостерические центры. Механизм действия аллостерических ингибиторов заключается в изменении конформации активного центра фермента. Аллостерическими эффекторами ферментов наиболее часто выступают различные метаболиты, а также гормоны, ионы металлов, коферменты. В редких случаях роль аллостерического эффектора выполняют молекулы субстрата. Явление аллостерического ингибирования лежит в основе аллостерической регуляции ферментов, когда конечный продукт метаболического процесса выступает в роли ингибитора первого фермента цепи; такая регуляция является регуляцией по типу обратной связи и позволяет контролировать выход конечного продукта накопления которого прекращается работа первого фермента цепи. 2)Принцип количественного определения активности ферментов. Способы определения: фотоколориметрия, спектрофотометрия, потенциометрия, полярография, понятие о биосенсорах. В повседневной биохимической практике практически не оценивается количество фермента, а только его активность. Активность – более широкое понятие, чем количество. Она подразумевает в первую очередь результат реакции, а именно убыль субстрата или накопление продукта. Естественно, при этом нельзя игнорировать время, которое проработал фермент и число молекул фермента. Но так как число молекул фермента подсчитать обычно нереально, то используют количество биологического материала, содержащего фермент (объем или массу). Таким образом при определении активности ферментов нужно одновременно учитывать три меняющихся фактора: 1) масса полученного продукта или исчезнувшего субстрата, 2) время, потраченное на реакцию, 3)количество биологического материала, содержащего фермент. Основы количественного определения активности ферментов 1. Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент. Активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т.д. 2. Создание стандартных условий, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях – оптимальная рН и фиксированная температура, например, 25°С или 37°С, соблюдение времени инкубации субстрата с ферментом. 3. Необходимо наличие избытка субстрата, чтобы работали все имеющиеся в растворе молекулы фермента. За единицу активности любого фермента принимают такое его кол-во которое катализирует превращ-е 1мкм вещ-ва в 1 минуту. Активность ферментов опр-ют: пог скорости убыв субстрата; по скороти обр-я продукта. Удельная активность=мкм/мин.мг белка. Фотоколориметрия Фотоколориметрический метод анализа основан на измерении поглощения света немонохроматического излучения окрашенными соединениями в видимой области спектра. Если исследуемые соединения бесцветны, их переводят в-окрашенные соединения путем взаимодействия с различными-реактивами. В этом случае окрашенные соединения в большинстве своем являются комплексными или внутрикомилфсными соединениями. Последние должны быть прочными, иметц постоянный состав, высокую интенсивность окраски. , В зависимости от способа измерения концентрации веществ-в окрашенных растворах, от применяемой аппаратуры методы фотоколориметрического анализа подразделяются в основном на два вида: визуальные и фотоэлектрические. При визуальном методе, называемом колориметрическим, интенсивность окраски исследуемых растворов сравнивается с интенсивностью окраски стандартных растворов, в которых концентрация вещества известна. При фотоэлектрических методах анализа интенсивность окраски, т. е. погашение (А) окрашенного раствора исследуемого-вещества, измеряют с помощью приборов - фотоэлектроколо-риметров (ФЭК) (рис. 7) или спектрофотометра в видимой области спектра. Методы анализа, связанные с измерением поглощения света (спектрофотометрия, фотоколориметрия) базируются на объединенном законе Бугера - Ламберта - Бера, который устанавливает зависимость между поглощающей способностью исследуемого раствора, концентрацией вещества этого раствора и толщиной поглощающего слоя. Согласно этому закону погашение (А) раствора прямо пропорционально концентрации раствора поглощающего вещества (С), толщине слоя (Ь) в сантиметрах и молярному или удельному показателю поглощения (х). Эта зависимость выражается формулой:  Спектрофотометрия (абсорбционная) — физико-химический метод исследования растворов и твёрдых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200—400 нм), видимой (400—760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра. Основная зависимость, изучаемая в спектрофотометрии, — зависимость интенсивности поглощения (как правило измеряется оптическая плотность - логарифм светопропускания т.к. она зависит линейно от концентрации вещества) падающего света от длины волны. Спектрофотометрия широко применяется при изучении строения и состава различных соединений (комплексов, красителей, аналитических реагентов и др.), для качественного и количественного определения веществ (определения следов элементов в металлах, сплавах, технических объектах). Приборы спектрофотометрии — спектрофотометры. Потенциометрия— метод определения различных физико-химических величин, основанный на измерении электродвижущих сил (ЭДС) обратимых гальванических элементов. Иначе говоря, зависимость равновесного потенциала электрода от активности концентраций определяемого иона, описываемая уравнением Нернста. Широко применяют потенциометрию в аналитической химии для определения концентрации веществ в растворах (потенциометрическое титрование), для измерения рН. Полярография — метод качественного и количественного химического анализа, основанный на получении кривых зависимости величины тока от напряжения в цепи состоящей из исследуемого раствора и погруженных в него электродов, один из которых сильно поляризующийся, а другой практически неполяризующийся. Получение таких кривых — полярограмм — производят при помощи полярографов. Полярография — физико-химический метод анализа, основанный на получении вольтамперных кривых (подпрограмм, поляризационных кривых), выражающих зависимость величины тока от напряжения в цепи, состоящей из исследуемого раствора и двух погруженных в него электродов, один из которых должен быть сильно поляризующимся. В качестве поляризующегося электрода обычно используют капельный ртутный электрод, который может служить как катодом (при определении электровосстанавливающихся веществ), так и анодом (если определяемые вещества способны к электроокислению). Вторым вспомогательным электродом служит практически не поляризующийся ртутный электрод с большой поверхностью. Можно использовать также твердые электроды, например платиновые, причем поверхность поляризующегося электрода должна быть в тысячи раз меньше поверхности вспомогательного электрода. Полярографический метод анализа обладает большой чувствительностью и дает возможность определять вещества при очень незначительной (до 0,0001%) концентрации их в растворе. Для выполнения анализа достаточно 3—5 мл раствора; количество раствора можно уменьшить до 0,1—0,5 мл. Проведение анализа на авторегистрирующих полярографах занимает около 10 мин. Полярография широко используется в медико-биологических исследованиях для качественного и количественного определения в биологических объектах и лекарственных препаратах неорганических и органических электролитов, белков, гормонов, витаминов и других веществ, для определения степени насыщения крови кислородом, состава выдыхаемого воздуха, для определения вредных веществ в воздухе промышленных предприятий. При ряде заболеваний (злокачественные опухоли, лучевая болезнь и др.) высота полярографической волны сыворотки крови и ее безбелкового фильтрата претерпевает заметные изменения, что может быть использовано для разработки новых методов диагностики и для определения эффективности лечения. БИОСЕНСОРЫ Под термином "биосенсор" следует понимать устройство, в котором чувствительный слой, содержащий биологический материал, непосредственно реагирующий на присутствие определяемого компонента, генерирует сигнал, функционально связанный с концентрацией этого компонента. Конструктивно биосенсор представляет комбинированное устройство, состоящее из двух преобразователей - биохимического и физического, находящихся в тесном контакте друг с другом. Биохимический преобразователь выполняет функцию биологического элемента распознавания, преобразуя определяемый компонент, а точнее, информацию о химических связях, в физическое или химическое свойство или сигнал, а физический преобразователь это свойство фиксирует с помощью специальной аппаратуры. Принципы конструирования биосенсоров. Любой биосенсор состоит из двух принципиальных функциональных элементов: биоселектирующей мембраны, использующей раз-личные биологические структуры, и физического преобразователя сигнала (трансдьюсера), трансформирующего концентрационный сигнал в электрический. Для считывания и записи информации используют электронные системы усиления и регистрации сигнала. В качестве биоселектирующего материала используют все типы биологических структур: ферменты, антитела, рецепторы, нуклеиновые кислоты и даже живые клетки Существует большое разнообразие физических трансдьюсеров: электрохимические, спектроскопические, термические, пьезоэлектрические, трансдьюсеры на поверхностных акустических волнах и т.п. В настоящее время наибольшее распространение получили электрохимические преобразователи. Наличие в устройстве биоматериала с уникальными свойствами позволяет с высокой селективностью определять нужные соединения в сложной по составу смеси, не прибегая ни к каким дополнительным операциям, связанным с использованием других реагентов, концентрированием и т.д. (отсюда и название - безреагентные методы анализа). Первое упоминание об аналитический устройствах на основе ферментов или ферментсодержащих материалов появилось сравнительно недавно, в 60-х годах нашего столетия. Затем в обиход вошло понятие "биосенсор" или "биочип". Это важное событие в науке. Здесь отражаются глубокие причины, связанные с так называемыми интеграционно-синтетическими процессами в науке, приводящими к появлению новых знаний. Функционально биосенсоры сопоставимы с датчиками живого организма - биорецепторами, способными преобразовывать все типы сигналов, поступающих из окружающей среды, в электрические. Наибольшее распространение сейчас получили биосенсоры на основе ферментов. Среди таких устройств различают субстратные и ингибиторные биосенсоры. С их помощью решают различные медико-биологические задачи (например, определение сахара в крови) и контролируют состояние среды обитания (контроль содержания токсикантов). Чувствительность ингибиторных биосенсоров чрезвычайно высока, например, возможно определение остаточных количеств некоторых пестицидов на уровне 0.01 мкг/л и меньше. По-видимому, самым распространенным в настоящее время является амперометрический биосенсор на основе иммобилизованной глюкозоксидазы для определения сахара в крови. Исторически этот биосенсор является самым "древним". В качестве физического трансдьюсера в нем использован так называемый электрод Кларка. В настоящее время для определения глюкозы создано наибольшее число различных биосенсоров, что связано с необходимостью контроля за содержанием сахара в биологических жидкостях, например в крови, при диагностировании и лечении некоторых заболеваний, прежде всего диабета. 3)Применение ферментов в медицине. Энзимотерапия. Энзимодиагностика. Использование ферментов в медицине происходит по четырем направлениям: 1. энзимодиагностика (это исследование активности ферментов плазмы крови, мочи, слюны с целью диагностики тех или иных заболеваний. Примером может служить фермент лактатДГ, определение его активности в плазме крови необходимо при заболеваниях сердца, печени, скелетной мускулатуры. Увеличение активности α-амилазы в плазме крови и моче наблюдается при воспалительных процессах в поджелудочной и слюнных железах. С другой стороны, заболевания тех или иных органов всегда сопровождаются специфичным "ферментативным профилем". Например, инфаркт миокарда сопровождается увеличением активности лактатДГ, креатинкиназы, аспартатаминотрансферазы), 2. энзимотерапия (использование ферментов в качестве лекарственных средств. Самыми распространенными ферментативными препаратами являются комплексы ферментов желудочно-кишечного тракта (Фестал, Мезим форте), содержащие пепсин, трипсин, амилазу и т.п., и используемые для заместительной терапии при нарушениях переваривания веществ в желудочно-кишечном тракте. Рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза входят в состав глазных капель для лечения вирусных конъюнктивитов. Трипсин ингалируют при бронхолегочных заболеваниях для разжижения густой и вязкой мокроты. Коллагеназу применяют для ускорения отторжения некротизированных тканей, для очистки трофических язв), 3. использование ферментов в медицинских технологиях и промышленности (Специфичность ферментов к определенным субстратам применяетсяв лабораторной диагностике. Многие лабораторные методы основаны на взаимодействии добавляемого извне фермента с определяемым соединением. В результате возникает специфичный продукт реакции, после определения содержания последнего судят о концентрации искомого вещества (глюкозооксидазный, холестеролоксидазный методы), иммуноферментные методы, основанные на образовании тройного комплекса фермент-антиген-антитело. Определяемое вещество не является субстратом фермента, но является антигеном. Фермент может присоединять этот антиген вблизи от активного центра. Если в среде есть антиген, то при добавлении антител и формировании тройного комплекса активность фермента изменяется. Активность фермента измеряют любым способом), 4. применение ингибиторов ферментов (Весьма широко применяются в настоящее время ингибиторы протеаз (контрикал, гордокс) при панкреатитах – состояниях, когда происходит активирование пищеварительных ферментов в протоках и клетках поджелудочной железы. Ингибиторы холинэстеразы (физостигмин, прозерин) приводят к накоплению нейромедиатора ацетилхолина в синапсах и показаны при миастении, двигательных и чувствительных нарушениях при невритах, радикулитах, психогенной импотенции. Препараты, содержащие ингибиторы моноаминоксидазы (наком, мадопар), повышают выработку нейромедиаторов катехоламинов в ЦНС при лечении паркинсонизма. Подавление активности моноаминооксидазы (разрушающей катехоламины) сохраняет нормальную передачу сигналов в нервной системе. Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (каптоприл, эналаприл и т.п.) используются как антигипертензивное средство и вызывают расширение периферических сосудов, уменьшение нагрузки на миокард, снижение артериального давления. Аллопуринол – ингибитор ксантиноксидазы, фермента катаболизма пуринов, требуется для снижения образования мочевой кислоты и подавления развития гиперурикемии и подагры. Ингибиторы гидроксиметилглутарил-SКоА-редуктазы (ловастатин, флувастатин, аторвастатин) применяются для снижения синтеза холестерола при атеросклерозе, заболеваниях сердечно-сосудистой системы, дислипопротеинемиях. Ингибитор карбоангидразы (ацетазоламид) используется как мочегонное средство при лечении глаукомы, отеков, эпилепсии, алкалозах и горной болезни). Билет №14 Строение и свойства ферментов. Зависимость ферментативной реакции от рН, температуры. Ферменты как белковые молекулы имеют 4 уровня организации: первичный, вторичный, третичный, четвертичтный. Ферменты с четвертичной структурой состоят из протомеров (субъединиц) - таких ферментов большинство. Ферменты могут быть как простыми, так и сложными белками. Сложные ферменты состоят из белковой части - апофермента и небелковой - кофактора. Апоферменты и кофакторы порознь мало активны или вообще неактивны; объединение их вместе даёт активную молекулу фермента. Функции и свойства апофермента и кофактора следующие. Апофермент термолабилен, определяет специфичность фермента, участвует в соединении фермента с субстратом, активирует кофактор. Кофактор термостабилен, стабили зирует апофермент, участвует в катализе. Коферменты представлены веществами органической природы - нуклеотидами, витаминами и др. Их подразделяют следующим образом: Витаминные коферменты: (Тиаминовые (ТМФ, ТДФ, ТТФ), Флавиновые (ФМН, ФАД), Пантотеновые (КоА, дефосфо-КоА, 4-фосфопантотенат), Никотинамидные (НАД, НАДФ) и Невитаминные коферменты: Нуклеотидные (УДФ-глкжоза, другие нуклеотидные производные углеводов, спиртов и т. д.), Фосфаты моносахаридов (глюкозо- 1,6-дифосфат, 2,3-дифосфоглицерат), Металлопорфириновые (гемы, хлорофиллы), Пептидные (глутатион). Исходными веществами для образования коферментов первой группы являются витамины, поэтому недостаточное поступление их с пищей сразу сказывается на синтезе этих коферментов, а как следствие нарушается и функция соответствующих сложных ферментов. Коферменты второй группы образуются из промежуточных продуктов обмена, поэтому недостатка в этих коферментах в физиологических условиях не бывает, и функция ферментов, с которыми они связаны, не нарушаются. В структуре фермента выделяют ряд участков, несущих определённые функции: Активный центр - место в пространственной структуре фермента, с которым связывается субстрат (вещество которое превращается под действием фермента); в состав активного центра фермента входят кофакторы; число активных центров в олигомерных ферментах может быть равно числу субъединиц - по одному центру на субъединицу; в активном центре различают контактный, или якорный участок, связывающий субстрат, и каталитический участок, где происходит превращение субстрата после его связывания; обычно активный центр фермента образуют 12-16 аминокислотных остатков, они могут находиться в разных местах полипептидной цепи, нередко на противоположных концах - при пространственной раскладке они сближаются и образуют активный центр; в катализе наиболее часто принимают участие функциональные группы ферментов: индольные триптофана; имидазольные гистидина; ОН - группы серина и треонина; SH - группы цистеина и дисульфидные цистина; тиоэфирные группы метионина; фенольные группы тирозина; гидрофобные цепи алифатических аминокислот и ароматическое кольцо фенилаланина; гуанидиновые группы аргинина; NH, - группы лизина и концевые NH2 - группы полипептидной цепи; Кроме активного у ферментов имеется аллостерический центр расположенный вне активного центра но функционально связанный с ним. Молекулы, взаимодействующие с этим центром, структурно не похожи на субстрат, но влияют на связывание и превращение субстрата в активном центре, изменяя его конфигурацию; такие вещества называют аллостерическими эффекторами, через аллостери- ческий центр они влияют на функцию активного центра: или вызывают положительный эффект (активаторы), или отрицательный (ингибиторы). Молекула фермента может иметь несколько аллостерических центров.  К основным свойствам ферментов относят: термолабильность; зависимость активности от pH среды; специфичность действия; влияние на активность активаторов и ингибиторов. Влияние температуры В соответствии с законами химической кинетики скорость химической реакции повышается в два раза при повышении температуры на 10°С. Однако вследствие белковой природы ферментов тепловая денатурация фермента при повышении температуры будет снижать эффективную концентрацию фермента. Так, до 45- 50°С преобладает эффект повышения скорости реакции, выше 45°С более существенной становится тепловая денатурация и быстрое падение скорости реакции. Оптимальной температурой для действия большинства ферментов теплокровных является диапазон 37-40°С. При 100‘С почти все ферменты утрачивают свою активность (исключение - миоки- наза мышц, аденилаткиназа - выдерживающие режим кипячения). При низких температурах (0° и ниже ферменты, как правило, не денатурируют, хотя активность их падает почти до 0). Термозависимость ферментов используется в практике: • для разработки режима хранения продуктов питании; ферментативных препаратов; органов и тканей, являющихся материалом для трансплантации (сохранность их при низких температурах является результатом низкой акгивности собственных ферментов и ферментов микроорганизмов) при проведении длительных и травматичных операций на фоне искусственной гипотермии (замедление скорости ферментативных реакций позволяет снизить потребность в энергетических субстратах и кислороде и повышает толерантность тканей, в частности, к гипоксии и кровопотере) при искусственной гиперпирексии как составного компонента терапии ряда хронических инфекционных процессов Влияние pH среды Большинство ферментов наиболее активно в пределах узкой зоны концентрации водородных ионов, соответствующей физиологическим значениям pH среды (pH 6,0-8,0). Оптимум pH среды для конкретного фермента - это такое значение pH среды, при котором фермент проявляет максимальную активность Большая часть ферментов клеток имеет оптимум pH, близкий к нейтральному (исключение - пепсин имеет оптимум pH 1,5- 2,0). Отклонение pH в ту или другую сторону ведёт к снижению скорости ферментативной реакции, что связано с изменением ионизации кислых или основных групп аминокислотных остатков активного центра. Каталаза. Количественное определение. Принцип метода Каталаза – фермент (КФ 1.11.1.6) катализирующий окислительно-восстановительную реакцию между двумя молекулами пероксида водорода: 2НООН ─каталаза→ 2НОН + О2. В основе количественного определения каталазы лежит определение количества пероксида водорода, разложенного ферментом за определенный промежуток времени, по уравнению: 2KMnO4 + 5 H2O2 + 4 H2SO4 ↔ 2KHSO4 + 2 MnSO4 + 8HOH + 5O2 О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества перманганата калия, израсходованного на титрование перекиси водорода до и после действия каталазы. Активность фермента выражают каталазным числом и показателем каталазы. Каталазным числом (КЧ) называют количество H2O2 мг, которое разлагается в 1 мкл (мл) крови. Показателем каталазы называют отношение каталазного числа к количеству млн эритроцитов в 1 мкл крови. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества KMnO4, израсходованного на титрование контрольной и опытной пробы. Каталаза - фермент класса оксиредуктаз . Хромопротеид , состоит из четырех идентичных субъединиц с молекулярной массой 62000. Катализирует разложение H2O2 до воды и кислорода. Токсичная перекись водорода H2O2 расщепляется на O2 и H2O ( H2O2=H2O+1/2 O2 ). Катализатором реакции служит каталаза EC 1.11.1.6. Она широко распространена в тканях (особенно много ее в печени). Каталаза - один из основных ферментов разрушения активных форм кислорода. Каталаза является основным первичным антиоксидантом системы защиты, который катализирует разложениеперекиси водорода до воды , разделяя эту функцию с GSH-PX . Оба фермента осуществляют детоксикацию активного кислородного радикала, катализируя образование Н2О2 из супероксида . Кроме различий в их субстратной специфичности, эти два фермента различаются сродством к субстрату. При низком содержании Н2О2 органические пероксиды преимущественно катализируются пероксидазой. Однако, при высоких концентрациях Н2О2 работают каталазы. Подобно СОД, СТ широко распространены в различных тканях. Уровень активности различается не только в разных тканях, но и внутри самой клетки. Печень , почки и красные кровяные клетки содержат высокий уровень СТ. В гепатоцитах ожидаемо высокий уровень активности наблюдается в пероксисомах , хотя СТ активен также в микросомах и в цитозоле. Каталаза-это тетрамерный гем-содержащий белок , который образуется в в цитозоле в виде мономеров, не содержащих гем. Мономеры переносятся в просвет пероксисом и там собираются в тетрамеры в присутствии гема. Хотя каталаза не содержит сигнальной последовательности, отрезаемой после использования, она должна иметь какой-то сигнал, направляющий ее в пероксисому. Согласно последним данным, эту роль, по крайней мере частично, играет специфическая последовательность из трех аминокислот, расположенная вблизи карбоксильного конца многих пероксисомных белков. Иммуноферментный анализ, принцип, возможности использования. Другие области применения. Одним из наиболее часто используемых методов в клинической и экспериментальной биохимии, вирусологии, микробиологии, ветеринарии, контроле технологии производства в медицинской и микробиологической промышленности, охране окружающей среды является в настоящее время иммуноферментный анализ (ИФА), в котором ферменты также выступают в качестве неотъемлемого компонента тест-системы. Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу конъюгата (антивидового иммуноглобулина, меченого ферментом). Фермент вызывает разложение хромогенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо фотометрически. Существует множество вариантов постановки ИФА, из которых наибольшее практическое значение получил гетерогенный твердофазный ИФА. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Самым распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция – процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а так же с помощью образования водородных связей присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые планшеты или полистироловые шарики. Для ферментативной метки конъюгата могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза. Широкое использование стандартной конфигурации 96-луночного планшета позволило унифицировать оборудование, необходимое для проведения ИФА. Принципиальная схема твердофазного неконкурентного ИФА состоит из нескольких стадий. Стадия 1. Специфические антигены пришиты к пластику лунок планшета. В лунку добавляется исследуемая сыворотка, и если в ней есть антитела (эти антитела наз-тся первыми) к данным антигенам, во время инкубации происходит взаимоузнавание, в результате которого образуется принципиально значимая связь антиген/антитело. Стадия 2. После отмывки лунок от несвязавшихся субстанций в каждую лунку добавляются вторые антитела. Они узнают человеческие антитела определенного типа (IgA, IgG, IgM). К этим вторичным антителам химически пришит активный фермент. такое комплексное соединение называется конъюгат. Во время инкубации происходит взаимоузнавание первых и вторых антител, в результате чего в лунке образуется структура типа «сэндвич». Стадия 3. После отмывки не связавшегося конъюгата в лунку добавляется бесцветный субстрат, на который действует фермент. в результате субстрат превращается в окрашенный продукт. Количество окрашенного продукта измеряется на фотометре при определенной длине волны. Таким образом, количество цветного продукта прямо пропорционально количеству фермента в лунке, а значит и количеству конъюгата в «сэндвиче». Количество конъюгата прямо пропорционально тому количеству комплекса антиген-антитело, которое получается на стадии 1 ИФА. Следовательно, измерение развившейся цветной реакции на стадии 3 точно коррелирует с наличием специфических антител в анализируемой сыворотке. Время проведения анализа 1-3 часа. В клинико-диагностических лабораториях ИФА применяется для следующих целей: - диагностика инфекционных и паразитарных заболеваний: токсоплазмоза, герпеса, хламидиаза, трихомониаза, вирусов гепатита С и В, коревой краснухи, лямбиоза, микоплазмоза, описторхоза, сифилиса, уреаплазмоза, ВИЧ-инфекции. - определение содержания гормонов и других биологически активных веществ: лютеинизирующий гормон, фолликолустимулирующий гормон, инсулин, пролактин, тестостерон, прогестерон, эстрадиол, кортизол, тиреотропный гормон, трийодтиронин, тироксин, определение цитокинов и др. - диагностика ранних сроков беременности - пренатальная диагностика пороков развития плода - определение онкомаркеров: альфа-фетопротеина (для печени), раково-эмбриональный антиген (для кишечника), простатспецифический антиген, нейроспецифический антиген (маркер молочной железы), Са-125 (для яичников). Тема: Ферменты Билет №15 Распределение ферментов в организме. Множественные формы, изоферменты. Примеры. Многие ферменты обнаруживаются практически во всех клетках организма. Это ферменты, которые участвуют в процессах жизнеобеспечения самой клетки, таких, как синтез нуклеиновых кислот и белков, образование мембран и других основных клеточных органелл, энергетический обмен. С другой стороны, дифференцированные клетки, выполняющие различные специализированные функции, различаются и по ферментному составу. Например, клетки печени содержат набор ферментов, необходимых для синтеза мочевины, клетки коры надпочечников — ферменты, синтезирующие стероидные гормоны, в мышечных клетках много креатинфосфокиназы. Множественные формы ферментов можно разделить на две категории: 1)Изоферменты. 2)Собственно множественные формы (истинные). Изоферменты — это ферменты, синтез которых кодируется разными генами, у них разная первичная структура и разные свойства, но они катализируют одну и ту же реакцию. Виды изоферментов: Органные — ферменты гликолиза в печени и мышцах. Клеточные — малатдегидрогеназа цитоплазматическая и митохондриальная (ферменты разные, но катализируют одну и ту же реакцию). Гибридные — ферменты с четвертичной структурой, образуются в результате нековалентного связывания отдельных субъединиц (лактатдегидрогеназа — 4 субъединицы 2 типов). Мутантные — образуются в результате единичной мутации гена. Аллоферменты — кодируются разными аллелями одного и того же гена. Собственно множественные формы (истинные) — это ферменты, синтез которых кодируется одним и тем же аллелем одного и того же гена, у них одинаковая первичная структура и свойства, но после синтеза на рибосомах они подвергаются модификации и становятся разными, хотя и катализируют одну и ту же реакцию. Изоферменты разные на генетическом уровне и отличаются от первичной последовательности, а истинные множественные формы становятся разными на посттрансляционном уровне. 2.Принципы количественного определения ферментов. Примеры. Единицы активности. Ввиду того, что ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях, мерой активности ферментов служит скорость исчезновения субстрата или нарастания конечного продукта реакции в единицу времени. Для выражения концентрации ферментов Комиссией по ферментам Международного биохимического союза предложена стандартная единица (Е). За международную единицу активности фермента принимается количество фермента, способное превратить один микромоль (мкМоль) субстрата за 1 минуту в стандартных условиях( при 25С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения), выражается в Мкмоль/мин Удельная активность фермента –количество фермента в мг, способное превратить 1 мкмоль субстрата за 1 мин в стандартных условиях, выражается в мкмоль/мин*мг(белка) В соответствии с единицами измерения, принятыми в системе СИ, введена также единица каталитической активности ферментов КАТАЛ(Kat, кат) – количество фермента, способное осуществить превращение 1 моль субстрата в 1 с в стандартных условиях. 3.Методы сухой химии. Иммобилизованные ферменты-компонент аналитических систем одноразового использования( диагностические полоски) Получение иммобилизованных ферментов, или нерастворимых ферментов ( искусственно полученного комплекса фермента с нерастворимым в воде носителем ), значительно расширило сферу применения биокатализаторов. Различают иммобилизацию ковалентную и нековалентную ( иммобилизацию физическими методами) Первый тип основан на ковалентном связывании фермента с нерастворимым материалом или молекул фермента между собой с образованием нерастворимых полиферментных комплексов. Нековалентная иммобилизация включает: адсорбцию, включение в гели, микроинкапсулирование; в данном случае отмечается способность фермента диссоцииировать на субъединицы с последующим переходом в раствор не связанных с носителем субъединиц и падением активности фермента. Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком и носителем. Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При широком варьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность. Применение в медицине Использование аналитических систем одноразового использования с иммобилизованными на них ферментами Создание протезов кровеносных сосудов и сердечных клапанов из тромборезистентного материала на основе полимеров с иммобилизовнными на них тромболитическими ферментами Использование иммобилизованных терапевтических белков в экстракорпоральных реакторах( уреазы,фенилаланиламмиаклиазы – в лечении почечной недостаточности, фенилкетонурии) |