биотехнология. бт 5. Лекция 2 совершенствование биообъектовпродуцентов методами мутагенеза и селекции, генной и клеточной инженерии в биотехнологии используют следующие методы усовершенствования продуцента
 Скачать 1.34 Mb.
|
|
1 ЛЕКЦИЯ 2 СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИООБЪЕКТОВ-ПРОДУЦЕНТОВ МЕТОДАМИ МУТАГЕНЕЗА И СЕЛЕКЦИИ, ГЕННОЙ И КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ В биотехнологии используют следующие методы усовершенствования продуцента: 1) Селекция и мутагенез; 2) Клеточная инженерия; 3) Генная инженерия. Селекция – целенаправленный отбор организмов со скачкообразным изменением полезных свойств. Процесс селекции биообъектов, которые обладают нужными нам свойствами, значительно ускоряется при использовании метода индуцированного мутагенеза. Индуцированный мутагенез – это резкое увеличение частоты мутаций биообъекта при искусственном повреждении генома (для этого используют мутагены). Чистая генная инженерия – это техника обмена изолированными фрагментами ДНК in vitro с последующим введением изолированной ДНК в живую клетку. Клеточная инженерия – это техника обмена фрагментами ДНК, участками хромосом у прокариот и любыми хромосомами у эукариот, независимо от удаленности организмов в эволюционном плане. В клеточной инженерии осуществляют обмен генетическим материалом между организмами, которые в обычных условиях не скрещиваются между собой. Это открывает большие возможности в создании новых биообъектов. В случае с клеточной инженерией исследователь оперирует целыми клетками, а генной инженерии – с ДНК. 2 Техника клеточной инженерии Техника клеточной инженерии основана на технике протопластирования. Протопласт – это клетка, лишенная клеточной стенки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Протопласт клеток листа петуньи Способы получения протопласта: • механический (впервые протопласт выделил в 1892 г Клеркер) – При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. 3 Плазмолиз – отделение протопласта от клеточной стенки в гипертоническом растворе. Пример – тонкая полоска ткани растения выдерживается сначала в 0,1 М растворе сахарозы до тех пор, пока протопласт не «сожмется» и не отойдет от клеточных стенок, затем бритвой делается разрез полоски, и протопласты высвобождаются в среду. Этот метод трудоемкий, длительный и имеет невысокую производительность. • энзиматический(ферментативный) – в 1952г Саптон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 г Коккинг обработал кончики корней томата ферментом – гидролазой из культуральной жидкости плесневых грибов и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом. Метод быстрый, клетки не повреждаются, и одновременно выделяется большое количество протопластов. Для получения протопласта используют ферменты класса гидролаз, которые гидролизируют полимеры клеточной стенки (целлюлозы, гемицеллюлозы, пектина). Это ферменты трех типов: • целлюлазы, • гемицеллюлазы • пектиназы. Отсутствие клеточной стенки у протопластов обусловливает их свойства, отличные от целых клеток. Протопласты способны поглощать макромолекулы и органеллы, благодаря этому их используют в клеточной инженерии. Под воздействием электрического поля или с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГа) протопласты могут сливаться друг с другом с образование двух видов новых клеток: Гомокарионы (гомокариоциды), состоящие из клеток одного родителя. 4 Гетерокарионы (гетерокариоциды), состоящие из клеток обоих родителей. Для получения протопластов наиболее пригодны клетки находящиеся в логарифмической (экспоненциальной) стадии роста клеточной культуры Техника получения гибридных клеток Задача. Необходимо получить гибридные клетки слиянием прокариотов иэукариотов. Этапы работы: 1. Выбор биообъектов Берут • биообъект, продуцирующий целевой продукт (например, гриб- продуцент антибиотиков) • биообъект, которому хотят придать свойство продуцировать целевой продукт (например, прокариот E. coli). 2. Обработка клеточных стенок ферментами. 3. Стабилизация протопластов (используют гипертонический раствор, состоящий из 10%-ных маннита, сахарозы, хлорида натрия) – клетка находится в состоянии тургора, но не лопается 4. Слияние протопластов – производится в среде поверхностно активних веществ, в присутствии полиэтиленгликоля, который способствует адгезии (слипанию) протопластов. После удаления полиэтиленгликоля и добавления кальция наблюдается слияние протопластов. Для облегчения клетке процесса фузии (слияния) клетку необходимо сделать компетентной. 5 Слияние (фузия) протопластов Компетентная клетка – клетка, способная поглощать и включать в свою хромосому чужеродную ДНК. Компетенция наступает в определенный период жизненного цикла (конец фазы роста). Развитие компетентности может идти по «каскадному» типу: клетки, ставшие компетентными, выделяют в среду низкомолекулярный белок (фактор компетентности), который, адсорбируясь на других клетках, делает их также компетентными. Способы сделать клетку компетентной: 1. воздействовать на клетку ионами тяжелых металлов (цинк, кобальт, литий, магний) 2. воздействовать на клетку ферментами (лизоцим, комплексный фермент виноградной улитки) 3. быстрое замораживание и оттаивание. При слиянии получается протопласт с двумя наборами хромосом – диплоидный набор. В полученном гибриде объединяется генетический материал исходных протопластов. 5. Регенерация (восстановление) клеточной стенки протопласта. Полученный гибрид засевают на плотную питательную среду с необходимыми компонентами для исходных клеток. При этом происходит восстановление клеточной оболочки. 6. Хранение гибридов (новых продуцентов). 6 При протопластировании и слиянии протопластов может происходить амплификация генов – при этом выход целевого продукта увеличивается. Для того, чтобы отличить гибридную клетку от негибридной, необходимо на уровне 4-ой стадии включить еще один протопласт, несущий маркер. Маркер – это участок гена, образующий какой-либо фермент, заявляющий о себе своеобразным путем при высеве на питательную среду. Для прокариот обычно используют ген устойчивости к антибиотикам. Пример: ген, кодирующий β-лактамазу (фермент, катализирующий разрушение бета-лактамных антибиотиков). В среду добавляют бензилпенициллин и вырастают только те клетки, которые содержат β- лактамазу, расщепляющую его. Так как β-лактамазу содержат только клетки гибриды, то на среде вырастают только гибриды. В растениях чаще всего в качестве маркера используют два гена: • глюкуронидазы (из бактерий) – даёт цветную реакцию с синтетическим веществом, при которой генетически модифицированные клетки окрашиваются в тёмно-синий цвет. Но часть клеток при таком окрашивании погибают. • зелёного флуоресцентный белка (выделяют из медузы или светлячков). Он светится при освещении светом с определённой длиной волны, и клетки не погибают. 7 Выделение протопластов из растения 8 Получение протопластов Техники клеточной инженерии 1-ый метод. Метод перегруппировки генов Внутри клетки есть определенный набор и последовательность генов. При протопластировании происходит перегруппировка генов, а также – активация молчащих генов. 2-ой метод. Слияние или фузия клеток Прокариот сливают с эукариотом, образуется рекомбинант, содержащий кусок одного ДНК и другого ДНК. 3-й метод: Трансформация (введение в протопласт вектора). 1. берем клетку с определенным набором генов в ДНК, 2. превращаем ее в живой протопласт 3. трансформация – введение в протопласт вектора Вектор – природная или сконструированная искусственно молекула ДНК, которая содержит селективный маркер и способна автономно реплицироваться в клетке-реципиенте; используется для переноса в клетки чужеродного фрагмента ДНК с целью его клонирования и/или экспрессии. 9 Виды векторов: • плазмида – есть у всех бактерий. Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (F-плазмиды), другие – несут гены устойчивости к антибиотикам.(R- плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию метаболитов (плазмиды деградации). Каждая плазмида содержит сайт начала репликации, без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине невозможна. Репликация плазмид идет независимо от деления клетки. Бактериальная клетка, красным цветом обозначена хромосомная ДНК, зеленым - плазмиды • бактериофаг.При этом рекомбинантный ген встраивается в геном вируса и в последующем реплицируется с генами вируса при размножении в инфицированной клетке-хозяине. С этой целью применяют бактериофаг – вирус с двухцепочечной ДНК, которая после проникновения в клетку смыкается в кольцо. Векторы на основе гена удобны для создания банка генов, но не для тонких манипуляций с фрагментом ДНК. 10 • космида – это искусственно сконструированная ДНК, содержащая фрагменты плазмиды и фага. Это плазмида, несущая cos-участок (комплементарные липкие концы) ДНК фага. Наличие cos-участка позволяет упаковывать ДНК в головку фага in vitro, что обеспечивает возможность их введения в клетку путем инфекции или трансформации. • фазмиды – гибриды между фагама и плазмидами – способны развиваться и как фаг и как плазмида. При трансформации образуются продуценты-гибриды с новыми качествами, но в клетке существуют системы репарации (восстановления) молекулы ДНК и постепенно эти рекомбинанты возвращаются к исходному (дикому) типу. Репарацию преодолевают следующим образом: 1. гибриды дополнительно обрабатывают мутагенами для преодоления действия системы репарации; 2. иммобилизация клеток гибридов Для того, чтобы прошла трансформация, необходимо сделать клетку компетентной, т.е.увеличить ее проницаемость. Компетентные клетки легче поглощают вектор, куски ДНК. У них обнажена цитоплазматическая мембрана, которая в некоторых местах выходит на поверхность, и в образующиеся в этих местах окошечки, легко проникает вектор. Максимальная частота трансформаций: 10 -3 , т.е. на каждую тысячу клеток приходится одна трансформированная. 11 Введение в протопласт вектора – это генная инженерия МЕТОДЫ ВВЕДЕНИЯ «ЧУЖОЙ» ДНК В КЛЕТКИ: Методы переноса генетической информации 1. коньюгация – генетический материал клеток при сближении переходит из одной клетки в другую в виде плазмиды. Вероятность передачи молекулы плазмидной ДНК при коньюгации 1 на 1000 или 1 на 10000. 2. трансдукция – процесс переноса бактериальной ДНК из одной одной клетки в другую бактериофагом. Если есть вектор на основе вируса, то он будет более агрессивен и вероятность повышается в 100 – 1000 раз. От вирусной или фаговой информации трудно освободиться. 3. трансформация – процесс введения ДНК в клетки прокариот невирусным методом. 4. трансфекция – процесс введения ДНК в клетки эукариот невирусным методом. Рассмотрим некоторые методы введения ДНК в клетки невирусными методами: • электропорация – под действием импульсов высокого напряжения в клеточной мембране образуются временные поры, через которые могут проходить экзогенные молекулы ДНК. Это эффективный, удобный, но дорогой метод. 12 • встряхивание смеси клеток, ДНК и микроигл (которые прокалывают мембраны аналогично электрическому току), • микроинъекции ДНК в клетки. Впервые применил Грессман в 1970г. Он ввел в клетку немного жидкости (около 10-8 мкл раствора с ДНК) с помощью стеклянного микрокапилляра. Этот метод называется микроиньекцией, его достоинство – можно ввести ДНК в конкретную часть клетки (например, ядро). Эксперимент проводится на предметном столике микроскопа с применением микроманипуляторов и микрошприцев. 13 • баллистическая трансформация. В 1983-1986 гг разработали генную пушку разрабатывали на основе устройства для автоматического забивания гвоздей. На шарик из вольфрама наносили ДНК и выстреливали им в клетки, растущие в чашке Петри. Шарики разрывают стенки клеток и входят в цитоплазму и ядра клеток и доставляют туда ДНК. Из-за силы бомбардировки ткань по центру чашки, как правило, погибает. Однако по периметру клетки остаются живы и хорошо протрансформированы. Их и культивируют в дальнейшем, чтобы получить трансгенные растения. Этот метод широко применяется в настоящее время. Только вольфрам оказался токсичным для клеток, поэтому вместо него шарики делают из золота или серебра. • слияние с клеткой липосом, нагруженных ДНК. После проникновения в клетку одна из нитей рекомбинантной ДНК деградирует, а другая за счет рекомбинации с гомологичным участком 14 реципиентной ДНК может включиться в хромосому или внехромосомную единицу. Получение рекомбинантной ДНК В генной инженерии происходит получение рекомбинантных ДНК. Первую рекомбинантную ДНК получили в 1972гг, в лаборатории биохимика Берга (США). Берг взял кишечную палочку, поражающий ее бактериофаг λ и полиомавирус SV40, вызывающий опухоли у мышей. Затем с помощью рестриктазы разрезал ДНК этих организмов. В результате на концах фрагментов ДНК он получил «липкие концы» (выступающие концы, которые являются комплементарными, т.е. могут соединяться друг с другом). Под действием ДНК-лигазы липкие концы соединяются друг с другом. Т.е. если поместить в пробирку ДНК разного происхождения и добавить лигазу – получим рекомбинатную ДНК. СТРОЕНИЕ ВЕКТОРА Рекомбинантная ДНК инсерцируется в экспрессионный вектор, который содержит промотор, сайт связывания рибосом и терминатор (сигналы, запускающие транскрипцию и трансляцию). Ген не должен содержать интронов человека, поскольку бактерии не распознают их и это может стать причиной преждевременной терминации, и синтез или сборка белка могут быть нарушены. 15 Вектор должен содержать селектируемый маркер. Селектируемые маркеры используются для устойчивости к антибиотикам, изменения цвета или других характеристик, которые могут отличать трансформируемые клетки-хозяева от нетрансформируемых. Отбор трансформированных клеток проводят в две стадии: 1-я стадия – отбор клеток, несущих соответствующий вектор, проводится по маркерам (например, тестирование на резистентность к определенным антибиотикам) 2-я стадия – поиск клеток, несущих не только вектор, но и ген-мишень: ⃰ определением нуклеотидной последовательности ДНК; ⃰ ДНК-гибридизацией с зондом, комплементарным какому-либо участку искомого гена. Пример: исследуемую ДНК гидролизуют рестриктазами, фракционируют электрофорезом, переносят разделенные фрагменты на нитроцеллюлозный фильтр и проводят реакцию гибридизации с мечеными олигонуклеотидами (блоттинг по Саузерну). 16 https://www.youtube.com/watch?v=wHcaKnAkEag https://www.youtube.com/watch?time_continue=1&v=sjwNtQYLKeU&feat ure=emb_logo ПРОБЛЕМЫ, ВОЗНИКАЮЩИЕ ПРИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАНИПУЛЯЦИЯХ 1) гены при трансформации, попадая в чужеродную среду, подвергаются воздействию разрушающих их ферментов, поэтому их надо защищать; 2) как правило, продукт трансплантированного гена аккумулируются в клетках и не выделяются в окружающую среду. 3) большинство желаемых признаков кодируется не одним, а группой генов. ТРЕБОВАНИЯ К МИКРООРГАНИЗМАМ 1. Метаболизм микроорганизма должен быть хорошо изучен, поэтому в качестве продуцентов используют Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisie. 2. Микроорганизмы должны быть непатогенны. 17 3. Микроорганизмы должны хорошо и интенсивно размножаться в условиях ферментера. 4. Желательно, чтобы микроорганизм был способен выделять секретируемый им чужеродный белок в среду. Это можно достичь, если ввести в клетку реципиента ген, который синтезирует рекомбинантный белок с дополнительной аминокислотной последовательностью, состоящий из гидрофобных аминокислот (они перетаскивают белок в липидную мембрану, в которой с помощью определенных ферментов (сигнальных протеаз), гидрофобная последовательность отщепляется и образуется целевой продукт). 5. Должна быть возможность сделать клетки микроорганизмов компетентными для того, чтобы их клеточная стенка была бы проницаема для плазмид. Техника безопасности при работе с генно-инженерными микроорганизмами 1. Генно-инженерный штамм должен быть ауксотрофом (дефектным, не способным синтезировать какое-то вещество, необходимое ему для жизнедеятельности) (делеция нескольких генов – делаем микроорганизм капризным по какой-то аминокислоте и т.д.). 2. Физические предупреждения, когда в процессе ферментации создается отрицательное давление в ферментере и в случае выброса выходят только небольшие количества микроорганизмов). Системы выброса оснащаются фильтрами, задерживающими микробные клетки. После завершения процесса производится стерилизация оборудования, но не должно быть разъедания материалов (коррозия), из которых изготовлено оборудование. |