007 СОП - Малярия. Клиникодиагностическая лаборатория

• Название: Клиникодиагностическая лаборатория
• Дата: 14.06.2022
• Размер: 74.5 Kb.
• Имя файла: 007 СОП - Малярия.doc
• Тип: Документы; #589868

У правление делами Президента РФ

Федеральное государственное бюджетное учреждение

Объединённая больница с поликлиникой
Москва, Мичуринский пр-т, 6. www.fgu-obp.ru
КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ

УТВЕРЖДАЮ

Главный врач ФГБУ «ОБП»

___________________ С.И. Дорохов

«______» __________________ 2018 г.

СИСТЕМА МЕНЕДЖМЕНТА КАЧЕСТВА

СТАНДАРТНАЯ ОПЕРАЦИОННАЯ ПРОЦЕДУРА
Обнаружение возбудителей

малярии и микрофиляриоза

СОП КДЛ 007/29.01-2018
Экземпляр № _____

Разработчик:

Заведующий отделением Н.И. Разливаева

Врач клинической лабораторной диагностики Е.В. Петухова

29.01.2018

1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ.

1.1. Настоящая стандартная операционная процедура (СОП) показывает порядок обнаружения возбудителей малярии и микрофиляриоза методом микроскопии препаратов крови.

1.2. Настоящая СОП предназначена для врачей клинической лабораторной диагностики и фельдшеров-лаборантов КДЛ ФГБУ ОБП УДП РФ.

2. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ.

2.1. ГОСТ Р 53022.1-2008 Технологии лабораторные клинические. Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 1. Правила менеджмента качества клинических лабораторных исследований.

2.2. ГОСТ Р 53079.2-2008 - Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 2. Руководство по управлению качеством в клинико-диагностической лаборатории. Типовая модель.

2.3. ГОСТ Р 53079.4-2008. Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа.

2.4. ГОСТ Р ИСО 15189-2015. Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности.

2.5. МУК 3.2.987-00. Профилактика паразитарных заболеваний.

3. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ.

Безусловным подтверждением диагноза служит обнаружение возбудителей малярии или микрофиляриоза при микроскопическом исследовании крови. Особое значение имеет раннее выявление возбудителя тропической малярии, при несвоевременной диагностике которой возможен летальный исход. Определение вида паразита служит основанием для выбора рациональной терапии и правильной организации противоэпидемических мероприятий.

Паразитологическая диагностика малярии основана на обнаружении бесполых и половых форм возбудителя при микроскопическом исследовании крови, что возможно только в период его развития в эритроците. Для обнаружения плазмодиев и определения их вида используют препараты крови, приготовленные методом "тонкого мазка" и "толстой капли", окрашенные по Романовскому-Гимза.

Оба метода, имеющие свои преимущества и недостатки, являются взаимодополняющими. Основной метод - "толстая капля". Благодаря распределению относительно большего объема крови на меньшей площади, за один и тот же промежуток времени просматривается количество крови в 30-40 раз большее, чем в "тонком мазке", что значительно повышает шанс обнаружения паразитов, особенно при низкой паразитемии. Начинать надо всегда с просмотра "толстой капли".
          Чувствительность метода "толстой капли" такова, что при просмотре 100-150 полей зрения можно обнаружить около 8 паразитов в 1 мкл крови. Концентрация исследуемой крови на ограниченной площади приводит к многослойному расположению эритроцитов. Для того чтобы паразиты были видимы, "толстую каплю" окрашивают нефиксированной; это приводит к гемолизу эритроцитов, и паразиты подвергаются деформации. Несмотря на определенную специфичность, такая деформация иногда может препятствовать идентификации вида паразита. Ограничиться просмотром "толстой капли" можно только, если вид паразита был первоначально установлен.

"Толстая капля" относительно быстро позволяет выявить и других паразитов крови: трипаносом, микрофилярий, спирохет, бабезий и др. Отрицательный паразитологический результат изучения "толстой капли", но повышенное содержание остатков незрелых эритроцитов позволяет предположить перенесенную недавно малярию (при отсутствии соответствующих анамнестических данных).

Обнаружение повышенного содержания лейкоцитов, их видовой состав, а также повышенное содержание остатков незрелых эритроцитов, позволяют предположить иное заболевание, не связанное с малярией. В "тонком мазке", фиксированном до окраски, сохраняются морфологические особенности как пораженного эритроцита, так и присущие данному виду паразита. Большое значение для дифференциального диагноза имеет характер изменения пораженных эритроцитов. "Тонкий мазок" крови делают в дополнение к "толстой капле". В тех случаях, когда вид возбудителя в очаге установлен, для эпиднадзора за очагом можно ограничиться методом "толстой капли".

4. ТРЕБОВАНИЯ К ОБЕСПЕЧЕНИЮ ВЫПОЛНЕНИЯ

ТЕХНОЛОГИИ.

Реактивы.

1. Этиловый спирт 96°.  

2. Азур-эозин по Романовскому-Гимза (промышленный маточный раствор или сухая краска).
3. Метиленовый синий.
4. Этиловый эфир.
5. Глицерин.
6. Тетраборат натрия (бура).
7. Калий фосфат однозамещенный безводный - KH2PO4.
8. Натрий фосфат двузамещенный безводный – Na2HPO4.
9. Смесь Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в равных частях).
10. Дистиллированная вода.
11. Индикаторная бумага (диапазон рН 5,0-8,0).
12. Фильтровальная бумага.
13. Химическая посуда: мерные цилиндры или стаканы на 10, 50 и 100 мл; градуированные центрифужные пробирки; колбы и стаканы; стеклянные палочки.
14. Предметные стекла
15. Шлифованные стекла.
16. Фарфоровая ступка с пестиком.
17. Аптечные равноплечие или электронные весы.
18. Эмалированные кюветы.
19. Пинцеты.
20. Часы песочные или сигнальные.
21. Стеклянные мостики или специальные контейнеры для окрашивания препаратов крови.
22. Скарификаторы стерильные одноразовые.
23. Бинты стерильные, вата.
24. Перчатки резиновые.
25. Микроскоп с осветителем (объективом х90 или х100, окуляром х7; х10).
26. Термостат.
27. Холодильник.

5. ТРЕБОВАНИЯ К ТЕХНОЛОГИИ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ.

5.1. Подготовка предметных стекол.

1. Предметные стекла новые замачивают в мыльном растворе, нагревают до 60-80 °С, но не кипятят.

2. Каждое предметное стекло протирают ветошью с обеих сторон в этом растворе.

3. Промывают в проточной воде в течение 2-3 ч, периодически перемешивая.

4. Погружают в дистиллированную воду на 30 мин.

5. Проверяется качество отмывки предметных стекол от щелочи: на предметное стекло наносят 1 каплю фенолфталеина - появление розовой окраски раствора свидетельствует о недостаточной отмывке от щелочи.

6. Стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и помещают для обезжиривания в смесь Никифорова (из расчета 1 мл смеси на 1 стекло), где они могут храниться в течение длительного времени.

7. Извлеченные пинцетом из смеси Никифорова стекла протирают хлопчатобумажной стираной материей, заворачивают в чистую гладкую не ворсистую (!) бумагу небольшими партиями и стерилизуют.

Стекла, многократно бывшие в употреблении, для приготовления препаратов крови использовать не рекомендуется. При необходимости их использования, следует удалить следы иммерсионного масла простиранной ветошью, затем отмыть каждое стекло от окрашенных препаратов крови в теплом мыльном растворе (для этой цели удобно использовать зубную щетку с коротко срезанной щетиной). Дальнейшая обработка - такая же, как и новых стекол.

5.2. Приготовление и хранение реактивов.

Раствор краски Романовского-Гимза.

Маточный раствор краски Романовского-Гимза (промышленный или приготовленный из сухой субстанции) представляет собой густую темно-фиолетовую жидкость, которую можно хранить длительное время в хорошо закупоренных бутылях из темного стекла в сухом защищенном от света прохладном месте (но не в холодильнике). Для текущей работы перед приготовлением рабочего раствора краски Романовского-Гимза необходимое количество маточного раствора краски, отливают в небольшой флакон, обязательно фильтруя, т.к. при хранении маточного раствора может выпасть осадок. Краску следует набирать сухой пипеткой или отливать через горлышко. Для определения качества краски рабочим раствором каждой новой серии производят пробное окрашивание мазков крови.

Для приготовления маточного раствора из сухой краски Романовского-Гимза необходимы следующие реактивы:

азур-эозин - 10 г;

глицерин - 100 мл;

спирт этиловый 96° - 900 мл.
Техника приготовления краски предусматривает следующие этапы.

1. Азур-эозин тщательно растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством спирта и глицерина до получения кашицеобразной массы и сливают в колбу или бутыль из темного стекла. Затем постепенно добавляют остальной спирт и глицерин.

2. Полученную взвесь тщательно встряхивают в течение 10 мин 2-3 раза.

3. Емкость с краской помещают в термостат при температуре 37° на 3-5 дней для созревания краски с ежедневным встряхиванием этой емкости вручную не менее 10 мин. При наличии магнитной мешалки встряхивание можно продолжать несколько часов. При наличии подогревателя в мешалке взвесь можно подогревать, при этом подогрев не должен превышать 40-50°, периодически подогреватель следует выключать с тем, чтобы температура не повышалась выше указанного уровня. Встряхивание и подогрев улучшают качество краски.

После каждого встряхивания раствор снова помещают в термостат.

4. Через 3-5 дней готовый раствор краски фильтруют через бумажный фильтр.
Буферный раствор.

          Необходимые реактивы:

- дистиллированная вода - 1 л;

- фосфат калия однозамещенный безводный – KH2PO4 - 0,27 г;

- фосфат натрия двузамещенный безводный – Na2HPO4 - 0,67 г.


     Техника приготовления.     

      Соли растворить в дистиллированной воде (1/3 объема) комнатной температуры, после полного растворения довести до метки 1000 мл и размешать.
      Приготовленный раствор должен иметь рН 7,0±0,2. Точное соблюдение требуемой реакции буфера важно для правильной окраски. Если рН<6,8, то следует добавить Na2HPO4, если рН>7,2, то добавляется KH2PO4. Количество реактивов, необходимых для доведения рН, подбирается опытным путем.

      Буферный раствор следует хранить в хорошо закупоренной посуде в холодильнике (до 1 месяца). Для приготовления краски используется буферный раствор комнатной температуры. Нельзя использовать буферный раствор с осадком, который после окраски затрудняет просмотр препарата и даже может привести к диагностическим ошибкам. Периодически следует проверять рН буферного раствора, особенно при искажении цвета окрашенных элементов крови.

         

5.3. Взятие проб крови для исследования на малярию.

Кровь для паразитологического исследования берут из пальца руки (у взрослых - обычно безымянного, у детей - из большого), у новорожденных детей - из большого пальца ноги (но не мочки уха).

Периферическую кровь для исследования берут вне зависимости от температуры тела и клинических проявлений.
        Для прокола кожи пальца используют стерильные одноразовые скарификаторы или специальные стерильные разового использования иглы.
          В целях безопасности пациента взятие крови на малярию производят на стерильные предметные стекла, т.к. во время взятия крови возможно их касание к месту прокола.
           Перед проколом кожу пальца тщательно протирают ватным тампоном, смоченным в 70%-ном спирте, чем достигается не только предупреждение инфицирования места прокола, но и попадание с кожи пальца бактерий, различных посторонних частиц на препарат крови, которые могут затруднить диагностику при микроскопии.
           Первую каплю крови, выступившую после прокола, вытирают сухим стерильным ватным тампоном, чтобы избежать фиксации эритроцитов остатками спирта, которым дезинфицировали кожу.
        Последующие капли (выступающие самостоятельно или при надавливании на палец массирующими движениями) используются для приготовления препаратов крови. При этом кровь забирают в стерильный сухой гематологический капилляр, из которого быстро переносят на предметное стекло, либо выступившую кровь непосредственно из прокола пальца наносят на предметные стекла. Если кровь набирают в капилляр, то можно использовать не стерильные стекла, но подготовленные так же, как описано в п.6.1.
           От одного пациента готовят не менее 2-3 стекол с "толстыми каплями" и 2-3 "тонких мазка" крови. Рекомендуется первоначально окрасить по одному стеклу, с тем чтобы иметь возможность исправить дефекты окраски.

Препараты крови исследуют под микроскопом с применением масляной иммерсии: объектив х90 или х100, окуляр х7. Сначала микроскопируют "толстую каплю", затем для уточнения вида возбудителя - "тонкий мазок".    

5.4. Технология окрашивания.

Для окрашивания препаратов крови используется 5% или 10% водный рабочий раствор краски Романовского-Гимза.

Маточный раствор краски Романовского-Гимза (промышленного изготовления или приготовленный из сухой краски) перемешать и обязательно профильтровать.

Приготовить 5%-ный (10%-ный) рабочий раствор краски: к 95 (90) мл буферного раствора добавить 5 (10) мл маточного раствора краски, что соответствует 1-2 каплям краски на 1 мл раствора.

Готовый рабочий раствор перемешать.

При необходимости ускорения получения ответа можно использовать 20%-ный раствор, сократив время окраски до 15-20 мин.

6. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ВЫПОЛНЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ.

6.1. Красители следует хранить в сухом, защищённом от света месте, при температуре от +14 до +25^оС в течение всего срока годности.

6.2. Для получения надёжных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению красителей и микроскопии при обнаружении возбудителей.