Лр4_ПЦР писать. Лабораторная работа 4 Полимеразная цепная реакция (пцр)

• Название: Лабораторная работа 4 Полимеразная цепная реакция (пцр)
• Дата: 22.11.2020
• Размер: 46.81 Kb.
• Имя файла: Лр4_ПЦР писать.docx
• Тип: Лабораторная работа; #152730

Лабораторная работа № 4

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР, полимеразная цепная реакция – это ферментативное копирование определенного фрагмента ДНК in vitro c помощью ДНК-полимеразы, т.е. селективная амплификация ДНК. Границы фрагмента задают нуклеотидными последовательностями праймеров, поэтому копированию подвергается только определённый ген (ДНК-мишень), а не вся ДНК как при репликации in vivo. Основоположником метода считается Кэрри Муллис (Mullis, 1985).

ПЦР включает три циклически повторяющиеся стадии (рис.1):

1) денатурацию ДНК – расплетение двойной спирали и расхождение полинуклеотидных цепей;

2) отжиг праймеров – гибридизацию праймеров и одноцепочечной ДНК-мишени с образованием двухцепочечных комплексов «праймер-матрица», необходимых для инициации синтеза ДНК из мономеров – дезоксирибонуклеозидтрифосфатов;

3) полимеризацию – достраивание (удлинение, элонгацию) комплементарных цепей ДНК ферментом ДНК-полимеразой в направлении 5’→3’ начиная от 3’-OH концов присоединённых праймеров. Т.е. матричный синтез ДНК (нем. matrize, от латинского matrix – матка, источник, начало).

Р ис. 1. Общая схема ПЦР

Температура отжига праймера – температура, при которой возможно связывание праймерного олигонуклеотида с одноцепочечной ДНК-матрицей при охлаждении реакционной смеси, следующем за стадией денатурации. Для каждого конкретного праймера она рассчитывается отдельно и лежит в пределах 50-65°С. Это вариабельная температура.

Температура элонгации зависит от типа используемого фермента. Для ферментативной активности ДНК-полимеразы Taq из термофильной бактерии Thermus aquaticus температурный оптимум составляет 72°С. Коммерческие фирмы продают наборы реагентов для проведения ПЦР, где все компоненты реакции, за исключением праймеров и матрицы, уже смешаны в нужных концентрациях и расфасованы в тонкостенные пробирки. В том числе добавлен и фермент, индуцируемый нагревом и потому неактивный. Задача исследователя состоит в том, чтобы добавить в пробирку ДНК-матрицу и специфичные праймеры в нужном количестве, поставить пробирки в амплификатор и задать нужный режим.
Работа 4.1. Подбор праймеров

Праймеры – синтетические олигонуклеотиды, состоящие из 16-30 оснований. Они комплементарны участкам ДНК, между которыми находится последовательность-мишень.

Праймер (англ. primer) является обязательным компонентом («затравка»), необходимым для работы ДНК-полимеразы: к его 3’-ОН концу фермент присоединяет нуклеотиды, комплементарные матрице.

Праймер к 5’-концу гена называют прямым (forward, For), к 3’-концу гена – обратным или встречным (reverse, Rev). В базах данных нуклеотидных последовательностей приведена только одна цепь ДНК – значащая, та, что транскрибируется в виде мРНК. По ней подбирают прямой праймер, т.е. тот праймер, от которого будет расти именно эта цепь. Обратный праймер подбирают для комплементарной цепи, но также в направлении 5’→3’.

В приведённой ниже работе требуется «вручную», без использования специальных программ подобрать праймеры для амплификации гена НАДН-дегидрогеназы гадюки Никольского (Vipera nikolskii) и составить режим ПЦР.

Ход работы

1. Найдите информацию о первичной структуре гена НАДН-дегидрогеназы гадюки обыкновенной, по которой можно подобрать праймеры для ПЦР-амплификации этого гена у других видов гадюк. Для этого откройте сайт US National Library of Medicine, базу GenBank (http://www.pubmed.com).

2. Введите латинское название организма и интересующий ген (Vipera berus NADH dehydrogenase).

3. Выберите вкладку «Nucleotide» и нажмите «Enter».

4. Скопируйте информацию в файл. Один из сиквенсов (англ. sequence – последовательность) для примера приведён на рис. 2.

5. Подберите праймеры для ПЦР, прямой и обратный. Для прямого праймера достаточно выбрать короткий отрезок гена вблизи его 5’-конца с оптимальной длиной около 20 нуклеотидов. Для подбора обратного праймера нужно восстанавливать комплементарную цепь ДНК. Любую нуклеотидную последовательность записывают в направлении 5’→3’ ^a.

6. Расчитайте температуру отжига ваших праймеров и составьте режим ПЦР.

Правила подбора праймеров

- Размер праймера должен составлять 16–25(30) нуклеотидов.

- СG-состав должен лежать в пределах 50–60 %.

- Разница в температуре отжига обоих праймеров – не более 6° С.

- Праймеры не должны быть само- и взаимно- комплементарными.

- Нуклеотиды 3’-конца праймера должны быть строго комплементарны матрице (замены возможны на 5’-конце длинных праймеров ^б).

Расчёт температуры отжига праймера

Для точного расчёта оптимальной температуры существует множество программ и алгоритмов. Упрощенный расчёт можно провести по формулам:

Tа = [(A+T) 2°C]+[(G+C) 4°C] (если длина ≤ 20 оснований)

Tа = 22+1,46 ([2 (G+C)]+(A+T)] (если длина составляет 20–30 оснований)

Работа 4.2. Проведение ПЦР-амплификации ДНК

ПЦР проводится в объёме 10-50 мкл. Рабочая концентрация праймеров в реакционной смеси составляет 0,2-1 пМ/мкл. Количество матричной ДНК, добавляемой в реакцию, колеблется в пределах от 10 нг (плазмидная ДНК) до 1000 нг (геномная ДНК). Рабочая концентрация Taq-полимеразы составляет 0,01-0,05 ед/мкл. Число циклов – 30. Считается, что скорость достраивания ДНК Taq-полимеразой при ПЦР составляет 1000 нуклеотидов в минуту.

Оптимальная концентрация праймеров часто подбирается эмпирически. Не рекомендуется брать больше чем 50пМ на пробу, иначе возможен неспецифический отжиг и образование праймер-димеров.

Обычно задают следующий режим работы ДНК-амплификатора:

1. Td = 95°C, от 1 мин – предварительная денатурация матрицы, один этап

2. 25-30 циклов ПЦР:

Td = 95°C, от 10 с – денатурация (denaturation)

Ta = 50-65°C, от 30 с – отжиг праймеров (annealing)

Te = 72°C, от 1 мин – элонгация, полимеризация (elongation, extension)

3. T = 72°C, от 1 мин – достройка незавершенных цепей, один этап

4. T = 4°C – режим хранения

В качестве примера приведён протокол ПЦР-амплификации митохондриального гена НАДН-дегидрогеназы гадюки Никольского (Великов с соавт., Вестник Саратовского госагроуниверситета, 2006, №3).

Материалы и оборудование

ПЦР-амплификатор, ДНК (общая) гадюки Никольского Vipera nikolskii (40 нг/мкл), праймеры (10 пМ/мкл), смесь нуклеотидов dNTP-mix (2мМ), раствор хлорида магния (25мМ), Taq-полимераза (5 ед/мкл), 10x ПЦР-буфер.

Растворы

- Реакционная смесь. Подготовка смеси в конечном объёме 20 мкл:

1. 10 ПЦР-буфер (200мМ Tris–HCl, pH 8,4; 500мМ КCl; 0,01% Тween 20) – 2 мкл;

2. 2мМ dNTP mix (смесь из всех 4-х дезоксирибонуклеозидтрифосфатов c концентрацией по 2 мМ каждого) – 2 мкл;

3. 25мМ раствор MgCl₂ – 2 мкл;

4. Праймер ND2 For: 5’–GCATTTTCATGACCACCACC–3’ – 2 мкл;

5. Праймер ND2 Rev: 5’–GAGTGAGGGGTAAGATAGTG–3’ – 2 мкл;

6. ДНК-мишень: общая ДНК гадюки Никольского (40 нг/мкл) – 3 мкл;

7. Вода деионизованная – 6,8 мкл;

8. Taq-полимераза – 0,2 мкл.

Методика

1. В стерильной пластиковой тонкостенной пробирке на 0,5 (0,2) мл смешать указанные выше компоненты, довести объём при помощи деионизованной воды до 20 мкл. Фермент добавлять последним, сразу убрать на –20 С!

2. Центрифугировать 15 с. Нанести поверх реакционной смеси немного минерального масла для предотвращения испарения ( ≈ 30 мкл пипеткой или каплей). Если ДНК-амплификатор имеет нагреваемую крышку, то масло добавлять не нужно. Поместить пробирки в ДНК-амплификатор.

3. Запустить следующий режим ПЦР: предварительная денатурация матрицы при 95°С – 5 мин, затем 30 циклов амплификации: 95°С – 30 с, 57°С – 30 с, 72°С – 1 мин, затем задать температуру 72°С – 5 мин (окончательная достройка цепей) и вывести на +4°С – режим хранения. Расчётная температура отжига обоих праймеров соcтавляет 60°С, реальная задана на 3°С ниже для гарантии отжига и последующего «удлинения праймера».

4. Провести электрофорез ДНК, сфотографировать гель (размер ампликона 911 п.н.). При Real-Time PCR форез не проводят, за процессом следят по флуоресценции.