санитарно-бактериологические исследования. санбакт.иссл. Коагулазо() стафилококков ив пищевых продуктах за исключением молока и молочных продуктов) гост 317462012 (iso 6888)
 Скачать 1.55 Mb.
|
|
Алгоритм выявления и определения количества коагулазо(+) стафилококков ив пищевых продуктах за исключением молока и молочных продуктов) ГОСТ 31746-2012 (ISO 6888) 1. Готовят пробирки с жидкой селективной питательной средой, выбранной из — бульон Жиолитти-Кантони (с добавлением теллурита калия) — глюкозный бульон (с добавлением глюкозы — солевой бульон (с добавлением соли. Высев навески (или серии разведений навески) продукта на жидкую среду производят в анаэробных условиях — среду кипятят (С) 15 мин, — вносят порцию продукта — сверху настелают тонкий слой стерильного голодного агара или парафина 3. Пробирки с посевами инкубируют при Св течение 24-48 ч. Присутствие бактерий подтверждают последующим критериям — почернение среды (восстановление теллурита до теллура — помутнение среды (утилизация глюкозы или бульона. Через 24 ч культуру из предположительно позитивных пробирок (см п) пересевают на чашки Петри c одной из дифференциально-диагностических сред (для получения индивидуальных колоний чистой культуры, например — Бэйрд-Паркер агар (желточно-теллуритный агар — молочно-солевой агар (МСА) — желточно-азидный агар — желточно-солевой агар (ЖСА, среда Чистовича) — Бэйрд-Паркер агар с кроличьей плазмой или бычьим фибриногеном; Пробирки, где нет почернения или помутнения, инкубируют еще 24 ч и также засевают на чашки с агаризованной селективной средой (см. выше. 6. Чашки Петри с посевами инкубируют при Св течение 24-48 ч. 7. Индивидуальные колонии проверяют на принадлежность к коагулазо(+) стафилококкам по морфологическим (окраска по Граму - грам(+)), культуральным и биохимическим критериям: Оценка культуральных свойств Staphylococcacei А) - пигментообразование: на молочно-солевом агаре (МСА) — колонии стафилококков на МСА имеют цвет от белого до ярко-оранжевого: S. aureus S. epidermidis S. синтезирует золотистый синтезирует, как правило, у большинства штаммов или оранжево-желтый пигмент белого или желтого пигмент отсутствует. пигмент. цвета. Б) - оценка лецитиназной активности: на желточно-солевом агаре (ЖСА) вокруг роста культуры образуется радужный венчик с перламутровым оттенком (яично-желточная реакция. S. aureus S. epidermidis 8. Оценка биохимических свойств Staphylococcacei - тест на каталазу При добавлении перекиси водорода к колониям на чашках Петри образуются пузырьки кислорода, что подтверждает наличие каталазной активности у стафилококков. Каталаза расщепляет перекись водорода на воду и кислород НО = НО + О- оценка редукции теллурита калия На Бэйрд-Паркер агаре происходит восстановление теллурита до теллура, что сопровождается почернением среды в результате липолиза и протеолиза формируются соответсвующие зоны и кольца. S. aureus S. epidermidis Чёрные блестящие колонии, Чёрные блестящие колонии окружённые прозрачной неправильной формы. зоной 2-5 мм. Матовое кольцо вокруг колоний Матовое кольцо вокруг колоний появляется через 48 ч. появляется через 24 ч. - тест на коагулазу (плазмокоагуляцию): на модифицированном Бэйрд-Паркер агаре (с плазмой кролика и бычьим фибриногеном) вокруг колоний наблюдается образование непрозрачных ареолов осадков. 9. Выделенные индивидуальные колонии коагулазо(+) стафилококков проверяют на принадлежность к S. aureus по биохимическим критериям — образование ацетоина (реакция Фогес-Проскауера - появление розового окрашивания — ферментация мальтозы в аэробных условиях используют полужидкую среду Гисса, содержащую мальтозу. После посева и инкубации (37ºC, 48 ч, вследствие ферментации мальтозы, среда приобретает синий цвет по всему столбику агара. — определение термостабильной нуклеазы (ДНКаза-тест агар — наличие гемолитической активности на кровяном агаре штаммы S. aureus, продуцирующие гемолизины, дают колонии, окружённые прозрачной зоной гемолиза (гемолиз, вследствие лизиса эритроцитов. Результаты выявления коагулазо(+) стафилококков и S. aureus обозначают как обнаружены либо не обнаружены в х см (х г) продукта. Определение наиболее вероятного числа коагулазо(+) стафилококков и S. aureus — метод НВЧ. ГОСТ 31746-2012 (ISO 6888) 1. Навески продукта и/или серию разведений навески продукта вносят в жидкую селективную питательную среду. Инкубирование посевов и подтверждение присутствия в них коагулазоположительных стафилококков и S. aureus проводят по 7,8,9 (см. выше. Наиболее вероятное число коагулазоположительных стафилококков ив см (1 г) продукта определяют для подтвержденных посевов, пользуясь НВЧ-таблицей по ГОСТ 26670. Алгоритм отбора проб для санитарно-бактериологических исследований колбасных изделий и продуктов из мяса (ГОСТ 9792-73; ГОСТ 54354-2011) 1. Пробы для микробиологических исследований отбирают до отбора проб, предназначенных для оргонолептических и физико-химических испытаний. Пробы отбирают асептическим способом, исключающим контаминацию продукта посторонними микроорганизмами стерильный инструмент, одноразовые перчатки и т.п.). 2. От кусковой продукции дог отбирают точечные пробы (не менее двух) ложкой пинцетом или другим инструментом в зависимости от вида и размера куска и помещают в посуду или упаковывают в фольгу. Если длина колбасного изделия не более 15 см, то отбирают 2 батона целиком. Сосиски и сардельки (точечные пробы) отбирают из разных мест партии, не нарушая целостности единиц продукции. Пробы скоропортящихся продуктов транспортируют при температуре +Сне более 6 часов. 3. От кусковой продукции массой более 1000 г пробы отбирают одним из следующих методов а) отрезают или вырезают часть продукта ножом или пилой. У изделий квадратной формы разрез делают продольной формы перпендикулярно к продольной оси б) продукт в нескольких местах режут ножом и с поверхности данного разреза и из глубины продукта скальпелем берут необходимое количество кусков, которые пинцетом переносят в стерильную посуду в) срезают поверхностный слой продукта толщиной от 0,5 до 1 см ножом, при помощи буравчика или зонда и выдавливают продукт в посуду. При отборе пробы из глубины продукта его просверливают в разных местах не менее чем до половины высоты. Из нескольких точечных проб составляют объединённую пробу. Из объединенной пробы каждого образца берут навеску массой 20 г, добавляют 4х-кратное количество стерильного физраствора и гомогенизируют Взвесь 15 мин выдерживают при комнатной температуре и делают высев для определения количества МАФАнМ, БГКП, бактерий рода сальмонелла и протея, сульфитредуцирующих клостридий Алгоритм определения КМАФАнМ в пищевых продуктах Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в пищевых продуктах- это количественный метод, который показывает, какое истинное или наиболее вероятное число жизнеспособных микроорганизмов, содержится в 1 г продукта плотной консистенции или 1 см продукта жидкой консистенции КМАФАнМ выражают числом колониеобразующих единиц КОЕ) в 1 г (см) продукта. Данное микробиологическое исследование проводят путем высева микроорганизмов на чашки Петри с универсальной питательной средой, МПА (мясо-пептонным агаром), или на элективные питательные среды, в случае подсчета отдельных групп микроорганизмов. 1. Готовят среднюю пробу, согласно нормативам отбора средних проб и правилам их отбора. 2. Пищевые продукты могут содержать значительное количество микроорганизмов, поэтому, чтобы получить изолированные колонии, необходимо приготовить разведения. Для этого из средней пробы берут часть продукта (соблюдая аспетику) и готовят несколько последовательных х разведений, чтобы в итоге получить на одной чашке от 30-300 колоний а) При исследовании плотных продуктов из средней пробы берут навеску массой от 1 дог, переносят ее в стерильную ступку и тщательно растирают. Растертый продукт вносят в колбу, содержащую от 90 до 99 см стерильного физиологического раствора (0,5 й раствор хлорида натрия. Содержимое колбы осторожно взбалтывают в течение 5 мин. В колбе получается е разведение продукта (1:10), из которого готовят последующие разведения. б) Для исследования жидких и полужидких продуктов из полученной средней пробы после тщательного перемешивания отбирают стерильной пипеткой 1 см продукта и вносят его в пробирку, содержащую 9 см стерильного физиологического раствора, получают разведение 1:10. 3. Полученное е разведение продукта (см. п) тщательно перемешивают пипетированием новой стерильной пипеткой и отбирают 1 см суспензии, переносят вою пробирку с 9 см стерильного физиологического раствора. Получают е разведение (1:100). Пипетку нельзя погружать в жидкость во избежание смывания микроорганизмов с ее наружной поверхности. 4. Новой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое го разведения, набирают из него 1 см и переносят в следующую пробирку с 9 см стерильного физраствор, получая третье разведение (1:1000). Таким же образом готовят последующие разведения дополучения необходимого результата. Для каждого разведения используют отдельную стерильную пипетку, во избежание получения ошибочного результата. Чашки Петри засевают методом глубинного посева на плотные питательные среды. (см. схему посева риса) Чашки подписывают (вариант и разведение. Стерильной пипеткой отбирают из пробирки 1 см суспензии соответствующего разведения и переносят впустую стерильную чашку Петри. Каждое разведение высевают не менее чем в 2-3 параллельные чашки. Разведения выбирают с таким расчетом, чтобы на чашке выросло от 30 до 300 колоний. б) После внесения суспензии микроорганизмов, чашки заливают питательной средой, предварительно остуженной до С. Для этого колбу со средой открывают над пламенем горелки, фламбируют края и вливают Рис. Схема посева для определения КМАФАнМ 10-15 см агара в приоткрытую чашку толщина слоя агара должна быть около 5 мм. в) Чашку закрывают крышкой и легкими вращательными движениями перемешивают питательную среду с посевным материалом, оставляют на 10-15 мин в горизонтальном положении для застывания среды. 6. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и помещают нач. в термостат с температурой С. После инкубации производят подсчет выросших колоний: а) Чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний, подсчитывают визуально или с помощью специального прибора для подсчета колоний. При подсчете колоний чашки просматривают в проходящем свете и отмечают подсчитанные колонии чернилами или тушью. б) Чашке, на которых выросло более 300 колоний (если они получены при максимальном разведении, подсчитывают при помощи лупы и сетки со стороной квадрата 1 см при боковом освещении. Подсчет колоний проводят не менее чем в 20 квадратах, определяют среднее их число на 1 см и умножают на площадь поверхности среды в чашке. Количество микроорганизмов в 1 см или в 1 г) продукта (КМАФАнМ, рис) определяют, как произведение количества выросших колоний (N) на показатель разведения КМАФАнМ = N •10n КОЕ/см3. Примечание. Анаэробные микроорганизмы не определяются чашечным методом, так как для их выращивания необходимо создать анаэробные условия. Рис.2 Показатели КМАФАнМ в пищевых продуктах, г/см3 |