Лекция. Лекция 6. Микроорганизмы и плазмидные векторы для молекулярного Микроорганизмы, используемые в генетической инженерии
 Скачать 27.17 Kb.
|
|
Ушакова Е.А. гр. 11002243 Лекция №6. Микроорганизмы и плазмидные векторы для молекулярного 1. Микроорганизмы, используемые в генетической инженерии. 1. Кишечная палочка (Escherichia coli) и другие бактерии. E. coli — грамотрицательная палочковидная γ-протеобактерия, исторически первый объект для тестирования почти всех типов векторов, большая часть которых была получена на основе плазмид и фагов этих же бактерий. Генные инженеры очень любят эту бактерию, потому что: она быстро наращивает клеточную массу; не нуждается в дорогих сложных средах и оборудовании; она чувствительна к большинству стандартных антибиотиков, что облегчает подбор селективных маркеров для клонирования; Но E. coli всё же не идеальна: она не обладает природной компетентностью, то есть для того чтобы она заглотила ДНК извне, нужно потрудиться; у нее совсем нет времени на обычные для любого эукариота операции с интронами и концами матричной РНК; она не умеет самостоятельно модифицировать, а иногда и сворачивать синтезированные белки так, как это нужно при экспрессии эукариотических генов: строить дисульфидные мостики, гликозилировать и т.п.; 2. Пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) и их родственники. Всевозможные дрожжи хоть и микроскопические, но относятся к эукариотам — со всеми вытекающими: ядром, мембранными органеллами, особыми рибосомами, регуляцией экспрессии генов и путями транспорта белков. Правда, как и у прокариот, у пекарских дрожжей есть плазмиды — двухмикронные эгоисты, праздно сидящие в ядре и приносящие пользу разве что генным инженерам. Очевидно, что экспрессировать эукариотические гены S. cerevisiae и другие дрожжи умеют отлично. Но не любые гены. Потому что дрожжи одноклеточные, приспособленные эволюцией к быстрому размножению в меняющихся условиях среды, а значит, с неохотой совершающие «лишние» действия типа вырезания интронов и изобретательных модификаций белка. Да, они это делают, но не совсем так, как высшие эукариоты. В частности, они гликозилируют белки в тех же местах, но слишком скромно или, наоборот, «пышно» и аллергенно по сравнению с млекопитающими. Эту проблему иногда удается решить генетическим тюнингом, а именно — гуманизацией некоторых генов дрожжей. Но главная особенность дрожжей — это потрясающая способность к гомологичной рекомбинации. Благодаря ей гены сахаромицетов можно легко заменять чужими и изучать их функции, если эти гены вводить в клетку в тесном соседстве с участком ДНК, (почти) идентичным какому-то участку дрожжевой хромосомы. S. cerevisiae со своими полностью секвенированными 16 хромосомами, безусловно, хорошие хозяева для рекомбинантных ДНК, однако и они не идеальны для промышленного получения рекомбинантных белков. Экономически выгоднее использовать некоторые другие дрожжи. Например, Pichia pastoris и Ogataea (Hansenula) polymorpha. Это метилотрофы, способные наращивать густую клеточную массу на дешевом и токсичном для других организмов метаноле. Гены продукта, который нужно получить (интерферона, инсулина, вакцинного белка и т.п.), «подставляются» под мощные промоторы, регулируемые простейшими веществами типа того же метанола или глицерола. 3. Культуры клеток насекомых. Известны сотни клеточных линий насекомых, полученных из разных бабочек, дрозофилы и других организмов. Для них разработаны бакуловирусные системы доставки генов, позволяющие производить более 500 белков млекопитающих и вирусов, 95% из которых имеют правильные посттрансляционные модификации. Паттерн гликозилирования у этой биосистемы слегка, но всё же отличается от человеческого, и если это считается недостатком при производстве терапевтических препаратов для людей, то при наработке вакцинных антигенов даже предпочтительно. Гуманизировать рекомбинантные гликопротеины позволяет замена генов гликозилтрансфераз насекомых на варианты, типичные для млекопитающих. Так создали, например, клеточную линию SfSWT-3. Если экспрессия гетерологичных генов в клетках млекопитающих часто требует модификации их самих, то в случае клеток насекомых обычно обходятся подготовкой векторов, что сокращает время от клонирования гена до получения его продукта с месяцев до недель. Очень популярна клеточная линия Sf9, полученная из яичников гусеницы-вредителя Spodoptera frugiperda, а также линии Tn-368 и High Five из яичников гусеницы Trichoplusia ni. Эти клетки довольно неприхотливы, могут расти в суспензии и дают большой выход функционального рекомбинантного продукта. Различия этих линий и получение с их помощью чужеродных белков детально разобраны в обзоре. Получение продукта в клетках насекомых обходится дороже, чем в дрожжевых системах, но всё же не настолько, как в клетках млекопитающих. 4. Культуры клеток млекопитающих. Они лишены несовершенств, связанных с посттрансляционной модификацией, но культивировать их сложнее и дороже, чем клетки насекомых и тем более микроорганизмов: контактное торможение роста, горы пластика, дорогие компоненты среды и оборудование. Однако контактное торможение мешает не всем культурам. Клеточные линии, полученные из опухолей, типа знаменитой HeLa, с ним не знакомы — они бессмертны. Клеточным культурам и технологиям «Биомолекула» посвятила отдельную статью. 5. Растения. О генетической модификации растений написано немало, знакомство с ней можно начать, например, обратившись к статье. Отметим лишь, что растения как биофабрики довольно дешевы, при этом получаемые с их помощью продукты не содержат токсинов и пирогенов. Самое неприятное при работе с ними — толстые клеточные стенки, требующие для введения ДНК всяческих изощрений. 6. Человек и другие животные. Рекомбинантные ДНК в организме человека призваны выполнять терапевтические, диагностические или профилактические функции, а вот в прочих организмах спектр их задач очень широк — от исследований и защиты до лечения и производства ценных веществ (у всех на слуху «трансгенное» молоко) или даже органов. 2. Типы векторов, используемых для клонирования. Вектором в генетической инженерии называют молекулу ДНК, способную самостоятельно реплицироваться, включать в свой состав чужеродную ДНК, переносить ее в реципиентные клетки и стабильно там поддерживать. Векторы используют для создания in vitro рекомбинантных молекул ДНК, чтобы впоследствии ввести их в клетки, для последующего клонирования там, то есть умножения их количества. Репликация векторов зависит от клеточных белков, поэтому для каждого вида реципиентных клеток необходимо конструировать свои векторы. Обычно в качестве векторных молекул используют ДНК плазмиды и вирусы, в том числе фаги, предварительно их модифицируя. По области использования различают: 1) векторы общего назначения – для клонирования геномных генов, кДНК и любых фрагментов ДНК; 2) векторы для экспрессии клонированных генов – для синтеза мРНК и белков; 3) специализированные векторы – для секвенирования генов и мутационного анализа, для изучения особенностей регуляции клонированных генов, для идентификации в клонируемой ДНК промоторов и других регуляторных сайтов. По происхождению векторы делят на: 1) плазмидные, которые существуют в клетке и вне ее только в виде молекул ДНК; 2) фаговые, которые существуют в виде молекул ДНК и вирионов; 3) гибридные, которые сочетают отдельные свойства плазмид и фагов. По структуре ДНК различают кольцевые и линейные векторы. По способу поддержания в клетке выделяют: 1) автономные векторы, которые реплицируются самостоятельно; 2) интегративные векторы, которые реплицируются в составе клеточной хромосомы. По числу молекул в клетке векторы могут быть малокопийными и мультикопийными. По числу репликаторов, имеющихся в векторном геноме, векторы делят на моно и бирепликоновые. Бирепликоновые векторы также называют челночными, если они могут реплицироваться в клетках различных видов. 3. Основные компоненты вектора. Вектор (в генетике и молекулярной биологии) – молекула нуклеиновой кислоты, чаще всего ДНК, используемая в генетической инженерии для передачи генетического материала внутрь клетки, в том числе в клетку живого многоклеточного организма in vivo. Существующие векторы: плазмиды фазмиды векторы на основе вируса SV40 векторы на основе аденовирусов векторы на основе герпесвирусов векторы на основе ретровирусов векторы на основе аденоассоциированного вируса В качестве примера рассмотрим процесс клонирования участка чужеродной ДНК бактерией E. coli при помощи плазмиды pBR322. pBR322 — искусственная плазмида, созданная Франциско Боливаром и Раймондом Родригесом с целью клонирования генетического материала. Она представляет собой циклический фрагмент ДНК длиной 4361 нуклеотидных пары. Плазмида содержит ген устойчивости к тетрациклину tet, взятый из естественной плазмиды pSC 101; ген устойчивости к ампициллину amp, взятый из транспозона Tn3; и участок начала репликации ori, заимствованный из плазмиды pMB 1. Тетрациклин и ампициллин — сильные антибиотики. Наличие в плазмиде генов устойчивости к ним (активных или блокированных) играет существенную роль в выделении бактерий со встроенным участком чужеродной ДНК. Плазмида содержит также сайты рестрикции PstI, BamHI и SalI, причём первый находится в гене amp, а два остальных — в гене tet. Это важное обстоятельство помогает модифицировать плазмиду. Предположим, что в плазмиду необходимо встроить фрагмент, который ранее был вырезан из другой ДНК рестриктазой Bam HI (то есть он имеет на концах последовательность нуклеотидов, характерную для сайта рестрикции Bam HI). Для этого плазмиды обрабатываются рестриктазой BamHI, (которая разрежет кольцевую молекулу в сайте рестрикции и образует линейный участок ДНК) и добавляются участки чужеродной ДНК. Поскольку на концах всех фрагментов ДНК находятся комплементарные последовательности нуклеотидов, они начнут «склеиваться», причём возможны два варианта склейки: Соединятся концы линейной плазмиды pBR322, образовав исходную (восстановленную) кольцевую плазмиду. Между концами линейной плазмиды pBR322 вклинится участок чужеродной ДНК, образовав кольцевую плазмиду со встроенным фрагментом. Поскольку плазмиды со встроенным фрагментом являются целью процесса, необходимо выделить такие плазмиды и клонировать их. Процесс идёт следующим образом: Плазмиды внедряются в клетки E. coli. Для этого клетки обрабатываются ионами Ca2+, что делает их мембраны проницаемыми для ДНК. Полученные бактерии высевают на среду, содержащую ампициллин. В этой среде нормально растут колонии бактерий, содержащие плазмиды, остальные колонии угнетаются. По этому признаку можно отличить бактерии, содержащие плазмиды; Колонии, содержащие плазмиды, перепечатываются на среду, содержащую тетрациклин. Поскольку чужеродная ДНК вклинивается внутрь гена tet, дезактивируя его, колонии бактерий с модифицированными плазмидами угнетаются тетрациклином. Таким образом они визуально отличимы от колоний бактерий с восстановленными плазмидами. В результате этих действий выделяются колонии E. coli, в плазмиды которых встроен участок чужеродной ДНК. Они высеваются в обычную среду для дальнейшего клонирования. Процедуру клонирования можно также вести с помощью рестриктаз SalI и PstI. В первом случае процесс будет аналогичен, в последнем бактерии с модифицированными плазмидами будут, наоборот, чувствительны к ампициллину и нечувствительны к тетрациклину. Введение чужеродной ДНК в клетку: химическая трансформация и электропорация. При введении чужеродной ДНК различают процессы трансформации и трансфекции. Трансформацией называется процесс введения вектора в клетку, вызывающий в ней наследственные изменения. Трансфекцией называется процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, не приводящий к наследственным изменениям в клетке. Эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку низкая. Из каждых 104-105 плазмид в клетки попадает только одна. Поэтому среди клеток, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной. При высеве всех клеток на селективную среду, содержащую какие-либо специальные добавки (в основном антибиотики), только клетки, содержащие встроенные гены, начинают делиться и образуют колонии, которые называются клоном, а сам процесс клонированием. Отбор по определенному биологическому признаку, в частности по устойчивости к антибиотику, называется селекцией. В настоящее время применяются 2 основные группы методов переноса ДНК в клетки растений: прямые и агробактериальные. Прямой перенос ДНК в растительную клетку. При этом способе используются различные методы: электропорация, бомбардировка, микроинъекции, воздействие полиэтиленгликоля (ПЭГ), поливинилового спирта или ионов Са, и высокого pH. Эти методы трудоемки и дорогостоящи, однако в некоторых случаях без них никак не обойтись. В некоторых из этих методов (электропорация, воздействие ПЭГ, поливинилового спирта или ионов Са и высокого pH) в качестве объекта для введения ДНК используются протопласты — клетки, лишенные клеточной стенки. Их получают, воздействуя на растительную ткань растворенными в осмотике ферментами, разрушающими пектин и целлюлозу — пектиназой (мацерозимом) и целлюлазой. Осмотик, в качестве которого используются или многоатомные спирты (ман- нитол или сорбитол) или сахара (глюкоза или сахароза), необходим, чтобы протопласт после «переваривания» клеточной стенки не разрушился. После всех манипуляций протопласты высевают на питательную среду, где они образуют клеточную стенку, делятся и формируют колонии, из которых в дальнейшем могут образоваться трансформированные растения-регенеранты. Электропорация — основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют протопласты и плазмидную ДНК, которую необходимо ввести в клетки. Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200—350 В, длительность импульса 30—60 мс), приводящие к образованию пор (электропробой) в цитоплазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы молекулы ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. При этом объем клетки увеличивается. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и реципиентных клеток для каждой системы клеток подбирают экспериментально, с тем, чтобы достичь высокого процента поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оптимальных условиях электропорации количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток. Трансформация протопластов с помощью ПЭГ, ионов Са и высокого pH. Раствор ПЭГ добавляют к суспензии протопластов, смешенных с плазмидой и инкубируют в течение 20—30 мин. При другом способе в суспензию протопластов в растворе СаС12 добавляют щелочь, создавая pH 10—12, и выдерживают в этих условиях 15—20 мин. После таких обработок протопласты отмывают центрифугированием и высевают на питательные среды. ПЭГ и ионы Са воздействуют на плазматическую мембрану, окружающую протопласты, удаляя с неё положительный заряд, отталкивающий молекулы ДНК. На нейтрально заряженную мембрану прикрепляется плазмидная ДНК и проходит в клетку за счет пиноцитоза — формирования пузырьков, окруженных липидной мембраной, в которых находятся молекулы ДНК. В клетке липидная оболочка растворяется и ДНК встраивается в геном клетки. Трансформация с помощью биологической баллистики (/ биолистики / бомбардировки). Метод биологической баллистики (биолистики), несмотря на свою сложность, является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов (из прямых) трансформации растений, особенно однодольных растений. Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички инертного металла (вольфрам, титан, золото), диаметром 0,6—1,2 мкм, прикрепляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Металлические частички, несущие ДНК, наносят на пластиковую пулю и помещают внутрь биолистической (генетической) пушки на расстоянии 10—15 см над растительной тканью-мишенью. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления частички металла с огромной скоростью выбрасываются из специального отверстия, над которым помещается пуля, и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. Трансформация микроинъекцией. При этом способе каждый отдельный протопласт прикрепляют на специальную подложку и с помощью супертонкой стеклянной иглы впрыскивают в него векторную ДНК. Затем протопласты отделяют от подложки и помещают в питательную среду, где они после образования клеточной стенки могут делиться, образуя микрокаллусы, из которых в дальнейшем может регенерировать растение. Метод в настоящее время почти не используется из-за большой трудоемкости. Отбор рекомбинантных клонов. Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией. Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной (обычно одна из тысячи). Кроме того, часть этих бактерий может содержать исходную, не трансформированную плазмиду. Отделение клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, от общей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клонирования трансформиро-ванную бактериальную суспензию низкой концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар или чаще на нитроцеллюлозные фильтры, помещенные на чашку Петри с питательной средой, из расчета 5 - 10 бактерий на 1 см2 поверхности. Бактериальная клетка на поверхности фильтра начинает делиться с образованием в итоге маленькой колонии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника. Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя рассмотренную ранее плазмиду pBR322, содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бактерий в питательную среду добавляют антибиотик - или ампициллин, или тетрациклин в зависимости от того, какой из генов (blа или tet) остался интактным (неповрежденным) после введения чужеродной ДНК. На такой среде клоны образуют клетки только с плазмидами (рекомбинантными и нерекомбинантными), а все остальные погибают. Для отделения рекомбинантных бактерий от исходных используют следующую технологию. К фильтру с исходными колониями прижимают свежий нитроцеллюлозный фильтр (фильтр-реплика), который затем переносят на чашку Петри с аналогичной питательной средой, но, содержащей антибиотик, ген устойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантов. На этих фильтрах дают клоны только те бактерии, которые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Анализируя расположение клонов на исходном фильтре, и фильтре-реплике, выделяют колонии, содержащие трансформированные клетки. При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод радиоавтографии, основанный на способности двух любых одноцепочечных комплиментарных фрагментов ДНК спариваться (гибридизоваться) между собой. Если один фрагмент (ДНК-зонд, гибридизационный зонд) содержит радиоактивную метку (обычно изотоп фосфора 32 или иода 125), то радиоактивной будет и гибридизованная молекула ДНК или ее фрагмент. Технология подготовительного этапа радиоавтографического скрининга имеет много общего с описанной выше процедурой, используемой при клонировании. Полученную с трансформированной бактериальной колонии фильтр-реплику подвергают щелочной обработке при высокой температуре. При этом клетки в колониях лизируются, а клеточная ДНК денатурируется с разрушением двойной спирали и одиночные цепи связываются с нитроцеллюлозой в том участке, где была расположена соответствующая колония. Далее фильтр подвергают обработке раствором, содержащим специально приготовленные, меченные изотопами, одноцепочечные фрагменты клонируемой ДНК а затем промывают для удаления раствора с ДНК-зондом. На тех участках фильтра, где находились трансформированные клетки будет происходить процесс гибридизации клонируемой ДНК с ДНК-зондом и они окажутся радиоактивными. |