Вирусология. Коллоквиум по вирусологии 2. Вопрос 1

• Название: Коллоквиум по вирусологии 2. Вопрос 1
• Анкор: Вирусология
• Дата: 05.04.2023
• Размер: 28.12 Kb.
• Имя файла: Вирусология.docx
• Тип: Документы; #1039842

Коллоквиум по вирусологии №2.

Вопрос № 1.

Культивирование вирусов на куриных эмбрионах.

Преимущество куриных эмбрионов:

1. 
   Высокая чувствительность к широкому спектру вирусов (не образуются антитела в ответ на заражение);
   
2. 
   Легкодоступный объект (птицефабрики и инкубаторы);
   
3. 
   Стерильность – скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрионы от бактериального и грибкового заражения со стороны внешней среды;
   
4. 
   Экономичны (не требуют ухода и кормления);
   

Требования, предъявляемые к куриным эмбрионам:

1. 
   Куриные эмбрионы должны быть получены из благоприятных по инфекционным заболеваниям хозяйств;
   
2. 
   Скорлупа яиц должна быть непигментированной, чистой (мыть нельзя);
   
3. 
   Возраст эмбриона должен соответствовать выбранному методу заражения;
   
4. 
   Куриные эмбрионы могут быть использованы для заражения вирусами с 5-го по 12-ый день инкубации;
   

Заражение:

1. 
   В желточный мешок – с 5-го по 7-й день инкубации;
   
2. 
   В амниотическую полость – с 6-го по 1-ый день;
   
3. 
   В аллантоисную – на 9-11-ый день;
   
4. 
   На хорионаллантоисную оболочку – на 10-12-ый день;
   

Содержание куриных эмбрионов в лабораторных условиях:

1. 
   Куриные эмбрионы содержат в термостате при температуре 37°С и влажности 60-70%;
   
2. 
   Качество яйца оценивается по: размеру, состоянию скорлупы, форме;
   
3. 
   Скорлупная оболочка должна быть гладкой, матового тона, целостной;
   
4. 
   Яйца с темными пятнами не допускаются к исследованию (бактерии или плесневые грибы);
   

Подготовка куриных эмбрионов к заражению:

1. 
   Подготовка рабочего места, дезинфекция скорлупы, овоскопирование (просмотр яиц против яркого источника света);
   
2. 
   На скорлупной оболочке карандашом отмечают 3 участка: границу воздушной камеры, место расположения зародыша и бессосудистые зоны размером 0,5 на 0,5 см;
   
3. 
   Определяют погиб или жив зародыш;
   

Заражение в аллантоисную полость:

Вирусы гриппа, ньюкалской болезни, ринопневмонии лошадей, везикулярного стоматита и тд.

В скорлупе на стороне зародыша делают отверстие диаметром около 1 мм. Иглу с вирус содержащим материалом вводят параллельно продольной оси на глубину 10-12 мм. Отверстие в скорлупе запечатывают расплавленным стерильным парафином.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку:

Вирусы оспы, чумы плотоядных, катаральной лихорадки овец и др. (пантропные и дерматропные вирусы).

В скорлупе против центра воздушной камеры вырезают отверстие диаметром 15-20 мм. Пинцетом снимают подскорлупную оболочку, на обнажившийся участок ХАО вводят 0,2 мм вирус содержащей суспензии, отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают расплавленным парафином.

Заражение в желточный мешок:

Вирусы катаральной лихорадки овец, хламидий, ринопневмонии лошадей и др.

Игла вводится на глубину 3,5-4 см под углом 45°.

Признаки размножения вируса в курином эмбрионе:

1. 
   Индикация вирусов (индикацию вирусов в курином эмбрионе осуществляют на основании специфических поражений в различных структурах эмбриона, а также в РГА. Кроме того, в характерные для данного вируса сроки может наблюдаться гибель эмбриона);
   
2. 
   Изменение тела зародыша:
   

• 
  Зародыш может отставать в росте и развитии от незараженных;
  
• 
  Тело его может быть обезвожено, шея характерно перекручена (инфекционный бронхит кур);
  
• 
  Кожа зародыша может быть гиперемирована, с кровоизлияниями;
  
• 
  Внутренние органы также могут быть изменены (например, увеличенная желто-зеленого или темно-зеленого цвета печень – признак размножения в ней вируса гепатита утят);
  

3. 
   Существуют вирусы, которые, размножаясь в эмбрионах не вызывают ни патологоанатомических изменений, ни гибели. Выявить такой вирус можно с помощью реакции гемагглютинации (РГА);
   
4. 
   Гибель зародыша в течение первых 24 часов после инфицирования обусловлена размножением бактериальной микрофлоры, грибов или повреждением при заражении.
   

Вопрос № 2.

Культивирование вирусов на культурах клеток.

Культуры клеток:

В зависимости от техники приготовления и культивирования различают три типа культур клеток и тканей:

1. 
   Однослойные культуры клеток растут на поверхности стекла лабораторной посуды в виде монослоя клеток. Подразделяют на:
   

• 
  Первичные, или первично-трипсинизированные (способны размножаться однократно);
  
• 
  Полуперевиваемые или диплоидные (способны размножаться в течение 40-50 пассажей);
  
• 
  Перевиваемые (способны перевиваться в лабораторных условиях в течение неопределенно длительного срока).
  

Этапы получения:

• 
  Измельчение ткани;
  
• 
  Разъединение клеток путем трипсинизации;
  
• 
  Отмывание полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина;
  
• 
  Суспендирование клеток в питательной среде
  

2. 
   Культуры суспензированных клеток растут и размножаются во взвешенном состоянии при постоянном интенсивном перемешивании среды. Для суспензионного выращивания клеток в промышленных масштабах (промышленное производство вакцин и диагностикумов) используют биореакторы объемом от 0,5 до 8 тыс. литров;
   
3. 
   Органные культуры кусочки органов животного и человека, выращиваемые вне организма;
   

Вопрос № 3.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций: основные методы.

В лабораторной диагностике вирусных инфекций имеются три основных метода:

1. 
   Обнаружение вируса или его компонентов (вирусных АГ или НК) непосредственно в исследуемом материале;
   
2. 
   Выделение (изоляция) вируса из исследуемого материала и его идентификация;
   
3. 
   Обнаружение АТ к вирусу (серодиагностика вирусных инфекций). Серологическая диагностика, основанная на установлении значительного прироста вирусных антител в течение болезни;
   

Прямые методы диагностики клинического материала:

Прямые методы – это методы, которые позволяют обнаружить вирус, вирусный антиген или вирусную нуклеиновую кислоту (НК) непосредственно в клиническом материале, то есть являются наиболее быстрыми (2–24 ч). Однако из-за ряда особенностей возбудителей прямые методы имеют свои ограничения (возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов). Поэтому они часто требуют подтверждения непрямыми методами.

1. 
   Электронная микроскопия (ЭМ). С помощью этого метода можно обнаружить собственно вирус. Одним из вариантов ЭМ является иммунная электронная микроскопия (ИЭМ), при которой применяются специфические антитела к вирусам.
   
2. 
   Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Метод основан на использовании антител, связанных с красителем. В практике применяются два варианта РИФ: прямой и непрямой.
   
3. 
   Иммуноферментный анализ (ИФА). Иммуноферментные методы определения вирусных антигенов в принципе сходны с РИФ, но основываются на мечении антител ферментами, а не красителями.
   
4. 
   Радиоиммунный анализ (РИА). Метод основан на метке антител радиоизотопами, что обеспечивало высокую чувствительность в определении вирусного антигена.
   
5. 
   Молекулярные методы. В настоящее время все шире используется выделение геномов вируса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
   

Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот. Метод основан на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК с образованием двунитевых структур и на выявлении их с помощью метки.

Непрямые методы диагностики

1. 
   Вирусологический метод
   

Выделение вируса из исследуемого материала и его идентификация (выделение вируса на культуре клеток, куриных эмбрионах, лаб. животных).

Процесс длительный, иногда требующий проведения нескольких пассажей, прежде чем вирус будет обнаружен и идентифицирован с помощью одного или нескольких методов – в реакции нейтрализации (РН), реакции торможения гемагглютинации (РТГА), РИФ, ИФА или ПЦР.

Серодиагностика

Серологическая диагностика, основанная на реакции антиген – антитело, может быть использована для определения как тех, так и других, и играет роль в определении этиологии вирусной инфекции даже при отрицательных результатах выделения вируса.

Для типирования вирусов применяется:

1. 
   РН;
   
2. 
   Реакция связывания комплемента (РСК);
   
3. 
   Реакция торможения гемагглютинации (РТГА);
   
4. 
   РСК;
   
5. 
   РИФ;
   
6. 
   Реакции пассивной и обратной пассивной гемагглютинации (РПГА, РОПГА);
   
7. 
   Различные варианты ИФА;
   
8. 
   РИА;
   

Вопрос № 4.

Методы обнаружения в патматериале (прямые методы).

Прямые методы:

1. 
   РИФ (реакция иммунофлюоресценции):
   

• 
  Широко применяется для выявления вирусных антигенов в паталогическом материале;
  
• 
  Антитела, меченые флюорохромом, связываются с антигеном, и такой комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе;
  
• 
  Успешное применение РИФ возможно, если в паталогическом материале содержится достаточно большое число инфицированных клеток;
  

2. 
   ИФА (иммуноферментный анализ):
   

• 
  Антитела, меченые ферментами, связываются с антигенами, и такой комплекс обнаруживается при добавлении субстрата;
  
• 
  Возможно обнаружение растворимых антигенов, таким образом могут использоваться различные виды патологического материала;
  
• 
  Возможно количественное определение антигенов;
  

3. 
   РИА (радиоиммунный анализ):
   

• 
  Метод основан на метке антител или антигенов радиоизотопами;
  
• 
  После взаимодействия Аг и Ат отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность с помощью гамма-счетчиков;
  
• 
  Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител;
  

4. 
   Электронная микроскопия:
   

• 
  Выявление вирионов в пробах;
  
• 
  Ответ через 1 час;
  
• 
  Используют для выявления рота-, адено-, гепанда-, парамиксо-, ортомиксовирусов и др.;
  
• 
  Недостатки метода: для успешного определения вируса его концентрация в пробе должна быть не менее 1 млн. вирусных частиц в 1 мл; электронная микроскопия не позволяет типировать вирусы, так как у большинства вирусов нет морфологических различий внутри семейства;
  

5. 
   Иммунная электронная микроскопия:
   

• 
  В основе этого метода лежит взаимодействие антител с вирусами при смешивании вирусосодержащего материала со специфической сывороткой;
  
• 
  В результате взаимодействия антител с вирусами образуются микропреципитаты, состоящие из вирусных частиц, покрытых, своеобразным «венчиком» (антитела связаны с атомами металла);
  

6. 
   Молекулярно-генетические методы (ПЦР):
   

• 
  ПЦР – репликация вирусспецифической последовательности ДНК в 3 этапа;
  
• 
  Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот – выявление комплементарных нитей нуклеиновых кислот с помощью метки (точечная гибридизация, блот-гибридизация, гибридизация in situ);
  

Вопрос № 5.

Выделение вирусов из патматериала. Их индикация и идентификация.

Индикация вируса в патологическом материале:

1. 
   Обнаружение – световая микроскопия крупных вирусов (Poxviridae), электронная микроскопия;
   
2. 
   Обнаружение телец-включений. (тельца Бабе-Шенегри при бешенстве);
   
3. 
   Обнаружение вирусных антигенов: серологические реакции;
   
4. 
   Обнаружение вирусных НК (ДНК-зонды и ПЦР – полимеразно-цепная реакция);
   
5. 
   Обнаружение активной формы вируса путем биопробы (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток);
   
6. 
   Обнаружение гемаглютининов у гемаглютинирующих вирусов (в настоящее время практически не используется по причине наличия более точных методов);
   

Изоляция (выделение) вируса из патологического материала:

1. 
   Проводится не менее трех слепых пассажей, делается биопроба;
   

• 
  Лабораторные животные (клиника, гибель, пат. изменения);
  
• 
  Куриные эмбрионы (гибель, пат. изменения, РГА);
  
• 
  Культура клеток (ЦПД, РГАд, метод бляшек);
  

Идентификация выделенного вируса – серологические реакции:

1. 
   ЦПД (цитопатическое действие вирусов) - деструктивные изменения отдельных клеток и клеточного монослоя, возникающие в результате продуктивной вирусной инфекции клеток и цитотоксического действия вирионов. В клеточном монослое ЦПД проявляется в форме сплошной или очаговой круглой, или полиморфноклеточной дегенерации, образовании многоядерных клеток или клеточных симпластов, а также в пролиферативном разрастании клеток;
   
2. 
   Метод бляшек - «Бляшки» («негативные» колонии) — участки разрушенных вирусами клеток, культивируемых на питательной среде под агаровым покрытием, видимые как светлые пятнана фоне окрашенных живых клеток. Один вирион образует потомство в виде одной «бляшки». «Негативные» колонии разных вирусов отличаются по размеру, форме, поэтому метод «бляшек» используют для дифференциации вирусов, а также для определения их концентрации;
   
3. 
   Реакция гемагглютинации (РГА):
   

• 
  РГА используется только для индикации вирусов, содержащих гемагглютинины;
  
• 
  Компоненты: жидкая питательная среда, в которой культивировали культуру клеток, взвесь эритроцитов, отсутствие гемагглютинации – пуговка;
  

4. 
   Гемагглютинация – зонтик;
   

Вопрос № 6.

Серодиагностика вирусных инфекций (обнаружение антител к вирусу).

Серодиагностика - это метод установления диагноза болезни, основанный на способности антител сыворотки крови специфически реагировать с соответствующими антигенами.

То есть основан на обнаружении в крови антигенов возбудителя или антител, которые образовались в организме в ответ на присутствие и размножение болезнетворных микроорганизмов.

Основные серологические реакции

1. 
   Реакция агглютинации – РА, при которой происходит связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов), она протекает при наличии электролитов. РА используют для определения антител в сыворотке крови больного.
   
2. 
   Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использовании эритроцитов с адсорбированными на их поверхности АГ или АТ, взаимодействие которых с соответствующими АТ или АГ сыворотки крови больных вызывает склеивание и при положительных результатах происходит выпадение эритроцитов на дно полистироловой пластины в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают на дно пластины в виде «пуговки».
   
3. 
   Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты.
   
4. 
   Реакция преципитации (РП) – это осаждение растворимого антигена при действии антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен преципитации) – помутнение (образование мутного кольца или осадка – преципитата). РП применяют для обнаружения неизвестного антигена.
   
5. 
   Реакция связывания комплемента (РСК). Для постановки реакции связывания комплемента необходимы:
   

• 
  Испытуемая сыворотка (АТ);
  
• 
  Антиген – убитая взвесь возбудителей того или иного заболевания;
  
• 
  Комплемент;
  
• 
  Гемолитическая сыворотка;
  
• 
  Эритроциты барана.
  

РСК заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому присоединяется комплемент, т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент остается свободным.

1. 
   Реакция нейтрализации (РН) - это универсальная реакция, которая служит эталоном при оценке других серологических реакций. Принцип ее состоит в том, что при взаимодействии антигена (вируса) с гомологичными антителами образуется комплекс антиген + антитело, в результате нейтрализуется инфекционность вируса.
   

При отсутствии у животных повреждающего действия микроорганизмов, их токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса АГ-АТ.

1. 
   Реакция иммунофлюоресценции РИФ (метод Кунса) - метод основан на специфическом связывании АТ с АГ, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результате реакции с соответствующим хромогенным субстратам образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически.
   

Недостатки серологического метода

1. 
   Долгий период ожидания, когда анализ проводится в парных сыворотках;
   
2. 
   Слабый гуморальный ответ при некоторых инфекциях;
   
3. 
   За счёт наличия перекрестных антигенов у близкородственных вирусов можно получить ложноположительные результаты;
   
4. 
   У людей и животных с иммунодефицитным состоянием гуморальный иммунный ответ может быть снижен или вовсе отсутствовать;
   

Вопрос № 7.

Особенности противовирусного иммунитета.

На вирус развиваются иммунологические реакции 2-х типов:

1. 
   Направленные против вириона – преимущественно гуморальные реакции;
   
2. 
   Действующие на клетку, инфицированную вирусом – преимущественно клеточные реакции;
   
3. 
   Антитела (действие на внеклеточный вирус, препятствие адсорбции вируса на клетку-мишень; связывают вирусные белки и нуклеиновые кислоты – комплексы фагоцитируются);
   
4. 
   Т-киллеры (цитотоксическая активность Т-киллеров, распознавание и уничтожение пораженной вирусом клетки);
   
5. 
   Естественные киллеры;
   
6. 
   Интерфероны (связывается с рецептором на клетке и подавляет биосинтетические процессы);
   

Вопрос № 8.

Факторы врожденного иммунитета.

К факторам врожденного иммунитета относят:

1. 
   Кожу и слизистые оболочки;
   
2. 
   Клеточные факторы: нейтрофилы, макрофаги, дендритные клетки, эозинофилы, базофилы, естественные киллеры;
   
3. 
   Гуморальные факторы: система комплемента, растворимые рецепторы к поверхностным структурам микроорганизмов (pattern-структуры), антимикробные пептиды, интерфероны
   

Вопрос № 9.

Факторы приобретенного иммунитета.

Факторы адаптивного иммунитета:

1. 
   Клеточные (цитотоксические Т-клетки CD8+, CD4+);
   
2. 
   Гуморальные факторы (противовирусные антитела);
   

Адаптивный противовирусный иммунитет осуществляется с помощью гуморального и клеточного механизмов и направлен на нейтрализацию, освобождение организма от вируса, его антигенов, и уничтожение заражённых вирусом клеток.

Гуморальные факторы адаптивного иммунитета:

1. 
   При образовании комплекса антиген (вирион)-антитело происходит нейтрализация вируса, таким образом блокируется начальный этап взаимодействия вируса с клеткой;
   
2. 
   Антитела участвуют в разрешении инфицированных вирусом клеток, активируя систему комплемента;
   
3. 
   Антитела, связанные с вирусными антигенами на поверхности заражённых клеток обеспечивают антителозависимую цитотоксичность, опосредованную НК, макрофагами и нейтрофилами;
   

• 
  Секреторный IgA - Блокирование связывания вируса с клеткой хозяина (предохраняют от инфицирования и реинфекции);
  
• 
  IgM, IgG - Блокирование проникновения вируса внутрь клетки-хозяина (антитела, агглютинируя вирусные частицы, вызывают конформационные изменения поверхностных белков вириона, препятствуют их взаимодействию с рецепторами клеток и блокируют проникновение вирионов в клетку);
  
• 
  IgM, IgG - Усиление фагоцитоза вирусных частиц (опсонизация вирусных частиц). Активация комплемента и лизис заражённых клеток.
  

Особенности гуморального ответа

1. 
   Недостаточная концентрация антител может усиливать репродукцию вируса (не часто)
   
2. 
   Иногда антитела могут защищать вирус от действия протеолитических ферментов клетки, способствуя сохранению жизнеспособности вируса
   
3. 
   Негативная роль антител при вирусной инфекции обусловлена их участием в иммунозависимом повреждении клеток и тканей, образовании иммунных комплексов, избыточной активации системы комплемента, сохранении инфекционности опсонированных вирионов в фагоцитах.
   

Противовирусный Т-клеточный иммунитет

1. 
   Основной формой защиты организма от вирусных инфекций является клеточный иммунитет
   
2. 
   Основными эффекторами клеточного противовирусного иммунитета являются Т-цитотоксические лимфоциты (CD8+ клетки)
   
3. 
   Для цитотоксического действия Т-лимфоцитам необходим непосредственный контакт с клеткой-мишенью, в результате которого происходит изменение мембранной проницаемости клетки-мишени