ферменты. Классификация и номенклатура ферментов. Характеристика классов. Шифр ферментов. Примеры
 Скачать 0.87 Mb.
|
|
Классификация и номенклатура ферментов . Характеристика классов . Шифр ферментов . Примеры Современные классификация и номенклатура ферментов были разработаны Комиссией по ферментам Международного биохимического союза и утверждены на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г. в Москве. Согласно Международной классификации, ферменты делят на шесть главных классов, в каждом из которых несколько подклассов: 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы; 4) лиазы; 5) изомеразы; 6) лигазы (синтетазы) Оксидоредуктазы. К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие с участием двух субстратов окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисления(перенос е- или атомов водорода с одного субстрата на другой). Трансферазы. К классу трансфераз относят ферменты, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов и радикалов. Гидролазы. В класс гидролаз входит большая группа ферментов, катализирующих расщепление внутримолекулярных связей органических веществ при участии молекулы воды. Лиазы. К классу лиаз относят ферменты, катализирующие разрыв связей С—О, С—С, С—N и других, а также обратимые реакции отщепления различных групп от субстратов не гидролитическим путем. Эти реакции сопровождаются образованием двойной связи или присоединением групп к месту разрыва двойной связи. Изомеразы. К классу изомераз относят ферменты, катализирующие взаимопревращения оптических и геометрических изомеров Лигазы (синтетазы). К классу лигаз относят ферменты, катализирующие синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада АТФ (или другого нуклеозидтрифосфата) Шифр ферментов: Каждый фермент имеет свой шифр из четырехзначного числа, где первая цифра означает класс ,вторая – подкласс , третья – подподкласс , а четвертая – порядковый номер фермента в данном подподклассе . Пример: Пепсин имеет классификационный номер – КФ.3.4.4.1. где 3 – класс гидролаз, 4-подкласс реакции гидролиза пептидн. связи белка ,4-подподкласс,1-порядковый номер фемента в данном подподклассе Номенклатура ферментов: Каждый фермент, как правило, имеет две номенклатуры; одна из них рабочая (тривиальная), а другая - систематическая. Систематическое название фермента складывается из названий субстратов химической реакции ,на которую действует фермент ,название типа катализируемого химического превращения и окончание –аза. Пример: L-Лактат : (субстрат I) НАД+ (субстрат II) – Оксидоредуктаза тип химического превращения Систематическое название дается только по изученным ферментам!!! Каталаза (К.Ф. 1.11.1.6.) Количественное определение активности каталазы в крови . Принцип определения. Ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях, мерой активности ферментов служит скорость исчезновения субстрата или нарастания конечного продукта реакции в единицу времени. Для выражения концентрации фермента Комиссией по ферментам Международного биохимического союза предложена стандартная единица (Е). За Международную единицу активности фермента принимается количество фермента, способное превратить один микромоль (мкМоль) субстрата за 1 минуту в стандартных условиях (при 25С ,оптимуме рН и концентрации субстрата ,превышающей концентрацию насыщения), выражается в мкмоль/мин . Удельная активность фермента –количество фермента (в мг) способное превратить 1 мкмоль субстрата за 1 мин в стандартных условиях ,выражается в мкмоль/мин^мг(белка) В соответствии с единицами измерения ,принятыми в системе СИ ,введена также единица каталитической активности ферментов КАТАЛ –количество фермента ,способное осуществить превращение 1 моль субстрата в 1 с в стандартных условиях (моль/с) Пути регуляции активности ферментов в клетке: изменение количества молекул ферментов, доступность регуляции путем фосфорилирования , дефосфорилирования , активацией проферментов. Ферменты являются регулируемыми катализаторами. В качестве регуляторов могут выступать метаболиты, яды. Различают: - активаторы – вещества, увеличивающие скорость реакции; - ингибиторы – вещества, уменьшающие скорость реакции. Активация ферментов. Различные активаторы могут связываться либо с активным центром фермента, либо вне его. К группе активаторов, влияющих на активный центр, относятся: ионы металла, коферменты, сами субстраты. Активация с помощью металлов протекает по различным механизмам: - металл входит в состав каталитического участка активного центра; - металл с субстратом образуют комплекс; - за счет металла образуется мости между субстратом и активным центром фермента. Субстраты также являются активаторами. При увеличении концентрации субстрата скорость реакции повышается. по достижению концентрации насыщения субстрата эта скорость не изменяется. Если активатор связывается вне активного центра фермента, то происходит ковалентная модификация фермента: 1) частичный протеолиз (ограниченный протеолиз). Таким образом активируются ферменты пищеварительного канала: пепсин, трипсин, химотрипсин. Трипсин имеет состояние профермента трипсиногена, состоящего из 229 АК остатков. Под действием фермента энтерокиназы и с добавлением воды он превращается в трипсин, при этом отщепляется гексапептид. Изменяется третичная структура белка, формируется активный центр фермента и он переходит в активную форму. 2) фосфорилирование - дефосфорилирование. Пр.: липаза+АТФ= (протеинкиназа) фосфорилированная липаза+АДФ. Это трансферная реакция, использующая фосфат АТФ. При этом осуществляется перенос группы атомов от одной молекулы к другой. Фосфорилированная липаза является активной формой фермента. Таким же путем происходит активация фосфорилазы: фосфорилаза B+ 4АТФ= фосфорилаза А+ 4АДФ Также при связывании активатора вне активного центра происходит диссоциация неактивного комплекса «белок-активный фермент». Например, протеинкиназа – фермент, осуществляющий фосфорилирование (цАМФ-зависимое). Протеинкиназа – это белок, имеющий четвертичную структуру и состоящий из 2-х регуляторный и 2-х каталитических субъединиц. R2C2+2цАМФ=R2цАМФ2+ 2С. Такой тип регуляции называется аллостерической регуляцией (активацией). Ингибирование ферментов. Ингибитор – это вещество, вызывающее специфическое снижение активности фермента. Следует различать ингибирование и инактивацию. Инактивация – это, например, денатурация белка в результате действия денатурирующих агентов. По прочности связывания ингибитора с ферментом ингибиторы делят на обратимые и необратимые. Необратимые ингибиторы прочно связаны и разрушают функциональные группы молекулы фермента, которые необходимы для проявления его каталитической активности. Все процедуры по очистке белка не влияют на связь ингибитора и фермента. Пр.: действие фосфорорганических соединений на фермент – холинэстеразу. Хлорофос, зарин, зоман и др. фосфорорганические соединения связываются с активным центром холинэстеразы. В результате происходит фосфорилирование каталитических групп активного центра фермента. В следствии молекулы фермента, связанные с ингибитором, не могут связываться с субстратом и наступает тяжелое отравление. Также выделяют обратимые игнибиторы, например прозерин для холинэстеразы. Обратимое ингибирование зависит от концентрации субстрата и ингибитора и снимается избытком субстрата. По механизму действия выделяют: - конкурентное ингибирование; - неконкурентное ингибирование; - субстратное ингибирование; - аллостерическое. 1) Конкурентное (изостерическое) ингибирование – это торможение ферментативной реакции, вызванное связыванием ингибитора с активным центром фермента. При этом ингибитор имеет сходство с субстратом. В процессе происходит конкуренция за активный центр: образуются фермент-субстратные и ингибитор-ферментные комплексы. E+S®ES® EP® E+P; E+I® E. Пр.: сукцинатдегидрогеназная реакция [рис. COOH-CH2-CH2-COOH®(над стрелкой СДГ, под ФАД®ФАДН2) COOH-CH=CH-COOH]. Истинным субстратом этой реакции является сукцинат (янтарная к-та). Ингибиторы: малоновая к-та (COOH-CH2-COOH) и оксалоацетат (COOH-CO-CH2-COOH). [рис. фермента с 3 дырками+ субстрат+ ингибитор= комплекс ингибитора с ферментом] Пр.: фермент холинэстераза катализирует превращение ацетилхолина в холин: (CH3)3-N-CH2-CH2-O-CO-CH3® (над стрелкой ХЭ, под – вода) CH3СOOH+(CH3)3-N-CH2-CH2-OH. Конкурентными ингибиторами являются прозерин, севин. 2) Неконкурентное ингибирование – торможение, связанное с влиянием ингибитора на каталитическое превращение, но не на связывание фермента с субстратом. В этом случае ингибитор может связываться и с активным центром (каталитический участок) и вне его. Присоединение ингибитора вне активного центра приводит к изменению конформации (третичной структуры) белка, вследствие чего изменяется конформация активного центра. Это затрагивает каталитический участок и мешает взаимодействию субстрата с активным центром. При этом ингибитор не имеет сходства с субстратом и это ингибирование нельзя снять избытком субстрата. Возможно образование тройных комплексов фермент-ингибитор-субстрат. Скорость такой реакции не будет максимальной. К неконкурентным ингибиторам относят: - цианиды. Они связываются с атомом железа в цитохромоксидазе и в результате этого фермент теряет свою активность, а т.к. это фермент дыхательной цепи, то нарушается дыхание клеток и они гибнут. - ионы тяжёлых металлов и их органические соединения (Hg, Pb и др.). Механизм их действия связан с соединением их с различными SH-группами. [рис. фермента с SH-группами, иона ртути, субстрата. Все это соединяется в тройной комплекс] - ряд фармакологических средств, которые должны поражать ферменты злокачественных клеток. Сюда же относятся ингибиторы, использующиеся в сельском хозяйстве, бытовые отравляющие вещества. 3) Субстратное ингибирование – торможение ферментативной реакции, вызванное избытком субстрата. Происходит в результате образования фермент-субстратного комплекса, неспособного подвергаться каталитическому превращению. Его можно снять и уменьшить концентрацию субстрата. [рис. связывания фермента сразу с 2 субстратами] 4) Аллостерическое ингибирование – торможение ферментативной реакции, вызванное присоединением аллостерического ингибитора в аллостерическом центре аллостерического фермента. Такой тип ингибирования характерен для аллостерических ферментов, имеющих четвертичную структуру. В качестве ингибиторов могут выступать метаболиты, гормоны, ионы металлов, коферменты. Механизм действия: а) присоединение ингибитора к аллостерическому центру; б) изменяется конформация фермента; в) изменяется конформация активного центра; г) нарушается комплиментарность активного центра фермента к субстрату; д) уменьшается число молекул ES; е) уменьшается скорость ферментативной реакции. К особенностям аллостерических ферментов относят ингибирование по отрицателтной обратной связи. A®(E1)B®(E2) C®(E3) D (от D стрелочка к стрелке между А и В). D – метаболит, действующий как аллостерический ингибитор на фермент Е1 Распределение ферментов в организме. Множественные формы, изоферменты. Пример. Ферменты, участвующие в синтезе белков, нуклеиновых кислот и ферменты энергетического обмена присутствуют во всех клетках организма. Но клетки, которые выполняют специальные функции, содержат и специальные ферменты. Так клетки островков Лангерганса в поджелудочной железе содержат ферменты, катализирующие синтез гормонов инсулина и глюкагона. Ферменты, свойственные только клеткам определенных органов называют органоспецифическими: аргиназа и урокиназа - печень, кислая фосфатаза - простата. По изменению концентрации таких ферментов в крови судят о наличии патологий в данных органах. В клетке отдельные ферменты распределены по всей цитоплазме, другие встроены в мембраны митохондрий и эндоплазматического ретикулума, такие ферменты образуют компартменты, в которых происходят определенные, тесно связанные между собой этапы метаболизма. Многие ферменты образуются в клетках и секретируются в анатомические полости в неактивном состоянии - это проферменты. Часто в виде проферментов образуются протеолитические ферменты (расщепляющие белки). Затем под воздействием рН или других ферментов и субстратов происходит их химическая модификация, и активный центр становится доступным для субстратов. Множественные формы ферментов – это ферментные белки, катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но отличающиеся друг от друга по ряду свойств: по скорости передвижения в электрическом поле, температурному оптимуму, отношению к ингибиторам, иммунологической характеристике, месту локализации. Природа появления множественных форм ферментов разнообразна. Изоферменты – это множественные формы ферментов вследствие генетических различий в первичной структуре белка. Просто множественные формы ферментов – негенетически возникшие модификации одного и того же фермента. Наличие изоформ особенно характерно для ферментов с четвертичным уровнем структурной организации, представляющих собой объединение нескольких субъединиц. Если генетически различные субъединицы существуют более, чем в одной форме, то и фермент, образованный комбинацией из двух или нескольких типов субъединиц, может существовать в виде нескольких сходных, но неодинаковых форм. К примеру, молекула лактатдегидрогеназы, катализирующей обратимое превращение пирувата в лактат, состоит из 4 субъединиц двух типов: Н и М. различное соотношение субъединиц Н и М определяет наличие 5 изоформ данного фермента: ЛДГ-1 (НННН), ЛДГ-2 (НННМ), ЛДГ-3 (ННММ), ЛДГ-4 (НМММ), ЛДГ-5 (ММММ). Помимо различий по физико-химическим и иммунологическим свойствам данные изоферменты имеют различное представительство в тканях: ЛДГ-1 и ЛДГ-2 преобладают в миокарде, ЛДГ-4 и ЛДГ-5 в мышцах и печени. Органное распределение изоферментов является отражением определенного типа метаболизма, свойственное данным органам. Изучение изоферментного спектра ферментов сыворотки крови широко используется в клинической практике: Для дифференциальной диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей Для суждения о локализации патологического процесса Для оценки степени поражения. Специфичность. Виды. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ. Это способность фермента катализировать превращения только одного определенного субстрата или же группы сходных по строению субстратов. Определяется структурой адсорбционного участка активного центра фермента. Различают 3 типа субстратной специфичности: 1) АБСОЛЮТНАЯ субстратная специфичность - это способность фермента катализировать превращение только одного, строго определенного субстрата. 2) ОТНОСИТЕЛЬНАЯ субстратная специфичность - способность фермента катализировать превращения нескольких, сходных по строению, субстратов. 3) СТЕРЕОСПЕЦИФИЧНОСТЬ - способность фермента катализировать превращения определенных стереоизомеров. 4) Относительная групповая специфичность-фермент специфически действует на вещества , имеющие определенный тип химической связи; такие ферменты проявляют широкий спектр действия 5)Абсолютная групповая специфичность — фермент действует на субстраты, имеющие общую функциональную группу.( алкоголь- дегидрогеназа катализирует превращение не только этанола , но и ряд других алифатических спиртов) Например, фермент оксидаза L-аминокислот способен окислять все аминокислоты, но относящиеся только к L-ряду. Таким образом, этот фермент обладает относительной субстратной специфичностью и стереоспецифичностью одновременно. Специфичность действия - это способность фермента катализировать только определенный тип химической реакции. В соответствии со специфичностью действия все ферменты делятся на 6 классов. Классы ферментов обозначаются латинскими цифрами. Название каждого класса ферментов соответствует этой цифре. Ферменты обладают высокой специфичностью действия. Это свойство часто существенно отличает их от неорганических катализаторов. Так, мелкоизмельченные платина и палладий могут катализировать восстановление (с участием молекулярного водорода) десятков тысяч химических соединений различной структуры. Высокая специфичность ферментов обусловлена конформационной и электростатической комплементарностью между молекулами субстрата и фермента и уникальной структурной организацией активного центра, обеспечивающими «узнавание», высокое сродство и избирательность протекания одной какой-либо реакции из тысячи других химических реакций, осуществляющихся одновременно в живых клетках. Различают: Относительная групповая специфичность – фермент специфически действует на вещества, имеющие определенный тип химической связи ( протеиназы гидролизуют все соединения, содержащие в своем составе пептидную связь –СО-NH-; эстеразы расщепляют эфирную связь -О`- ). Такие ферменты проявляют широкий спектр действия. Относительная субстратная специфичность – фермент катализирует превращение субстратов, принадлежащих к разным группам химических соединений (цитохром Р450 участвует в гидроксилировании около 7000 разных соединений). Абсолютная групповая специфичность – фермент действует на субстраты, имеющие общую функциональную группу (алкогольдегидрогеназа катализирует превращение не только этанола, но и других алифатических спиртов). Абсолютная субстратная специфичность – фермент катализирует превращение только одного субстрата (уреаза – расщепляет только мочевину, ацетилхолинэстераза – только ацетилхолин). Стереохимическая субстратная специфичность – фермент катализирует превращение только одного из возможных стереоизомеров субстрата ( оксидазы D- и L- аминокислот). Иммуноферментный анализ, принцип, возможности использования. Одним из наиболее часто используемых методов в клинической и экспериментальной биохимии, вирусологии, микробиологии, ветеринарии, контроле технологии производства в медицинской и микробиологической промышленности, охране окружающей среды является в настоящее время иммуноферментный анализ (ИФА), в котором ферменты также выступают в качестве неотъемлемого компонента тест-системы. Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу конъюгата (антивидового иммуноглобулина, меченого ферментом). Фермент вызывает разложение хромогенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо фотометрически. Существует множество вариантов постановки ИФА, из которых наибольшее практическое значение получил гетерогенный твердофазный ИФА. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Самым распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция – процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а так же с помощью образования водородных связей присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые планшеты или полистироловые шарики. Для ферментативной метки конъюгата могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза. Широкое использование стандартной конфигурации 96-луночного планшета позволило унифицировать оборудование, необходимое для проведения ИФА. Принципиальная схема твердофазного неконкурентного ИФА состоит из нескольких стадий. Стадия 1. Специфические антигены пришиты к пластику лунок планшета. В лунку добавляется исследуемая сыворотка, и если в ней есть антитела (эти антитела наз-тся первыми) к данным антигенам, во время инкубации происходит взаимоузнавание, в результате которого образуется принципиально значимая связь антиген/антитело. Стадия 2. После отмывки лунок от несвязавшихся субстанций в каждую лунку добавляются вторые антитела. Они узнают человеческие антитела определенного типа (IgA, IgG, IgM). К этим вторичным антителам химически пришит активный фермент. такое комплексное соединение называется конъюгат. Во время инкубации происходит взаимоузнавание первых и вторых антител, в результате чего в лунке образуется структура типа «сэндвич». Стадия 3. После отмывки не связавшегося конъюгата в лунку добавляется бесцветный субстрат, на который действует фермент. в результате субстрат превращается в окрашенный продукт. Количество окрашенного продукта измеряется на фотометре при определенной длине волны. Таким образом, количество цветного продукта прямо пропорционально количеству фермента в лунке, а значит и количеству конъюгата в «сэндвиче». Количество конъюгата прямо пропорционально тому количеству комплекса антиген-антитело, которое получается на стадии 1 ИФА. Следовательно, измерение развившейся цветной реакции на стадии 3 точно коррелирует с наличием специфических антител в анализируемой сыворотке. Время проведения анализа 1-3 часа. В клинико-диагностических лабораториях ИФА применяется для следующих целей: - диагностика инфекционных и паразитарных заболеваний: токсоплазмоза, герпеса, хламидиаза, трихомониаза, вирусов гепатита С и В, коревой краснухи, лямбиоза, микоплазмоза, описторхоза, сифилиса, уреаплазмоза, ВИЧ-инфекции. - определение содержания гормонов и других биологически активных веществ: лютеинизирующий гормон, фолликолустимулирующий гормон, инсулин, пролактин, тестостерон, прогестерон, эстрадиол, кортизол, тиреотропный гормон, трийодтиронин, тироксин, определение цитокинов и др. - диагностика ранних сроков беременности - пренатальная диагностика пороков развития плода - определение онкомаркеров: альфа-фетопротеина (для печени), раково-эмбриональный антиген (для кишечника), простатспецифический антиген, нейроспецифический антиген (маркер молочной железы), Са-125 (для яичников). 2 Принцип количественного определения активности фермента. Единица активности. Определение активности фермента. Ввиду того, что ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях, мерой активности ферментов служит скорость исчезновения субстрата или нарастание конечного продукта реакции в единицу времени. Для выражения концентрации фермента Комиссией по ферментам Международного биохимического союза предложена стандартная единица (Е). За международную единицу активности фермента принимается количество фермента, способное превратить один микромоль ( мкМоль) субстрата за 1 минуту в стандартных условиях ( при с=25 С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения), выражается мкмоль/мин. Удельная активность фермента- количество ( в мг), способное превратить 1 мкмоль субстрата за 1 мин в стандартных условиях, выражается в МКМОЛЬ/ МИН*МГ(БЕЛКА). В соответствии с единицами измерения, принятыми в системе СИ , введена также единица каталитической активности ферментов КАТАЛ — количество фермента, способное осуществить превращение 1 моль субстрата в 1 с в стандартных условиях моль/с. ( может так же применяться иммуноферментный анализ) 3 .применение ферментов в медицине. Основные принципы Энзимодиагностики. Применение ферментов в качестве лекарственных средств. Наибольший вклад современная медицинская энзимология вносит в области: энзимопатологии энзимодиагностики энзимотерапии энзимодиагностика. Ферментам принадлежит большая роль в диагностике заболеваний. Особое значение имеет узучение ферментного состава кроки и других биологических жидкостей. Понижение или повышение активности фермента в крови , а так же появление в крови ферментов, отсутствующих в ней в норме, служат объективными диагностическими критериями патологических изменений. Достоинства: высокая специфичность возможность проявления отклонений на ранних , нередко на доклинических стадиях заболевания Определение активности фермента в биологических жидкостях в настоящее время является обязательным компонентом диагностики: инфаркта миокарда ( креатинкиназа, лактатдегидрогеназа и их изоформы) заболеваний поджелудочной железы( амилаза сыворотки крови и мочи) патологии печени врожденных гемолитических анемий патологий мозга (изоферменты креатинкиназы) Энзимотерапия разработаны лекарственные формы ферментных препаратов . Широко распространена заместительная терапия заболеваний желудочно-кишечного тракта (фестал,панкреатин, мезим-форте) протеазы (трипсин, химотрипсин) широко применяются в лечении: воспалительных заболеваний раневого процесса ожогов обструктивных состояний дыхательной системы Ингибиторы протеаз (контрикал, трасилол, ингитрил) занимают важное место в лечении деструктивных форм панкреатита, при чрезмерной активности системы фибринолиза; ингибиторы ангиотензинконвертирующего фермента — в терапии артериальных гипертензий Так же применяются иммобилизованные ферменты ( нерастворимые ферменты) : использование тампонов, бинтов с иммобилизованными на них протеазами — для ускорения заживания ран и ожогов и предотвращения гнойных образований. Создание протезов кровеносных сосудов и сердечных клапанов из тромборезистентного материала на основе полимеров с иммобилизованными ферментами Иммобилизированные ферменты .Сам термин "иммобилизованные ферменты узаконен в 1971 году, и означает любое ограничение свободы передвижения белковых молекул в пространстве. Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными предшественниками: 1. Гетерогенный катализатор легко отделим от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт. 2. Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой реакции и выход продукта. 3. Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства, такие как специфичность (особенно в отношении макромолекулярного субстрата), зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям. 4. Можно регулировать каталитическую активность иммобилизованных ферментов путем изменения свойств носителя действием физических факторов, таких как свет и звук. Иммобилизовать ферменты можно как путем связывания на нерастворимых носителях, так и путем внутримолекулярной или межмолекулярной сшивки белковых молекул низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также путем присоединения к растворимому полимеру. Для проведения потенциометрического анализа обычно собирают гальванический элемент, на одном из электродов которого протекает электрохимическая реакция с участием определяемого иона или иона, который реагирует с определяемым. При схематическом изображении разных гальванических элементов или электродов используют условную запись, которая достаточно полно отображает состав и характерные особенности элемента. Полярография органических соединений.Можно определять:1. вещества, имеющие полярографично активные группы 2. вещества, которые могут адсорбироваться на поверхности электрода. Особенность полярографии органических соединений – существует зависимость потенциала полуволны от природы и рН раствора, так как ионы Н+ принимают участие в электрохимической реакции Второй особенностью является достаточно низкая растворимость органических веществ в воде, поэтому часто добавляют органические растворители: спирты, ацетон, ацетатна кислота, диметилформамид и т.д. .Свойства ферментов Влияние на скорость химической реакции: ферменты увеличивают скорость химической реакции, но сами при этом не расходуются. 2. Специфичность действия ферментов.Специфичность действия фермента – это способность ускорять протекание одной определенной реакции, не влияя на скорость остальных, даже очень похожих. Различают:Абсолютную – когда Ф катализирует только одну определенную реакцию (аргиназа – расщепление аргинина) Относительную (групповую спец) – Ф катализирует определенный класс реакций (напр. гидролитическое расщепление) или реакции при участии определенного класса веществределенной реакции, не влияя на скорость остальных, даже очень похожих. Активность ферментов – способность в разной степени ускорять скорость реакции. Активность выражают в: 1) Международных единицах активности – (МЕ) количество фермента, катализирующего превращение 1 мкМ субстрата за 1 мин. 2) Каталах (кат) – количество катализатора (фермента), способное превращать 1 моль субстрата за 1 с. 3) Удельной активности – число единиц активности (любых из вышеперечисленных) в исследуемом образце к общей массе белка в этом образце. 4) Реже используют молярную активность – количество молекул субстрата превращенных одной молекулой фермента за минуту. Активность зависит в первую очередь от температуры. Наибольшую активность тот или иной фермент проявляет при оптимальной температуре. Для Ф живого организма это значение находится в пределах +37,0 - +39,0 °С, в зависимости от вида животного. При понижении температуры, замедляется броуновское движение, уменьшается скорость диффузии и, следовательно, замедляется процесс образования комплекса между ферментом и компонентами реакции (субстратами). В случае повышения температуры выше +40 - +50 °С молекула фермента, которая является белком, подвергается процессу денатурации. При этом скорость химической реакции заметно падает Активность ферментов зависит также от рН среды. Для большинства из них существует определенное оптимальное значение рН, при котором их активность максимальна. Поскольку в клетке содержатся сотни ферментов и для каждого из них существуют свои пределы опт рН, то изменение рН это один из важных факторов регуляции ферментативной активности. Так, в результате одной химреакции при участии определенного фермента рН опт которого лежит в перделах 7.0 – 7.2 образуется продукт, который является кислотой. При этом значение рН смещается в область 5,5 – 6.0. Активность фермента резко снижается, скорость образования продукта замедляется, но при этом активизируется другой фермент, для которого эти значения рН оптимальны и продукт первой реакции подвергается дальнейшему химическому превращению. (Еще пример про пепсин и трипсин). 2.Особенности строения и функционирования, локализация в метаболических путях аллостерических ферментов. Примеры. Аллостерическими называют ферменты, активность которых регулируется не их субстратами, а другими веществами, присоединяющимися к ферментам в особых участках, удаленных от их активного центра. Эти вещества влияют на активность фермента, вызывая обратимое изменение в структуре его активного центра. Называются такие вещества аллостерическими эффекторами Примером аллостерического фермента может служить фосфофруктокиназа, катализирующая фосфорилирование фруктозо-6-фосфата с образованием фруктозо-1,6-бисфосфата. Эти ферменты, как правило, занимают ключевые позиции в обмене веществ, располагаясь в "стратегических" пунктах клеточного метаболизма - начале метаболических путей или местах разветвлений, где расходятся или сходятся несколько путей. 3. принципы количественного определения ферментов. Примеры. Единицы активности. Единица активности ферментов КАТАЛ – количество ферментов, способное осуществить превращение 1 моль субстрата в 1 с стандартных условиях. Активность фермента выражается в скорости скопления продукта либо скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент. В практике традиционно употребляют: единицы количества вещества – моль (и его производные ммоль, мкмоль), гр (кг, мг), единицы времени – минутка, час, секунда, единицы массы либо размера – гр (кг, мг), литр (мл).  Билет №6 1. Методы выделения и очистки ферментов: Гомогенизация Фракционирование Хроматография: гельпроникающая ионообменная гидрофобная афинная Электрофорез и изоэлектрическая фокусировка |