ферменты. Классификация и номенклатура ферментов. Характеристика классов. Шифр ферментов. Примеры

• Название: Классификация и номенклатура ферментов. Характеристика классов. Шифр ферментов. Примеры
• Анкор: ферменты
• Дата: 17.11.2019
• Размер: 0.87 Mb.
• Имя файла: ферменты.docx
• Тип: Документы; #95523
• страница: 3 из 5

Электрофоретические методы

• 
  Электрофорез в денатурирующих условиях
  
• 
  Нативный электофорез
  
• 
  Изоэлектрофокусирование
  

Электрофорез









Изоэлектрическая фокусировка

2. Механизм действия ферментов может быть рассмотрен с двух позиций: с точки зрения изменения энергетики химических реакций и с точки зрения событий в активном центре.

А. Энергетические изменения при химических реакциях

Любые химические реакции протекают, подчиняясь двум основным законам термодинамики: закону сохранения энергии и закону энтропии. Согласно этим законам, общая энергия химической системы и её окружения остаётся постоянной, при этом химическая система стремится к снижению упорядоченности (увеличению энтропии). Для понимания энергетики химической реакции недостаточно знать энергетический баланс входящих и выходящих из реакции реагентов, необходимо учитывать изменения энергии в процессе данной химической реакции и роль ферментов в динамике этого процесса. Рассмотрим реакцию разложения угольной кислоты:

Н₂СО₃ → Н₂0 + С0₂.

Угольная кислота слабая; реакция её разложения пойдёт цри обычных условиях, если молекулы угольной кислоты имеют энергию, превышающую определённый уровень, называемый энергией активации Е_а (рис. 2-10).

Энергией активации называют дополнительное количество кинетической энергии, необходимое молекулам вещества, чтобы они вступили в реакцию.

При достижении этого энергетического барьера в молекуле происходят изменения, вызывающие перераспределение химических связей и образование новых соединений. Говорят, что молекулы, обладающие Е_а, находятся в переходном состоянии. Разницу энергий между исходным реагентом Н₂СО₃ и конечными соединениями Н₂О и СО₂ называют изменением свободной


Схема


Рис. 2-10. Изменение свободной энергии при разложении угольной кислоты.

энергии реакции DG. Молекулы Н₂О и СО₂ - более стабильные вещества, чем Н₂СО₃, т.е. обладают меньшей энергией и при обычных условиях практически не реагируют. Выделившаяся энергия в результате этой реакции рассеивается в виде тепла в окружающую среду.

Чем больше молекул обладает энергией, превышающей уровень Е_а, тем выше скорость химической реакции. Повысить скорость химической реакции можно нагреванием. При этом увеличивается энергия реагирующих молекул. Однако для живых организмов высокие температуры губительны, поэтому в клетке для ускорения химических реакций используются ферменты. Ферменты обеспечивают высокую скорость реакций при оптимальных условиях, существующих в клетке, путём понижения уровня Е_а. Таким образом, ферменты снижают высоту энергетического барьера, в результате возрастает количество реакционно-способных молекул, следовательно, увеличивается скорость реакции.

В механизме ферментативного катализа решающее значение имеет образование нестойких промежуточных соединений - фермент-субстратный комплекс ES, подвергающийся превращению в нестабильный переходный комплекс ЕР, который почти мгновенно распадается на свободный фермент и продукт реакции.

Таким образом, биологические катализаторы (ферменты) не изменяют свободную энергию субстратов и продуктов и поэтому не меняют равновесие реакции (рис. 2-11).

Фермент, выполняя функцию катализатора химической реакции, подчиняется общим законам катализа и обладает всеми свойствами, характерными для небиологических катализаторов, однако имеет и отличительные свойства, связанные с особенностями строения ферментов.

Сходство ферментов с небиологическими катализаторами заключается в том, что:

• 
  ферменты катализируют энергетически возможные реакции;
  
• 
  энергия химической системы остаётся постоянной;
  
• 
  в ходе катализа направление реакции не изменяется;
  
• 
  ферменты не расходуются в процессе реакции.
  

Отличия ферментов от небиологических катализаторов заключаются в том, что:

• 
  скорость ферментативных реакций выше, чем реакций, катализируемых небелковыми катализаторами;
  
• 
  ферменты обладают высокой специфичностью;
  
• 
  ферментативная реакция проходит в клетке, т.е. при температуре 37 °С, постоянном атмосферном давлении и физиологическом значении рН;
  
• 
  скорость ферментативной реакции может регулироваться.
  

Б. Этапы ферментативного катализа

1. Формирование фермент-субстратного
комплекса
Тот факт, что ферменты обладают высокой специфичностью, позволил в 1890 г. выдвинуть гипотезу, согласно которой активный центр фермента комплементарен субстрату,

Рис. 2-11. Изменение свободной энергии в ходе химической реакции, некатализируемой и катализируемой ферментами. Фермент понижает энергию активации Е_а, т.е. снижает высоту энергетического барьера, в результате возрастает доля реакционно-способных молекул, следовательно, увеличивается скорость реакции.

т.е. соответствует ему как "ключ замку". После взаимодействия субстрата ("ключ") с активным центром ("замок") происходят химические превращения субстрата в продукт.

Активный центр при этом рассматривался как стабильная, жёстко детерминированная структура.

В 1959 г. был предложен другой вариант гипотезы "ключ-замок", объясняющий события в активном центре фермента. По этой гипотезе активный центр является гибкой структурой по отношению к субстрату. Субстрат, взаимодействуя с активным центром фермента, вызывает изменение его конформации, приводя к формированию фермент-субстратного комплекса, благоприятного для химических модификаций субстрата. При этом молекула субстрата также изменяет свою конформацию, что обеспечивает более высокую эффективность ферментативной реакции. Эта "гипотеза индуцированного соответствия" впоследствии получила экспериментальное подтверждение.

2. Последовательность событий в ходе
ферментативного катализа

Процесс ферментативного катализа условно можно разделить на следующие этапы (рис. 2-12).

Первый, второй и четвёртый этапы катализа непродолжительны и зависят от концентрации субстрата (для первого этапа) и констант связывания лигандов в активном центре фермента (для первого и третьего этапов). Изменения энергетики химической реакции на этих стадиях незначительны.

Третий этап наиболее медленный; длительность его зависит от энергии активации химической реакции. На этой стадии происходят разрыв связей в молекуле субстрата, образование новых связей и формирование молекулы продукта.

3. Роль активного центра в ферментативном
катализе

В результате исследований было показано, что молекула фермента, как правило, во много раз больше молекулы субстрата, подвергающегося химическому превращению этим ферментом. В контакт с субстратом вступает лишь небольшая часть молекулы фермента, обычно от 5 до 10 аминокислотных остатков, формирующих активный центр фермента. Роль остальных аминокислотных остатков состоит в обеспечении правильной конформации молекулы фермента для оптимального протекания химической реакции.

Активный центр на всех этапах ферментативного катализа нельзя рассматривать как пассивный участок для связывания субстрата. Это комплексная молекулярная "машина", использующая разнообразные химические механизмы, способствующие превращению субстрата в продукт.

В активном центре фермента субстраты располагаются таким образом, чтобы участвующие в реакции функциональные группы субстратов находились в непосредственной близости друг к другу. Это свойство активного центра называют эффектом сближения и ориентации реагентов. Такое упорядоченное расположение субстратов вызывает уменьшение энтропии и, как следствие, снижение энергии активации (Е_а), что определяет каталитическую эффективность ферментов.
Активный центр фермента также способствует дестабилизации межатомных связей в молекуле субстрата, что облегчает протекание химической реакции и образование продуктов. Это свойство активного центра называют эффектом деформации субстрата (рис. 2-12).
Рис. 2-12. Этапы ферментативного катализа. I - этап сближения и ориентации субстрата относительно активного центра фермента; II - образование фермент-субстратного комплекса (ES) в результате индуцированного соответствия; III - деформация субстрата и образование нестабильного комплекса фермент-продукт (ЕР); IV- распад комплекса (ЕР) с высвобождением продуктов реакции из активного центра фермента и освобождением фермента.

95

В. Молекулярные механизмы ферментативного катализа

Механизмы ферментативного катализа определяются ролью функциональных групп активного центра фермента в химической реакции превращения субстрата в продукт. Выделяют 2 основных механизма ферментативного катализа: кислотно-основной катализ и ковалентный катализ.

1. Кислотно-основной катализ

Концепция кислотно-основного катализа объясняет ферментативную активность участием в химической реакции кислотных групп (доноры протонов) и/или основных групп (акцепторы протонов). Кислотно-основной катализ - часто встречающееся явление. Аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, имеют функциональные группы, проявляющие свойства как кислот, так и оснований.

К аминокислотам, участвующим в кислотно-основном катализе, в первую очередь относят Цис, Тир, Сер, Лиз, Глу, Асп и Гис. Радикалы этих аминокислот в протонированной форме - кислоты (доноры протона), в депротонированной - основания (акцепторы протона). Благодаря этому свойству функциональных групп активного центра ферменты становятся уникальными биологическими катализаторами, в отличие от небиологических катализаторов, способных проявлять либо кислотные, либо основные свойства.

Примером кислотно-основного катализа, в которм кофакторами являются ионы Zn²⁺, а в качестве кофермента используется молекула NAD⁺, можно привести фермент алкогольдегидрогеназу печени, катализирующую реакцию окисления спирта (рис. 2-13):

С₂Н₅ОН + NAD⁺ → СН₃-СОН + NADH + H⁺

2. Ковалентный катализ

Ковалентный катализ основан на атаке нук-леофильных (отрицательно заряженных) или электрофильных (положительно заряженных) групп активного центра фермента молекулами субстрата с формированием ковалентной связи между субстратом и коферментом или функциональной группой аминокислотного остатка (как правило, одной) активного центра фермента.

Действие сериновых протеаз, таких как трипсин, химотрипсин и тромбин, - пример механизма ковалентного катализа, когда ковалентная связь образуется между субстратом и аминокислотным остатком серина активного центра фермента. Термин "сериновые протеазы" связан с тем, что аминокислотный остаток серина входит в состав активного центра всех этих ферментов и участвует непосредственно в катализе. Рассмотрим механизм ковалентного катализа на примере хи-мотрипсина, осуществляющего гидролиз пептидных связей при переваривании белков в двенадцатиперстной кишке (см. раздел 9). Субстратами химотрипсина служат пептиды, содержащие аминокислоты с ароматическими и циклическими



Рис. 2-13. Механизм кислотно-основного катализа на примере алкогольдегидрогеназы печени. I - молекула этилового спирта имеет центр связывания, обеспечивающий гидрофобное взаимодействие активного центра и метильной группы спирта; II - положительно заряженный атом цинка способствует отщеплению протона от спиртовой группы этанола с образованием отрицательно заряженного атома кислорода. Отрицательный заряд перераспределяется между атомом кислорода и соседним атомом водорода, который затем в виде гидритиона переносится на четвёртый углеродный атом никотинамида кофермента NAD+; III - в результате формируется восстановленная форма NADH и уксусный альдегид.

96

гидрофобными радикалами (Фен, Тир, Три), что указывает на участие гидрофобных сил в формировании фермент-субстратного комплекса. Механизм ковалентного катализа химотрипсина рассмотрен на рис. 2-14.

Радикалы Асп₁₀₂, Гис₅₇ и Сер₁₉₅ участвуют непосредственно в акте катализа. Вследствие нуклеофильной атаки пептидной связи субстрата происходит разрыв этой связи с образованием ковалентно-модифицированного серина - ацил-химотрипсина. Другой пептидный фрагмент высвобождается в результате разрыва водородной связи между пептидным фрагментом и Гис₅₇ активного центра химотрипсина. Заключительный этап гидролиза пептидной связи белков - деацилирование химотрипсина в присутствии молекулы воды с высвобождением второго фрагмента гидролизуемого белка и исходной формы фермента.

Активаторы и ингибиторы ферментов

Каталитическая функция ферментов определяется также присутствием в среде активаторов и ингибиторов: первые повышают скорость реакции, вторые —тормозят.

Активаторами ферментов могут быть вещества самой разнообразной природы: НСL - активирует действие пепсина, желчные кислоты — панкреатической липазы. Особенно часто в качестве активаторов выступают ионы двухвалентных металлов, реже одновалентных. Например для К+, N+ - АТФазы, обеспечивающее транспорт одновалентных катионов через клеточную мембрану необходимы ионы магния, калия, натрия. Многие ферменты вообще неактивны в отсутствии металлов (при удалении цинка карбоангидраза практически лишена ферментативной активности). Роль металлов в активирующем действии ферментов.

• в ряде случаев выполняют функции простетических груш ферментов;

• могут способствовать образованию фермент-сустратного комплекса;

• могут выступать в роли аллостерического эффектора

Ингибиторы по типу ингибирования делят на 2 группы:

обратимого действия - когда комплекс фермент-ингибитор непрочен и быстро диссоциирует, активность фермента при этом восстанавливается (после диализа или Сильного разведения раствора)

2; необратимого действия - в основе стойкие изменения ил модификации функциональных групп фермента

По механизму действия ингибиторы ферментов делятся на следующие основные группы: 1) конкурентные 2) неконкурентные : 3) бесконкурентные; 4) субстратные; 5) аллостерические.

конкурентным ингибированием (рис 13) называекя торможение ферментативной реакции, вызванной связыванием с активным центром фермента ингибитора, сходного по структуре с субстратом и препятствующего образованию фермент-субстратного комплекса. При конкурентном торможении ингибитор и субстрат, будучи сходными по строению, конкурируют за активный центр фермента. С активным центром связывается то соединение, молекул которого больше. С ферментом связан либо ингибитор, субстрат. Ингибирование наступает вследствие того, что субстратоподобный ингибитор связывает часть молекул фермента, которые уже не способны образовывать фермент-субстратный комплекс. Снять торможение можно избытком субстрата, вытесняющего ингибитор из активных центов ферментных молекул, тем та самым возвращая им способность к катализу.

Конкурентными ингибиторами могут быть метаболиты, накопление которых регулирует активность ферментов, и чужеродные вещества.

Явление конкурентного ингибирования ферментов имеет практическое применение:

• конкурентное ингибирование лежит в основе механизма действия ряда групп фармакологических препарат» (антихолинэстеразные средства: прозерин, физостигмин; средства-антиметаболиты: фторурацил, меркаптопурин)

• ингибиторы холинэстеразы необратимого действия (фосфорорганические соединения) используются в качеств инсектицидов. (дихлофос, хлорофос) и как боевые отравляющие вещества (зарин, зоман);

• открывает перспективы создания новых лекарственных средств (возможность поиска антиметаболитов, обладающих свойствами конкурентных ингибиторов).

Неконкурентным ингибированием ферментов называется торможение, связанное с влиянием ингибитора на каталитическое превращение, но не на связывание фермента и субстрат. Неконкурентный ингибитор или связывается непосредственно каталитическими группами активного центра фермента. или. связываясь с ферментом вне активного центра. изменяет конформацию активного центра, мешая взаимодействию с субстраты. Поскольку неконкурентный ингибитор не влияет на связывание субстрата, то комплекс фермент-ингибитор способен присоединить субстрат, но дальнейшего превращения субстрата не про- исходит, так как каталитические группы заблокированы, Снять действие неконкурентного ингибитора избытком субстрата (ка» действие конкурентного) нельзя, а можно лишь веществами, связывающими ингибитор. Эти вещества называют реактиваторами.

Неконкурентными ингибиторами геминового фермента цитохромоксидазы являются цианиды, которые прочно соединяются с трёхвалентным железом. Блокада этого фермента выключает дыхательную цепь, и клетка погибает. К неконкурентным ингибиторам ферментов относятся ионы тяжёлых металлов и их органические кис соединения (ионы тяжёлых металлов ртути, свинца, кадмия, мышьяка). Они блокируют, например, SH - группы, входящие в каталитический участок фермента и являются очень токсичными.

Неконкурентные ингибиторы применяются:

• как фармакологические средства (ртутные диуретики; препараты висмута для лечения си препараты сурьмы для лечения лейшманиоза);

• как инсектициды, фунгициды в сельском хозяйстве;

• как боевые отравляющие вещества (синильная кислота, цианиды);

Бесконкурентным ингибированием называется торможение торможением иферментативной реакции, вызванное присоединением ингибитора, только к комплексу фермент- субстрат. Бесконкурентный ингибитор не соединяется с ферментом в отсутствие субстрата. Более того, ингибитор облегчает присоединение субстрата, а затем, связываясь сам, ингибирует фермент.

Субстратным ингибированием называется торможение ферментативной реакции, вызванное избытком субстрата. Такое ингибирование происходит вследствие образования ферментного комплекса, не способного подвергаться каталитическим превращениям. Субстратное торможение снимается при снижении концентрации субстрата.

Аллостерическое ингибирование характерно только для особой группы ферментов, имеющих аллостерические центры. Механизм действия аллостерических ингибиторов заключается в изменении конформации активного центра фермента. Аллостерическими эффекторами ферментов наиболее часто выступают различные метаболиты, а также гормоны, ионы металлов, коферменты. В редких случаях роль аллостерического эффектора выполняют молекулы субстрата.

Явление аллостерического ингибирования лежит в основе аллостерической регуляции ферментов, когда конечный продукт метаболического процесса выступает в роли ингибитора первого фермента цепи; такая регуляция является регуляцией по типу обратной связи и позволяет контролировать выход конечного продукта накопления которого прекращается работа первого фермента цепи.

3. «Сухая» химия и экспресс-диагностика.

В настоящее время в клинической лабораторной диагностике, наряду с применением для определения физиологических и патологических компонентов мочи и крови методов «жидкой химии», все шире используютсяметодология «сухой» химии.Они реализуются с применением специальных полосок, реагентные зоны которых содержат сухие реагенты, способные воздействовать на определенные метаболиты биологических жидкостей с изменением окраски индикаторной зоны.

Индикаторные тест-полоски применяются для полуколичественного и количественного определения диагностически значимых компонентов мочи, крови и других биосред. Их использование незаменимо для срочного анализа, (выполняемого в присутствии пациента в поликлинике, приёмном отделении, в больничной палате или дома, на месте лечения пациентов.

Необходимость быстрого получения объективной информации о жизнедеятельности организма возникает, в первую очередь, при критических состояниях, вызванных острой кровопотерей, шоком, сердечной, легочной или почечной недостаточностью, обширными ожогами, множественными травмами. В таких ситуациях результаты биохимических анализов непосредственно определяют конкретные действия врача. Кроме общепринятых клинических анализов крови и мочи проводят биохимические исследования.

Нарушения кислородного обеспечения, кислотно-основного состояния и электролитного баланса являются ведущими факторами в развитии тяжелых осложнений и необратимых состояний. Поэтому время от взятия анализа до получения конечных результатов врачом в таких случаях не должно превышать 5-7 минут. Экспресс-анализы необходимы в отделениях реанимации, интенсивной терапии и для этого используются автоматические полианализаторы, определяющие одновременно несколько показателей.

Возможность получить объективную информацию о состоянии пациента непосредственно на приеме врача существенно ускоряет процесс постановки клинического диагноза и назначения лечения. Такая необходимость может также возникнуть при диспансерных и профосмотрах на производстве, в экспедиционных условиях, в изолированных отдаленных местах проживания, на кораблях, в поездах дальнего следования, в спортивной медицине.

В настоящее время имеются большое количество специальных наборов и тест-полосок, позволяющих выполнить анализы в течение 3-10 минут в присутствии пациента. В основе их действия лежат биохимические (образование окрашенных продуктов реакции) и иммунологические (агрегация, агглютинация) методы. При этом не требуются какие-либо дополнительные реактивы или оборудование, так как оценка результатов проводится визуально с использованием эталонной шкалы, прилагающейся к набору тест-полосок.

Простота и быстрота процедуры определяют большую популярность и широкую распространенность экспресс-диагностики с использованием методов «сухой химии». Однако в ряде случаев результаты, полученные с их использованием, требуют подтверждения более объективными количественными методами. Наборы и тест-полоски имеют длительный срок хранения (1 год и более).

Получение иммобилизованных ферментов (искусственно полученного комплекса фермента нерастворимым в воде носителем), значительно расширило сферу применения биокатализаторов. Различают иммобилизацию ковалентную и нековалентную (иммобилизацию физическими методами).

Первый тип основан на ковалентном связывании фермента нерастворимым материалом или молекул фермента между собой с образованием нерастворимых полиферментных комплексов. Нековалентная иммобилизация включает: адсорбцию включение в гели, микроинкапсулирование; в данном случае отметается способность фермента диссоциировать на субъединицы с последующим переходом в раствор не связанных с носителем субъединиц и падением активности фермента. В этом случае приходиться прибегать к дополнительным способам стабилизации - иммобилизованных ферментов:

• использованию «поперечно сшивающих» агентов с целью наложения межсубъединичных сшивок, вследствие чего фермент теряет способность к диссоциации;

• включению ферментов в гели с подбором таких размеров ор, который был бы меньше размеров субъединиц фермента.

При применении так называемой «мягкой» адсорбционнойиммобилизации , включающей предварительную обработку адсорбента липидами, изменяющими степень его гидрофобности, при последующей сорбции фермент связывается с «мягкой» поверхностью липидного слоя, а не с жесткой поверхностью адсорбента. Искусственно связанные с носителями, “иммобилизованные ферменты, сохраняющие свою каталитическую активность, отличаются повышенной термостабильностью и устойчивостью к протеиназам, а, следовательно, увеличением времени жизни и пролонгацией действия, антигенные свойства их значительно снижены.

Ряд иммобилизованных ферментов с успехом применяется в:

• использование тампонов, бинтов с иммобилизованными на них протеазами— для ускорения заживления ран и ожогов и предотвращения гнойных осложнений;

• создание протезов кровеносных сосудов и сердечных клапанов из тромборезистентного материала на основе полимеров с иммобилизованными на них тромболитическими ферментами;

• использование иммобилизованных терапевтических белков в экстракорпоральных реакторах (уреазы, фен илаланиламмиаклиазы — в лечении почечной недостаточности, фенилкетонурии).

Коферменты – это органические вещества, предшественниками которых являются витамины. Некоторые из них непрочно связаны с белком (НАД, НSКоА, и др). есть ферменты, которые прочно связаны с апоферментом, т.е. представляют собой простетическую группу (гем и флавиновые коферменты).

Коферменты в каталитических реакциях осуществляют транспорт различных групп атомов, электронов или протонов. Коферменты связываются с ферментами:

- ковалентными связями;

- ионными связями;

- гидрофобными взаимодействиями и т.д.

Один кофермент может быть коферментом для нескольких ферментов. Многие коферменты являются полифункциональными (например, НАД, ПФ). В зависимости от апофермента зависит специфичность холофермента.

Все коферменты делят на две большие группы: витаминные и невитаминные.

Большинство коферментов не синтезируются в организме млекопитающих. Они должны поступать в организм с пищей (как правило, растительной). Однако в организм попадают не сами коферменты, а их предшественники — витамины. В клетке витамины модифицируются до коферментной формы. В настоящее время известно 13 витаминов, которые подразделяют на два типа:водорастворимые витамины жирорастворимые витамины.

Характеристика основных коферментов по их функциям

 

Коферменты	Тип реакции, в которой участвует кофермент, роль кофермента и участие активной группы в катализе	Витамин-предшественник
Биотицин	КарбоксилированиеПрисоединение карбоксильной группы путем замещения атома водорода у азота активной группой кофермента. Затем карбоксильная группа переносится на субстрат	Биотин (Витамин Н)
Кофермент (коэнзим) А (НSКоА)	Реакция ацилирования.Образование высокоэнергетической тиоэфирной группы с карбоксильными группами карбоновых кислот R-СО-SКоА	Пантотеновая кислота
Никотинамидадениндинуклеотид,(НАД) никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ) – никотинамидные коферменты	Окислительно-восстановительные реакции. При окислении субстрата к пиридиновому кольцу присоединяются 1 протон (2-й переходит в среду) и 2 электрона, при этом положительный заряд утрачивается.	Никотинамид (витамин РР)
Пиридоксальфосфат (ПФ)	Трансаминирование, декарбоксилирование аминокислот. При сближении азота аминокислоты и углерода альдегидной группы ПФ образуется альдиминная связь. Далее после вутримолекулярных перестроек образуется аминогруппа на коферменте и кетогруппа на бывшей аминокислоте.	Пиридоксин (В6)
Тиаминпирофосфат (ТПФ)	Декарбоксилирование α-кетокислот. Разрывается связь, следующая за кетогруппой субстратов, высвобождается СО2, между кетогруппой субстрата и углеродом тиазолового кольца ТПФ образуется ковалентная связь. Это промежуточное соединение катализа.	Тиамин (В1)
Флавинмононуклеотид, (ФМН) флавин-адениндинуклеотид, (ФАД) - флавиновые коферменты	Окислительно-восстановительные реакции. Два атома водорода от субстрата присоединяются к атома азота N1 и N10	Рибофлавин (В2)
Тетрагидрофолат	Перенос одноуглеродных групп	Фолиевая кислота
Дезоксиаденозилкобаламин	Перенос связанного с углеродом атома водорода на соседний атом углерод	Витамин В12

2. Регуляция активности ферментов может осуществляться путём взаимодействия ферментов с различными биологическими компонентами или чужеродными соединениями, которые называются регуляторами ферментов. Они могут либо ускорять, либо замедлять ферментативную реакцию.

Активаторы– это вещества, увеличивающие скорость ферментативной реакции.

Виды активаторов:

1. Вещества, влияющие на область активного центра. К ним относятся ионы металлов (Na+, K+, Fe2+, Co2+, Cu2+, Ca2+, Zn2+, Mg2+, Mn2+ и др.). В ряде случаев ионы металлов выполняют функцию кофактора фермента. В других случаях они способствуют присоединению субстрата к активному центру фермента. Ионы металлов оказываются активаторами только в условиях дефицита их в организме.

2. Аллостерические эффекторы, которые связываются с аллостерическим (регуляторным) участком апофермента. Это связывание вызывает конформационные изменения в молекуле белка, приводящие к изменению структуры активного центра, что сказывается на связывании и превращении субстрата в активном центре. При этом активность фермента либо увеличивается (это аллостерические активаторы), либо уменьшается (это аллостерические ингибиторы). Аллостерическими эффекторами ферментов наиболее часто выступают различные метаболиты, а также гормоны, ионы металлов, нуклеозиды - АТФ, АДФ, АМФ.

3. Вещества, вызывающие модификации, не затрагивающие активный центр фермента

Ингибитораминазывают вещества, вызывающиеснижение активности фермента. Следует различать инактивацию и ингибирование фермента. Сам по себе факт торможения ферментативной реакции в присутствии какого-либо вещества ещё не говорит о том, что это вещество – ингибитор. Любые денатурирующие агенты вызывают инактивацию фермента и торможение ферментативной реакции. Ингибиторы, в отличие от денатурирующих агентов, действуют в малых концентрациях и вызывают специфическое снижение ферментативной активности.

По прочности связывания с ферментом ингибиторы делятся на обратимые и необратимые. Необратимые ингибиторы прочно связываются с ферментом, тогда как комплекс фермент – обратимый ингибитор непрочен. Если сильно разбавить раствор фермента с обратимым ингибитором, то их комплекс распадается и активность фермента восстанавливается.

По механизму действия ингибиторы делятся на конкурентные и неконкурентные. Конкурентные ингибиторы имеют структурное сходство с молекулой субстрата, что позволяет им занять место субстрата в активном центре фермента:

E + S + I → EI + S

Встраиваясь вместо субстрата в активный центр, такой ингибитор не даёт ферментативной реакции осуществиться. То есть, субстрат конкурирует с ингибитором за активный центр. С активным центром связывается то соединение, молекул которого больше. Снять конкурентное ингибирование можно, увеличив концентрацию субстрата.

Неконкурентные ингибиторы не имеют структурного сходства с субстратами. Они или связываются с каталитическими группами активного центра фермента, или, связываясь с ферментом вне активного центра, изменяют конформацию активного центра таким образом, что это препятствует превращению субстрата. Поскольку неконкурентный ингибитор не влияет на связывание субстрата, то в отличие от конкурентного ингибирования наблюдается образование тройного комплекса:

E + S + I → ESI

К неконкурентным ингибиторам относятся ионы тяжёлых металлов: ртути, свинца, кадмия, мышьяка. Они блокируют SH-группы, входящие в каталитический участок фермента. Снять действие неконкурентного ингибитора избытком субстрата, как при конкурентном ингибировании, нельзя, а можно лишь веществами, связывающими ингибитор (реактиваторами). Тяжелые металлы лишь в небольших концентрациях играют роль ингибиторов, в больших концентрациях они действуют как денатурирующие агенты.

Наиболее важными неконкурентными ингибиторами являются образующиеся в живой клетке промежуточные продукты метаболизма, способные обратимо связываться с аллостерическими участками фермента – аллостерические ингибиторы. Они занимают ключевое положение в метаболизме, поскольку тонко реагируют на изменения в обмене веществ и регулируют прохождение веществ по целой системе ферментов. 

3. Амилаза (другие названия – альфа-амилаза, диастаза, панкреатическая амилаза) это биологически активное вещество, участвующее в процессе метаболизма углеводов. В организме человека большая ее часть вырабатывается поджелудочной железой, меньшая – слюнными железами.

Различают два основных типа (изофермента) амилазы: панкреатическую амилазу (вырабатывается в поджелудочной железе) и амилазу слюны. 
Альфа-амилаза слюнных желез (птиалин) и панкреатическая амилаза, выделяемая поджелудочной железой в просвет двенадцатиперстной кишки, поэтапно осуществляют расщепление высокомолекулярных углеводов до простых сахаров. 
Амилаза желудка имеет второстепенное значение по отношению к амилазам слюнных желез и поджелудочной железы. 

Значительно более низкой амилазной активностью обладают также такие органы как яичники, фаллопиевы трубы, тонкий и толстый кишечник, печень.

 У человека α-амилаза является основным пищеварительным ферментом. 
Амилаза обеспечивает переваривание углеводов пищи, расщепляя их и преобразуя в глюкозу. Благодаря этому же ферменту глюкоза усваивается организмом.
Амилаза слюнных желез начинает этот процесс и может фактически совершить переваривание значительной части крахмала до поступления его в тонкую кишку и контакта с панкреатической амилазой. 

Основное переваривание углеводов происходит в тонком кишечнике, где для этого имеются все необходимые условия: слабощелочная среда и ферменты, катализирующие распад гликозидных связей в углеводах. 

Активность α-амилазы оптимальна при нейтральной pH = 6,7-7,0. Активность амилазы подавляется кислой средой, создаваемой желудочным соком. 
Большая часть панкреатической амилазы расщепляется в нижней части кишечного тракта трипсином, небольшое количество попадает в кровь. 
Из организма амилазу выводят почки вместе с мочой.

 

Признаком дефицита амилазы в ЖКТ может быть ее повышен-ное содержание в крови при:
- остром или хроническом панкреатите;
- кисте поджелудочной железы; 
- камне, опухоли в протоке поджелудочной железы;
- раке поджелудочной железы;
- эпидемическом паротите;
- остром перитоните;
- сахарном диабете;
- заболеваниях желчных путей (холецистит);
- почечной недостаточности;
- непроходимости кишечника; 

Признаком дефицита амилазы в ЖКТ может также быть ее пониженное содержание в крови при
- недостаточности поджелудочной железы; 
- некрозе клеток поджелудочной железы;
- муковисцидозе;
- поражениях печени

Альфа- амилаза является кальций-зависимым ферментом, так как ее деятельность активируется ионом кальция.

Определение уровня амилазы в крови и моче применяется при диагностике заболеваний поджелудочной железы, слюнных желез, причин боли в животе.

 

1. 
   Характеристика ферментов как биологических катализаторов. Строение ферментов.
   

Ферменты – это катализаторы биологической природы (белки), которые обеспечивают протекание биохимических процессов в живых клетках. Ф. не входят в состав конечных продуктов реакции. Ф. не тратятся в процессе катализа. Ф. только ускоряют реакции, протекающие без них. Ф. не могут возбудить реакции, протекающие по законам термодинамики. Ф. не смещают положение равновеся, а лишь ускоряют его движение. Одна молекула Ф. при обычных условиях может катализировать превращение от тысячи до миллиона молекул в-ва в минуту. Простые ферменты состоят только из АК, а сложные из 2х частей: белковой (апофермент) и небелковой (кофактор). Если кофактор прочно связан с апоферментом, он называется простетической группой, если непрочно – коферментом. Кофактор – это ионы металла или сложные органические соединения, которые выполняют функцию стабилизаторов молекулы субстрата, активного центра фермента и конформации белковой молекулы фермента

Ферменты как биологические катализаторы обладают всеми общими свойствами обычных катализаторов. Общие свойства катализаторов: 1) сами не вызывают химическую реакцию, а только ускоряют реакцию, которая протекает и без них; 2) не влияют на энергетический итог реакции; 3) в обратимых реакциях ускоряют как прямую, так и обратную реакцию, причем в одинаковой степени. Все ферменты — белки, поэтому имеют свои особенности. Общие свойства ферментов: 1) высокая эффективность действия — ускоряют реакцию в 10^8–10^12 раз; 2) высокая избирательность ферментов к субстратам (субстратная специфичность) и к типу катализируемой реакции (специфичность действия); 3) высокая чувствительность к неспецифическим физико-химическим факторам среды — температуре, рН, ионной силе раствора; 4) высокая чувствительность к химическим реагентам; 5) высокая и избирательная чувствительность к физико-химическим воздействиям тех или иных химических веществ, которые благодаря этому могут взаимодействовать с ферментом, улучшая или затрудняя его работу.

Строение ферментов

Субстрат (S) — вещество, химические превращения которого в продукт (Р) катализирует фермент (Е).

S + E ——> P, фермент снижает энергию активации; за счет этого реакция ускоряется.

Активный центр фермента — участок поверхности молекулы фермента, непосредственно взаимодействующий с молекулой субстрата. Образован из остатков аминокислот, находящихся в составе различных участков полипептидной цепи или различных полипептидных цепей, пространственно сближенных. Возникает на уровне третичной структуры белка-фермента.

В его пределах различают три области:

1) каталитический центр — область (зона) активного центра фермента, непосредственно участвующая в химических преобразованиях субстрата. Формируется за счет радикалов 2–3 аминокислот, расположенных в разных местах полипептидной цепи фермента, но пространственно сближенных между собой за счет изгибов этой цепи. Если фермент — сложный белок, то в формировании каталитического центра нередко участвует простетическая группа молекулы фермента — кофермент (например, все водорастворимые витамины и жирорастворимый витамин K);

2) адсорбционный центр — участок активного центра молекулы фермента, на котором происходит сорбция (связывание) молекулы субстрата. Формируется 1, 2, чаще 3 радикалами аминокислот, расположенными рядом с каталитическим центром. Главная функция — связывание молекулы субстрата и передача этой молекулы каталитическому центру в наиболее удобном положении (для каталитического центра). Сорбция происходит только за счет слабых типов связей и потому обратима. По мере формирования этих связей происходит конформационная перестройка адсорбционного центра, которая приводит к более тесному сближению субстрата и активного центра фермента, более точному соответствию между их пространственными конфигурациями. Именно структура адсорбционного центра определяет субстратную специфичность фермента;

3) аллостерические центры — такие участки молекулы фермента вне его активного центра, которые способны связываться слабыми типами связей (значит — обратимо) с тем или иным веществом (лигандом). Это связывание приводит к такой конформационной перестройке молекулы фермента, которая распространяется и на активный центр, облегчая либо затрудняя (замедляя) его работу. Соответственно такие вещества называются аллостерическими активаторами, или аллостерическими ингибиторами данного фермента. Аллостерические центры найдены не у всех ферментов.

2. 
   Принцип количественного определения активности ферментов. Единицы активности.
   

Обнаружение ферментов основано на их высокой специфичности. Ферменты обнаруживают по производимому ими действию, т.е. по факту протекания той реакции, которую катализирует данный фермент. Например, амилазу обнаруживают по реакции расщепления крахмала до глюкозы.

Критериями протекания ферментативной реакции могут быть:

• 
  исчезновение субстрата реакции
  
• 
  появление продуктов реакции
  
• 
  изменение оптических свойств кофермента.
  

Так как концентрация ферментов в клетках очень низка, то определяют не их истинную концентрацию, а о количестве фермента судят косвенно, по активности фермента.

Активность ферментов оценивают по скорости ферментативной реакции, протекающей в оптимальных условиях (оптимум температуры, РН, избыточно высокая концентрация субстрата). В этих условиях скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента (V= K₃[F₀]).

Единицы активности (количества) фермента

В клинической практике используют несколько единиц активности фермента.

1. Международная единица – то количество фермента, которое катализирует превращение 1 микромоля субстрата за минуту при температуре 25⁰ С.

2. Катал (в системе СИ) – то количество фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата за секунду.

3. Удельная активность – отношение активности фермента к массе белка фермента.

4. Молекулярная активность фермента показывает, сколько молекул субстрата превращается под действием 1 молекулы фермента.

3. 
   Иммуноферментный анализ, принцип, возможности использования.
   

Одним из наиболее часто используемых методов в клинической и экспериментальной биохимии, вирусологии, микробиологии, ветеринарии, контроле технологии производства в медицинской и микробиологической промышленности, охране окружающей среды является в настоящее время иммуноферментный анализ (ИФА), в котором ферменты также выступают в качестве неотъемлемого компонента тест-системы.

Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу конъюгата (антивидового иммуноглобулина, меченого ферментом). Фермент вызывает разложение хромогенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо фотометрически.

Существует множество вариантов постановки ИФА, из которых наибольшее практическое значение получил гетерогенный твердофазный ИФА. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции.

Самым распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция – процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а так же с помощью образования водородных связей присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые планшеты или полистироловые шарики.

Для ферментативной метки конъюгата могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза.

Широкое использование стандартной конфигурации 96-луночного планшета позволило унифицировать оборудование, необходимое для проведения ИФА. Принципиальная схема твердофазного неконкурентного ИФА состоит из нескольких стадий.

Стадия 1. Специфические антигены пришиты к пластику лунок планшета. В лунку добавляется исследуемая сыворотка, и если в ней есть антитела (эти антитела наз-тся первыми) к данным антигенам, во время инкубации происходит взаимоузнавание, в результате которого образуется принципиально значимая связь антиген/антитело.

Стадия 2. После отмывки лунок от несвязавшихся субстанций в каждую лунку добавляются вторые антитела. Они узнают человеческие антитела определенного типа (IgA, IgG, IgM). К этим вторичным антителам химически пришит активный фермент. такое комплексное соединение называется конъюгат. Во время инкубации происходит взаимоузнавание первых и вторых антител, в результате чего в лунке образуется структура типа «сэндвич».

Стадия 3. После отмывки не связавшегося конъюгата в лунку добавляется бесцветный субстрат, на который действует фермент. в результате субстрат превращается в окрашенный продукт. Количество окрашенного продукта измеряется на фотометре при определенной длине волны.

Таким образом, количество цветного продукта прямо пропорционально количеству фермента в лунке, а значит и количеству конъюгата в «сэндвиче». Количество конъюгата прямо пропорционально тому количеству комплекса антиген-антитело, которое получается на стадии 1 ИФА. Следовательно, измерение развившейся цветной реакции на стадии 3 точно коррелирует с наличием специфических антител в анализируемой сыворотке. Время проведения анализа 1-3 часа.

В клинико-диагностических лабораториях ИФА применяется для следующих целей:

- диагностика инфекционных и паразитарных заболеваний: токсоплазмоза, герпеса, хламидиаза, трихомониаза, вирусов гепатита С и В, коревой краснухи, лямбиоза, микоплазмоза, описторхоза, сифилиса, уреаплазмоза, ВИЧ-инфекции.

- определение содержания гормонов и других биологически активных веществ: лютеинизирующий гормон, фолликолустимулирующий гормон, инсулин, пролактин, тестостерон, прогестерон, эстрадиол, кортизол, тиреотропный гормон, трийодтиронин, тироксин, определение цитокинов и др.

- диагностика ранних сроков беременности

- пренатальная диагностика пороков развития плода

- определение онкомаркеров: альфа-фетопротеина (для печени), раково-эмбриональный антиген (для кишечника), простатспецифический антиген, нейроспецифический антиген (маркер молочной железы), Са-125 (для яичников).


Билет 9

1. 
   Классификация ферментов. Характеристика классов. Шифр ферментов. Примеры.
   

1. 
   Современные  классификация  и номенклатура ферментов  были разработаны Комиссией по  ферментам  Международного биохимического союза и утверждены на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г. в Москве.
   

Согласно Международной классификации, ферменты делят на шесть главных классов, в каждом из которых несколько подклассов: 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы; 4) лиазы; 5) изомеразы; 6) лигазы (синтетазы)

7. 
   Оксидоредуктазы. К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие с участием двух субстратов окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисления
   
8. 
   Трансферазы. К классу трансфераз относят ферменты, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов и радикалов.
   
9. 
   Гидролазы. В класс гидролаз входит большая группа ферментов, катализирующих расщепление внутримолекулярных связей органических веществ при участии молекулы воды.
   
10. 
    Лиазы. К классу лиаз относят ферменты, катализирующие разрыв связей С—О, С—С, С—N и других, а также обратимые реакции отщепления различных групп от субстратов не гидролитическим путем. Эти реакции сопровождаются образованием двойной связи или присоединением групп к месту разрыва двойной связи.
    
11. 
    Изомеразы. К классу изомераз относят ферменты, катализирующие взаимопревращения оптических и геометрических изомеров
    
12. 
    Лигазы (синтетазы). К классу лигаз относят ферменты, катализирующие синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада АТФ (или другого нуклеозидтрифосфата)
    

Шифр ферментов:

Каждый фермент имеет свой шифр из четырехзначного числа, где первая цифра означает класс ,вторая – подкласс , третья – подподкласс , а четвертая – порядковый номер фермента в данном подподклассе .

Пример: Пепсин имеет классификационный номер – КФ.3.4.4.1. где 3 – класс гидролаз, 4-подкласс реакции гидролиза пептидн. связи белка ,4-подподкласс,1-порядковый номер фемента в данном подподклассе

Номенклатура ферментов:

Каждый фермент, как правило, имеет две номенклатуры; одна из них рабочая (тривиальная), а другая - систематическая. Систематическое название фермента складывается из названий субстратов химической реакции ,на которую действует фермент ,название типа катализируемого химического превращения и окончание –аза.

Пример: L-Лактат : (субстрат I) НАД+ (субстрат II) – Оксидоредуктаза тип химического превращения

Систематическое название дается только по изученным ферментам!!!

2. 
   Факторы, влияющие на активность ферментов
   

К основным свойствам ферментов относят:

• 
  термолабильность;
  
• 
  зависимость активности от pH среды;
  
• 
  специфичность действия;
  
• 
  влияние на активность активаторов и ингибиторов.
  

Влияние температуры

В соответствии с законами химической кинетики скорость химической реакции повышается в два раза при повышении тем­пературы на 10°С. Однако вследствие белковой природы фермен­тов тепловая денатурация фермента при повышении температуры будет снижать эффективную концентрацию фермента. Так, до 45- 50°С преобладает эффект повышения скорости реакции, выше 45°С более существенной становится тепловая денатурация и быстрое падение скорости реакции.

Оптимальной температурой для действия большинства фер­ментов теплокровных является диапазон 37-40°С. При 100‘С почти все ферменты утрачивают свою активность (исключение - миоки- наза мышц, аденилаткиназа - выдерживающие режим кипячения). При низких температурах (0° и ниже ферменты, как правило, не денатурируют, хотя активность их падает почти до 0).
Термозависимость ферментов используется в практике:

• для разработки режима хранения продуктов питании; фер­ментативных препаратов; органов и тканей, являющихся материалом для трансплантации (сохранность их при низ­ких температурах является результатом низкой акгивности собственных ферментов и ферментов микроорганизмов)

• 
  при проведении длительных и травматичных операций на фоне искусственной гипотермии (замедление скорости ферментативных реакций позволяет снизить потребность в энергетических субстратах и кислороде и повышает то­лерантность тканей, в частности, к гипоксии и кровопотере)
  
• 
  при искусственной гиперпирексии как составного компо­нента терапии ряда хронических инфекционных процес­сов
  

Влияние pH среды

Большинство ферментов наиболее активно в пределах узкой зоны концентрации водородных ионов, соответствующей физио­логическим значениям pH среды (pH 6,0-8,0). Оптимум pH среды для конкретного фермента - это такое значение pH среды, при котором фермент проявляет максимальную активность

Большая часть ферментов клеток имеет оптимум pH, близкий к нейтральному (исключение - пепсин имеет оптимум pH 1,5- 2,0). Отклонение pH в ту или другую сторону ведёт к снижению скорости ферментативной реакции, что связано с изменением ионизации кислых или основных групп аминокислотных остатков активного центра.

3. 
   Ферментные объекты лабораторных исследований. Изучение изоферментного спектра. Ферменты в качестве аналитических реагентов
   

Изоферменты – это множественные формы ферментов вследствие генетических различий в первичной структуре белка. Просто множественные формы ферментов – негенетически возникшие модификации одного и того же фермента. Наличие изоформ особенно характерно для ферментов с четвертичным уровнем структурной организации, представляющих собой объединение нескольких субъединиц. Если генетически различные субъединицы существуют более, чем в одной форме, то и фермент, образованный комбинацией из двух или нескольких типов субъединиц, может существовать в виде нескольких сходных, но неодинаковых форм. К примеру, молекула лактатдегидрогеназы, катализирующей обратимое превращение пирувата в лактат, состоит из 4 субъединиц двух типов: Н и М. различное соотношение субъединиц Н и М определяет наличие 5 изоформ данного фермента: ЛДГ-1 (НННН), ЛДГ-2 (НННМ), ЛДГ-3 (ННММ), ЛДГ-4 (НМММ), ЛДГ-5 (ММММ). Помимо различий по физико-химическим и иммунологическим свойствам данные изоферменты имеют различное представительство в тканях: ЛДГ-1 и ЛДГ-2 преобладают в миокарде, ЛДГ-4 и ЛДГ-5 в мышцах и печени. Органное распределение изоферментов является отражением определенного типа метаболизма, свойственное данным органам.

Изучение изоферментного спектра ферментов сыворотки крови широко используется в клинической практике:

• 
  Для дифференциальной диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей
  
• 
  Для суждения о локализации патологического процесса
  
• 
  Для оценки степени поражения.
  

Изоферментный спектр возникаетвследствие генетически обусловленных различий (в количеств, и качеств, отношении) для разных тканей и органов животных и растений и часто строго специфичен. Наличие или отсутствие определенных изоферментов широкоиспользуется как генетич. маркёр для определения принадлежностей особи к определ. группе, а анализ частот изоферментов одного белка — для определения границ популяций

До недавнего времени ферменты служили лишь объектом исследования в клинической биохимии, и лишь сравнительно недавно они стали использоваться, как аналитические реагенты, то есть как реактивы для количественного определения других веществ.

Преимущества ферментативных методов исследования: высокая точность, специфичность (в силу специфичности используемых ферментов), чувствительность. К этим «трем китам», на которых стоят ферментативные методы, следует добавить простоту проведения анализа, значительное сокращение времени исследования и, часто, отсутствие необходимости построения калибровочных графиков.

Использование ферментов как аналитических реагентов началось с т.н. оптического теста Варбурга. Этот тест основан на том, что восстановленные формы никотинамидадениндинуклеотидов HAДH.Н+ и HAДФН + Н+ имеют выраженный максимум поглощения в ультрафиолетовой области при 334-340-365 нм, тогда как их окисленные формулы HAД+ HAДФ+ этого максимума не имеют. Это позволяет следить за ходом ферментативной реакции по увеличению или уменьшению величины оптической плотностью (ОП) при 334, 340 или 365 нм, т.е. по увеличению или уменьшению содержания HAДH.Н+ (или НAДФH.H+) в анализируемом образце. Простейшим примером использования оптического теста Варбурга служит реакция, катализируемая лактатдегидрогеназой (ЛДГ)

Высокая эффективность биологических катализаторов и специфичность их действия делают ферменты идеальными реагентами для аналитической химии. Благодаря этим особенностям с помощью ферментов обнаруживаются вещества при предельно низкой концентрации в присутствии множества дрзтих соединений. К настоящему времени созданы искусственные аналитические системы различных конструкций (биосенсоры, датчики, ферментные электроды, проточные анализаторы), содержащие иммобилизованные ферменты и клетки и предназначенные для автоматического детектирования продуктов энзиматического превращения. Например, если использовать иммобилизованную глюкозо-оксидазу, то концентрацию окисляемой кислородом глюкозы определяют, регистрируя количество выделившегося в ходе реакции пероксида водорода

Билет 10.

1.ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ (от лат. immobiiis - неподвижный), препараты ферментов, молекулы к-рых связаны с матрицей, или носителем (как правило, полимером), сохраняя при этом полностью или частично свои каталитич. св-ва.

Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при использовании в прикладных (промышленных целях) производствах по сравнению с чистыми препаратами. Гетерогенный (иммобилизованный) катализатор легко отделить от реакционной среды, что обусловливает:

• возможность остановки реакции в любой нужный момент;

• повторное использование катализатора;

• получение конечного продукта, не загрязненного ферментом.

Методы иммобилизации ферментов

Существует два основных метода иммобилизации ферментов: физический и химический.

Физическая иммобилизация ферментов представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:

- адсорбция на нерастворимых носителях;

- включение в поры геля;

- пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны);

- включение в двухфазную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз.

Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком и носителем. Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При широком варьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность.