20.7. Микробиологическая диагностика вби
Микробиологические методы имеют решающее значение в постановке этиологического диагноза оппортунистических инфекций, в выработке рациональной схемы терапии и в предупреждении развития вторичных случаев заболевания.
Микробиологические исследования при заболеваниях, вызванных УПМ, направлены на выделение не одного, а нескольких основных микробов, находящихся в исследуемом материале, а не на индикацию одного специфического патогена, как это принято при заболеваниях, вызванных патогенными микробами.
Основным методом микробиологической диагностики оппортунистических инфекций является кулыпуральный метод, заключающийся в посеве на искусственные питательные среды материала от больного для выделения и идентификации чистых культур возбудителей.
При использовании этого метода следует учитывать:
в материале от больного, как правило, присутствует ассоциация микробов, в которую входят как возбудители заболевания, так и заносные из других органов и внешней среды виды, а также микробы, которые могут попасть в материал при его заборе и доставке;
количественный и видовой состав микрофлоры варьирует у разных больных и меняется в процессе болезни, особенно при использовании антибактериальных препаратов.
Достоверность бактериологического исследования зависит от: правильного забора материала от больного; применения эффективного набора дифференциально-диагностических и селективных питательных сред; использования количественного посева материала; этапности идентификации выделенных чистых культур (семейство, род, вид и, в необходимых случаях, вариант); определения свойств, указывающих на патогенность культур и их принадлежность к госпитальным штаммам.
Обязательным должно быть определение чувствительности культур к антибиотикам и
другим антимикробным химиотерапевтичес-ким препаратам, а также свойств культур, необходимых для эпидемиологического анализа (эпидемиологических меток) — фаговара, се-ровара, резистенсвара и др.
С целью определения смены возбудителей и изменения их свойств исследования материала следует проводить через каждые 5-7 дней.
Микроскопический метод позволяет выявлять в мазках патологического материала бактерии только в случае их массивного содержания (105и более КОЕ/мл) и из-за близости морфологии бактерий дает возможность только ориентировочно судить о возбудителе, относя его к крупным таксонам (палочки, кокки, спирохеты, грамположительные или грамотрицательные и т. п.). Результаты микроскопии могут быть использованы при выборе питательных сред для дальнейшего выделения возбудителя. В редких случаях микроскопически удается определить род или даже вид возбудителя, если он имеет характерную морфологию (клостридии, фузобактерии). В идентификации грибов и простейших возможности микроскопического метода несколько шире. Введение в практику иммунофлюоресцентного метода расширяет возможности микроскопического метода, но и в этом случае он не может заменить бактериологический метод, поскольку не позволяет определить чувствительность возбудителя к химиотерапевтическим препаратам и ряд других, необходимых для практики свойств.
Серологический метод имеет вспомогательное значение. С помощью его не удается установить спектр и уровень активности антимикробных препаратов по отношению к возбудителю болезни и провести внутривидовое типирование. Возможности серологического метода ограничивает выраженная мозаичность антигенной структуры многих УПМ, наличие к ним антител у здоровых людей и слабая выраженность иммунного ответа на антигены УПМ. Тем не менее при затяжных и хронических формах болезни серологический метод иногда позволяет установить этиологию болезни. Серологические реакции ставятся с парными сыворотками крови больного и аутокулыу-рой; результат оценивается по сероконверсии в 4 раза и более. Перспективны серологические методы количественного выявления видовых и
типовых антигенов возбудителя в очаге поражения, а также в биологических жидкостях — крови, слюне, моче. Однако техника постановки таких реакций и критерии этиологического диагноза пока не отработаны. На сегодняшний день слабо разработаны диагностические препараты, основанные на иммунных реакциях (иммуноферментный анализ, иммунофлюо-ресцентные диагностикумы, моноклональные антитела) к микробам-оппортунистам.
Биологический метод обычно не используется из-за неспецифичности клинической картины, вызываемой УПМ у лабораторных животных, и содержания в патологическом материале микробных ассоциаций, которые при заражении животных претерпевают изменения.
Аллергологический метод, в связи с отсутствием сенсибилизации или ее малой специфичностью, не используется.
20.7.1. Правила забора, хранения и транспортировки материала
Результаты микробиологической диагностики зависят от правильного выбора материла и соблюдения условий его забора, доставки, хранения и обработки.
Вид материала определяется клинической картиной заболевания, т. е. он должен соответствовать локализации предполагаемого возбудителя с учетом патогенеза болезни. Например, при бронхолегочных заболеваниях для исследования берут мокроту, при заболеваниях мочевыделительной системы — мочу, в случае отсутствия или неясности локальных очагов — кровь.
Количество материала должно быть достаточным для проведения исследования и его повторения в случае необходимости. Например, при исследовании крови берут 5—10 мл крови.
Материал берут, по возможности, в начальном периоде болезни, так как именно в этот период возбудители выделяются чаще, их больше, они имеют более типичную локализацию. Ранний этиологический диагноз предполагает более раннее и, следовательно, более эффективное лечение и профилактику новых случаев болезни.
Забор материала должен осуществляться до начала антибактериальной терапии или через
определенный промежуток времени после ее назначения, необходимый для выведения препарата из организма (большинство антибиотиков практически через 8— 10 ч после введения уже выводится из организма). Если антибактериальная химиотерапия начата, то ее при необходимости и без ущерба для больного надо прервать на 1—2 дня, а потом производить забор материала. Так же поступают при повторных исследованиях.
Материал необходимо брать непосредственно из очага инфекции или исследовать соответствующее отделяемое (гной из фистулы, мочу, желчь и пр.).
Забор материала проводить во время наибольшего содержания в нем возбудителей болезни: например, кровь для выделения ге-мокультуры в начале озноба, при повышении температуры и т. п.
Необходимо предупредить возможную контаминацию материала нормальной микрофлорой больного и микробами окружающей среды. Для этого забор материала должен проводиться в асептических условиях, в процедурном кабинете, в перевязочной или малой операционной стерильным инструментарием в стерильную посуду. Пути, через которые выделяется или берется материал, должны быть максимально освобождены от нормальной микрофлоры. Для избежания контаминации материала нормофлорой при взятии материала на исследование из полостей тела и полых органов адекватный для забора материала доступ к этим органам осуществляется путем пункции их через кожные покровы.
Следует предупредить возможность попадания в материал антимикробных препаратов (дезинфектантов, асептиков, антибиотиков), исключить контакт с металлами, обладающими олигодинамическим действием, с ватой, содержащей свободные жирные кислоты.
Любой клинический материал должен рассматриваться как потенциально опасный для человека. Поэтому при его заборе, хранении, доставке, обработке во избежание заражения должны соблюдаться такие же меры техники безопасности, как в бактериологической лаборатории.
10. Транспортировку клинического образца в лабораторию следует производить в макси мально короткие сроки.
При длительном хранении материала происходит гибель наиболее требовательных к питательным веществам видов микробов, начинают размножаться менее требовательные и быстрорастущие виды, что приводит к нарушению количественного соотношения видов и дезориентирует врача-микробиолога при интерпретации полученных результатов. Если материал нельзя немедленно отправить в лабораторию, хранить его следует в холодильнике или использовать специальные транспортные среды. Клинические образцы для культивирования облигатных анаэробов следует транспортировать в лабораторию, максимально защищая их от воздействия кислорода воздуха.
К клиническому образцу, направляемому в лабораторию, прилагают сопроводительный документ, содержащий основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования (характер материала, Ф.И.О. больного, название учреждения или отделения, номер истории болезни, предположительный диагноз заболевания, предшествующая антимикробная терапия, дата и время взятия материала, подпись врача, направляющего материал на исследование).
В процессе транспортировки материал следует оберегать от действия света, тепла, холода, механических повреждений. Лучше всего материал доставлять в специальных металлических контейнерах, которые удобно очищать и обеззараживать. Нельзя отправлять материал в лабораторию с больными или случайными людьми.
После исследования остатки материала подлежат уничтожению (автоклавированию или сжиганию), а посуда, контейнеры, инструменты — обеззараживанию.
20.7.2. Обобщенная (типовая) схема выделения возбудителей оппортунистических инфекций 1-й день
Забор и доставка материала в лабораторию (см. разд. 20.7.1 «Правила забора, хранения и транспортировки материала»).
Обработка материала с целью его гомогенезации и концентрации (в необходимых случаях).
Приготовление и окраска мазка по Граму. В необходимых случаях, например при подозрении на присутствие в материале простейших, грибов, хлами-дий, микобактерий и т. п., дополнительно применяют специальные методы окраски.
Приготовление разведений патологического материала от 10 1 до 106 в теплом растворе хлорида натрия 0,5% с 0,01% желатина (для предупреждения осмотического шока бактерий)
Высев 0,1 мл материала из разведений на чашки Петри с питательной средой газоном (на три чашки из каждого разведения). В стандартный набор питательных сред желательно включить желточно-солевой агар (для стафилококков), среду Эндо или эозинметиловый агар (для энтеробактерий), кровяной агар (для стрептококков и ряда других требовательных к питательным средам видов), среду Сабуро (для грибов), среду для контроля стерильности или другие среды для анаэробов. В случаях, когда имеются указания на вероятный возбудитель (клиническая симптоматика, вид патологического материала, результаты микроскопии), должны быть использованы более селективные среды.
2-й день
Определение характера роста на питательных средах.
Подсчет количества колоний каждого типа на чашках с посевом разведений патологического материала и расчет бактериальной обсемененности материала по формуле
X КОЕ = N х ПД х СР,
где N — число колоний; ПД — посевная доза; СР — степень разведения. Микроскопия мазков по Граму из всех выросших типов колоний.
Отсев на среду накопления с колоний различных типов. Для повышения достоверности исследования желательно отсевать 2—3 колонии одного типа. Эта мера вызвана гетерогенностью популяции: она удорожает исследование, но зато резко повышает его достоверность.
Ускоренная идентификация (при наличии методов и возможностей).
3-й день
Установление «чистоты» культуры на средах накопления путем просмотра характера роста под бинокулярной лупой и микроскопией мазка.
Идентификация чистых культур. Тесты идентификации зависят от предполагаемого вида или рода выделенной культуры. Она проводится с помощью общепринятых методик или автоматизированных систем.
Определение чувствительности выделенных культур к антибиотикам и, в необходимых случаях, к антисептикам.
4—5-й день
1.Учет результатов тестов, использованных для идентификации.
Оформление заключения (семейство, род, вид выделенных культур; обсемененность материала КОЕ/мл или КОЕ/г; антибиотикограмма; этиологическая значимость выделенных культур и состав их популяций).
По клиническим и эпидемиологическим показателям определяют факторы патогенности и эпидемиологические маркеры (фаго-, серо-, резистенс-, бактерио-циновары и др.) у этиологически значимых культур.
20.7.3. Критерии этиологической значимости выделенной чистой культуры
Для установления этиологической роли патогенных микробов достаточно выделения микроба из материала от больного (независимо от количества), обнаружения в сыворотке крови специфических антител в диагностическом титре или сероконверсии в ходе болезни в 4 раза и более, наличия корреляции между выделенным микробом и клинической картиной болезни. Вспомогательное значение имеют результаты биопробы и аллерголо-гического метода диагностики.
Критерии этиологической роли УПМ более сложны и менее надежны. К ним относятся:
Выделение возбудителя из исследуемого материала. Этот критерий имеет решающее значение при выделении микроба из крови и спинномозговой жидкости. При остальных нозологических формах он самостоятельного значения не имеет, если даже выделена монокультура. Отрицательный результат исследования не является основанием для отрицания инфекционной природы болезни, так как он может быть обусловлен методическими причинами. В этом случае инфекционная природа болезни устанавливается на основании клинических данных с повторным микробиологическим исследованием.
Численность популяции обнаруженного микроба в пораженном органе, так называемое критическое число, которое рассчитывают на 1 мл исследуемого материала. Обычно за такое «критическое число» для бактерий принимают дозу 105 КОЕ/мл, для грибов и простейших она меньше — 103—104. Этому критерию придают решающее значение. Следует иметь в виду, что
инфицирующая доза является производной от степени патогенности микроба и уровня восприимчивости организма. Она может быть и значительно меньше, и значительно больше этой величины, так как численность популяции возбудителя в процессе болезни меняется: при переходе в хроническую форму, в период выздоровления и ремиссии, в процессе химиотерапии, в присутствии конкурента она существенно снижается. В случае выделения из патологического материала нескольких видов или вариантов микробов в оценке этиологической роли важное значение имеет установление количественных соотношений ассоци-антов: за ведущего возбудителя в этом случае принимают доминирующую популяцию.
В сомнительных случаях, например, при подозрении на микробную контаминацию исследуемого материала, внести ясность может повторное, в течение 12—24 ч, исследование этого же материала: выделение того же вида и варианта и в этот раз подтверждает вывод о его этиологической роли.
Принадлежность выделенной культуры к больничному штамму или эковару.
Обнаружение у выделенной культуры факторов патогенности. Ценность этого критерия повышается при выявлении нескольких факторов патогенности и, особенно, в достаточно высокой дозе или активности. К сожалению, методы выявления факторов патогенности и оценки их активности отсутствуют или сложны и долговременны, что снижает возможность использования этого важного критерия. Кроме того, отсутствие специальных факторов патогенности не является основанием для отрицания этиологической роли выделенной культуры, поскольку патогенное действие может быть обусловлено эндотоксином, который содержится у большинства УПМ.
Сероконверсия в сыворотке больного к аутокультуре в 4 раза и более.
Выявление прямой корреляции между чувствительностью культуры к антимикробным химиотерапевтическим препаратам и эффективностью терапии.
Выделение идентичных культур от группы больных в случае вспышки заболевания.
Наличие прямой корреляции между клиническим улучшением и уменьшением мас-
сивности или полной элиминацией микробной популяции.
Основное значение в установлении этиологии заболевания имеют первые два критерия, остальные — только дополнительное; их наличие указывает на этиологическую роль культуры, отсутствие — не позволяет исключить ее роль в возникновении болезни. |
Скачать 25.9 Kb.