ферменты. Вакцины. Лекция 6 вакцины
 Скачать 162.5 Kb.
|
|
Технологии получения вакцин Бактериальные и вирусные вакцины в силу многокомпонентности и многостадийности технологии разрешено производить на тех предприятиях, которые могут соблюдать основные принципы GMP. Для производства вакцин необходима специальная технологическая линия, укомплектованная соответствующим оборудованием. Важен автоматический контроль и регулирование технологического процесса, включающий постоянную в динамике производства вакцины регистрацию и регулирование отдельных этапов. Столь же актуально соблюдение стерильности на всех этапах получения вакцин. Исключение как внешней (воздух, оборудование, персонал), так и внутренней (использование стандартного, соответствующего ГОСТу субстрата для подготовки питательных сред при культивировании вакцинных штаммов; использование животных тканей и клеток, куриных эмбрионов, полученных от здоровых животных и птиц, выращенных в специализированных хозяйствах, необходимых для культивирования вирусов) контаминации посторонней микрофлорой. Очень важно в производстве вакцин строгое соблюдение технологии, применение стандартных методик, сырья и реактивов. В производстве используются только те химические вещества, которые отвечают требованиям международной или национальной фармакопеи и подвергаются входному контролю. В соответствии с требованиями ВОЗ не допускается использование, например, пенициллина и других бета-лактамов на любой стадии производства вакцин. Разрешается использование других антибиотиков, но их количество в конечном продукте ограничивается. Также в процессе изготовления вакцин используются только такие растворители, стабилизаторы и консерванты, которые не оказывают негативного влияния на качество вакцины и не вызывают побочного действия на вакцинируемый организм. При хранении и транспортировке требуется соблюдение «Холодовой цепи», т.е. бесперебойное обеспечение оптимального температурного режима хранения и транспортирования медицинских иммунобиологических препаратов, в том числе вакцин на пути их следования от предприятия-изготовителя до вакцинируемого. Производство некачественной вакцины, нарушение условий хранения и транспортировки, как и неправильная техника введения человеку вакцины, аллергия у прививаемого могут приводить к поствакцинальным осложнениям. В технологии производства живых, инактивированных, субъединичных вакцинных препаратов вначале необходимо наработать путем ферментации биомассу микроорганизмов, чтобы иметь в достаточном объеме микробные антигены для изготовления вакцин в промышленных масштабах. Для производства ДНК-вакцин требуется масштабная амплификация ДНК, кодирующего синтез белка — иммуногена. Для продукции синтетических, пептидных вакцин требуются в качестве субстрата в достаточном объеме различные аминокислоты и их производные. Генно-инженерные вакцины создаются на основе технологии рекомбинантной ДНК. Биомасса модифицированных микроорганизмов нарабатывается ферментационной технологией. При производстве живых и инактивированных вакцин предварительно подготавливается посевный материал и среда культивирования. Биомасса вакцинных штаммов нарабатывается в биореакторах глубинной ферментацией (бактерии, дрожжи) или поверхностной на твердых питательных средах (мицелиальные грибы). Процессы выполняются в строго асептических условиях, исключающих контаминацию посторонней микрофлорой, фагами. В случае получения живой вакцины биомассу аттенуированного штамма концентрируют, стандартизируют по количеству микроорганизмов в единице объема, лиофилизируют со стабилизирующей средой, фасуют в ампулы или флаконы. Срок хранения лиофилизированных живых вакцин 1-2 года при 4-8°С. При получении убитых вакцин микроорганизмы концентрируют, стандартизируют по числу микробных клеток в единице объема, инактивируют. Далее лиофилизация, фасовка и упаковка во флаконах или ампулах, хранение. При создании субъединичных вакцин клетки микроорганизмов лизируют, выделяют вакцинный антиген из клеточного детрита путем сорбции, фильтрации, хроматографии и др. Далее конъюгация антигена с иммуномодуляторами, адъювантами, стабилизация. Получение комбинированной вакцины Входящие в состав комбинированной вакцины «Инфарникс Гекса», столбнячный и дифтерийный анатоксины получают обработкой формальдегидом очищенных токсинов Corybacterium diphtheriae и Clostridium tetani. Компоненты ацеллюлярной коклюшной вакцины получают путем их выделения и очистки из культуры Bordetella pertussis. Дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин и компоненты ацеллюлярной коклюшной вакцины адсорбируются на солях алюминия. Поверхностный антиген вируса гепатита В (HBV) продуцируется культурой рекомбинантных дрожжевых клеток (Saccha- romyces cerevisiae), полученных методом генной инженерии; в их геном интегрированы гены вируса гепатита В, кодирующие поверхностный HBsAg. После накопления биомассы рекомбинантных дрожжевых клеток, из культуральной среды выделяется этот поверхностный антиген и тщательно очищается физико-химическими методами. При этом антиген спонтанно трансформируется в сферические частички диаметром 20 нм, в которых содержатся негликозилированные полипептиды антигена и липидный матрикс, состоящий, главным образом, из фосфолипидов, имеющих характерные свойства природного HBsAg. Вирусы полиомиелита III типа культивируют in vitro на клеточной линии VERO, очищают и инактивируют с помощью формальдегида. Бактериальный полисахарид используется в качестве адъюванта, он конъюгируется со столбнячным анатоксином. После очищения конъюгат адсорбируют на гидрате окиси алюминия и лиофилизируют в присутствии лактозы, используемой в качестве стабилизатора. Препарат «Инфарникс Гекса» представляет собой суспензию для инъекций в одноразовом шприце и лиофилизированный порошок для инъекций во флаконе; содержимое шприца и флакона смешиваются перед использованием. Получение вирусных вакцин Вакцинные штаммы вирусов нарабатываются в культуре тканевых клеток либо в куриных эмбрионах. Предварительно подготавливается культура тканевых клеток (первично-трипсинизированных или перевиваемых) или куриный эмбрион (7-9-11дневный) для культивирования вирусов. В асептических условиях вирусом заражается клеточная культура либо куриный эмбрион. Вирус репродуцируется, накапливается в клеточной культуре или в полости куриного эмбриона. Затем его выделяют, очищают, стандартизируют, лиофилизируют, фасуют в ампулы и укупоривают (в случае цельновирионных вакцин, живых или инактивированных). Живые вакцинные штаммы предварительно аттенуируются пассированием их на культуре клеток in vitro. Для получения субъединичных вакцин из вирусных частиц выделяются поверхностные (они наиболее иммуногены и специфичны) либо нуклеопротеидные антигены. Выделенные субстанции очищаются, стабилизируются, вносятся дополнительные компоненты (адъюванты, сорбенты, иммуномодуляторы и др.). Например, при получении вакцины коревой живой сухой на основе аттенуированного штамма Л-16 выполняются следующие этапы: из эмбрионов перепелов путем трипсинизации готовят культуру клеток для посева вакцинного штамма вируса кори Л-16. После заражения культуру инкубируют в термостате при 36°С в течение 15 суток; культуральная жидкость, содержащая вирус проверяется на контаминацию посторонней микрофлорой и определяется титр вируса — как показатель биологической активности препарата. При разработке ассоциированной вакцины, содержащей наряду с вирусом кори, еще и штаммы паротита и краснухи, для их культивирования используется диплоидная клеточная линия ЭФЧ- J15, полученная из легочной ткани эмбриона человека. Такая клеточная линия сохраняет жизнеспособность и биологическую активность на протяжении 60 пассажей и проявляет выраженную чувствительность к вышеуказанным вирусам. Дополнительное внесение в культуру клеток таких компонентов, как СаС12, аргинин и аминопептид, а также использование смеси сред 199 и Игла с двойным содержанием аминокислот значительно повышает репродукцию вирусов, существенно повышает их титр. Положительные свойства диплоидной линии клеток состоят в том, что, кроме несомненного преимущества как вирусологической модели, клетки ЭФЧ-Л5 характеризуются пролиферативной активностью, хорошо культивируются статическим и роллерным способами, быстро восстанавливаются после криоконсервирования, сохраняя при этом высокую жизнеспособность и чувствительность к исследуемым вирусам; свободны от контаминации бактериями, грибами, вирусами и микоплазмами. Получение противогриппозных вакцин В 2004 году около 13-15% реализованных вакцин составила гриппозная вакцина. Производство вакцины исчисляется несколькими сотнями млн. тривалентных инактивированных вакцинных доз в год, однако это покрывает потребности только 10-15% мирового населения. Разработаны технологии получения следующих гриппозных вакцин: - цельновирионные вакцины, они представлены живой противогриппозной вакциной, содержащей ослабленный вирус гриппа, выращенный в аллантоисной полости куриного эмбриона или инактивированной вакциной, также полученной пассированием на курином эмбрионе. Аттенуированная вакцина вызывает более выраженный иммунный ответ, нежели тривалентная инактивированная. Но живую вакцину необходимо хранить при -15°С, она более реактогенна. - сплит-вакцины (≪split≫ - расщеплять), вакцины второго поколения, они достаточно иммуногенны. Репродуцированный (размноженный) вакцинный штамм вируса гриппа выделяется из культуры клеток или тканей куриного эмбриона, очищается и затем вирусные частицы разрушают детергентом (например, диэтиловым эфиром). Такая вакцина содержит все вирусные белки: гемагглютинин, нейраминидазу и белки нуклеопротеида вируса. Дополнительная очистка уменьшает содержание токсичных субстанций, в т.ч. липидов, по сравнению с цельновирионной вакциной. Следовательно, она менее реактогенна. Сплит-вакцинами, содержащими гемагглютинин, нейраминидазу и нуклеопротеидные белки вируса являются французский ≪Ваксигрипп≫, немецкий ≪Бегривак≫, бельгийский ≪Флюарикс≫, и др. - субъединичные вакцины, содержащие только поверхностные антигены вируса гриппа, обладающие высокой иммуногенностью и слабой реактогенностью. Это вакцины третьего поколения, в которых достигается максимальная очистка антигенов от токсичных примесей (в т.ч. липидов). Такая вакцина содержит гемагглютинин и нейраминидазу, и не содержит нуклеопротеидных белков. Именно поверхностные антигены значимы в развитии иммунитета против гриппа. Такие вакцины менее реактогенны, нежели расщепленные или цельновирионные. Примеры субъединичных вакцин - голландский ≪Инфлувак≫, немецкий ≪Агриппал≫, российский ≪Гриппол≫и др. Технология получения субъединичной противовирусной вакцины — вначале определяются эпидемически актуальные подтипы вируса гриппа типа А, либо вирус типа В. Это клинические изоляты и они недостаточно эффективно размножаются in vitro. Поэтому из этих вирусных частиц выделяются гены, ответственные за синтез гемагглютинина и нейраминидазы и встраиваются в геном лабораторного вакцинного штамма вируса гриппа, хорошо размножающегося на курином эмбрионе, т.е. получают рекомбинантный вакцинный штамм; - в лабораторных условиях нарабатываются рекомбинантные вакцинные штаммы вируса путем заражения ими аллантоисной жидкости куриного эмбриона. Рекомбинантного вакцинного штамма (это подтипы вируса гриппа типа А, также тип В) должно быть достаточно для последующей инокуляции ими куриных эмбрионов в производственных масштабах; - в производственных условиях десятки тысяч яиц заражаются раздельно каждым штаммом вируса гриппа (обычно используются два подтипа вируса гриппа А и штамм тип В). Инкубация при 33-35 градусах Цельсия в течение 2-3 суток. За это время репродуцируется достаточное количество вирусов; - при помощи ультрацентрифугирования выделяется вирусная масса и инактивируется обычно формальдегидом; - субъединицы гемагглютинин и нейраминидаза выделяются путем обработки вирусных частиц детергентом триметил-цетил-аммониум бромида и повторного ультрацентрифугирования и диализа; - гемагглютинин и нейраминидаза спонтанно соединяются в розетки и помещаются в буферный раствор, содержащий соли калия, натрия, кальция и магния и очень незначительные количества консерванта для предупреждения микробной контаминации; - такая процедура проводится с каждым из трех вакцинных штаммов - двух подтипов вируса типа А и типом вируса В. Эти штаммы комбин ируются в одном шприце, в объеме 0,5 мл раствора. Каждый год субъединичная вакцина, изготовленная по вышеизложенной технологии проходит жесткий контроль качества, с соответствующей сменой ее штаммового состава. За спектр антигенов, включаемых в вакцину, ответственна ВОЗ. Она располагает сетью Национальных лабораторий по гриппу в 80-ти странах мира, которые во время эпидемий выделяют от больных эпидемические штаммы вирусов и рассылают их в 4 центра, сотрудничающих с ВОЗ. Все выделенные штаммы тщательным образом анализируются, и в феврале собираются все руководители этих центров. По результатам дискуссии формируются новые рекомендации — какие штаммы вирусов должны быть использованы для приготовления новых вакцин на этот год. Эту информацию получают все фирмы, производящие вакцины. Они успевают подготовить рекомендованные ВОЗ штаммы, запускают их в технологический процесс. Как только появляется первый образец новой в акцины, сра зу проводятся клинические исследования этой вакцины у молодых лиц и пациентов преклонного возраста для оценки эффективности и переносимости. К июню-сентябрю того же года вакцины готовы и поступают в продажу. Задача в том, чтобы антигенный состав вакцины максимально совпадал с циркулирующими штаммами вируса гриппа. Состав меняется ежегодно (например, в 2003-2004 гг., он содержал три штамма вируса гриппа - A (H1N1), A (H3N2) и вирус типа В, в последующие годы использовалось иное сочетание гриппозных штаммов). По указаниям ВОЗ и решению Европейского Комитета (ЕК), чтобы добиться достаточной силы иммунного ответа, каждая доза противогриппозной вакцины должна содержать 15 мкг гемагглютинина вируса гриппа, что обеспечивает их высокую эффективность. Технологии получения субъединичных противогриппозных вакцин оптимизируются путем включения гликопротеинов вируса - гемагглютинина и нейраминидазы в наночастицы, в липосомы (при этом значительно усиливается адресность доставки и сохраняемость этих антигенов от преждевременного разрушения защитными факторами организма).Столь же актуально сочетание вакцины с иными иммуномодулирующими факторами (например, группа вакцин ≪Гриппол≫, состоящих только из высокоочищенных антигенов вируса гриппа и иммуномодулятора растительного происхождения - полиоксидония). Включение полиоксидония как иммуноадъюванта в состав противогриппозной вакцины позволило создать новое, IV поколение вакцин, отличающихся высокой иммуногенностью и самым высоким профилем безопасности, что позволяет использовать их как у младенцев (с 6 мес.), так и у иммунокомпрометированных контингентов населения. Разработана вакцина на основе адаптированного к холоду вируса гриппа и применена для интраназального введения здоровым индивидуумам. Адаптированный к холоду штамм вируса получен в результате культивирования нескольких поколений вируса в культуре клеток при 25 градусах Цельсия. Это привело к ослаблению его патогенности. Чувствительность полученного аттенуированного штамма к более высокой температуре ограничивает его способность к активному размножению при введении в верхние дыхательные пути. Вакцинный штамм индуцирует как синтез различных классов антител (IgG сыворотки и IgA слизистой оболочки носа), так и появление специфичных киллерных Т-лимфоцитов, что обеспечивает защиту организма от постоянно меняющего антигенный профиль вируса гриппа. Получение ДНК-вакцин Технология получения ДНК-вакцин основана на производстве, амплификации в большом количестве фрагментов ДНК, кодирующих синтез протективных антигенов микроорганизмов. Затем эти ДНК встраиваются в векторы на основе плазмид либо вирусов и трансфицируются в клетки и ткани вакцинируемого человека. Чаще для получения ДНК-вакцины, гены, кодирующие продукцию протективного антигена микроорганизма встраиваются в состав бактериальных плазмид, способных к автономной репликации в цитоплазме клеток. Кроме генов, кодирующих синтез иммуногенного микробного белка, в плазмиду встраивают генетические конструкции (инициирующий и терминирующий кодоны, промотор), необходимые для высокой экспрессии трансфицированной ДНК-вакцины в клетках человеческого организма. В результате продуцируется протективный микробный антиген, инициирующий выработку иммунного ответа против соответствующего возбудителя. ДНК-вакцина в составе плазмиды располагается в цитоплазме и не интегрирует с ДНК человеческой хромосомы, т.е. не вызывает генетические перестройки в организме. Подобные ДНК-вакцины вводятся в солевом растворе парентерально (внутримышечно, внутрикожно). При этом часть инъецированной ДНК-вакцины в составе плазмиды попадает из межклеточного пространства внутрь клеток. Для доставки ДНК-вакцины в клетки организма вместо плазмиды возможно использовать липосомы. Также ДНК-вакцину можно трасфицировать внутрь клеток вакцинируемого, используя метод биобаллистики. Трансфицируемая ДНК адсорбируется на поверхности микрочастиц золота либо платины, диаметром около 1-2 мкм. При помощи специального устройства (генная пушка или пистолет) микрочастицами бомбардируются клетки, ткани организма. Часть микрочастиц проникает внутрь клеток (в фибробласты, миоциты), внося с собой и ДНК-вакцину. Экспрессия трансфицированной генетической конструкции приводит к синтезу соответствующего антигена, с последующим формированием иммунного ответа на него. В зависимости от трансфицированной ДНК, в организме вакцинированного синтезируются либо протективные антигены микроорганизмов, либо опухольассоциированные антигены и др. ДНК-вакцины характеризуются достаточной термостабильностью, устойчивостью при хранении, не требуют соблюдения Холодовой цепочки (постоянное нахождение в условиях холодильника) при транспортировке. Вместе с тем ДНК- вакцины пока характеризуются слабой иммуногенностью. Требуется совершенствование технологии адресной доставки ДНК-вакцины в клетки вакцинируемого, более эффективной регуляции экспрессии трансфицированной ДНК. Получение противоопухолевых вакцин Наиболее эффективный способ изготовления вакцин – это использование инактивированных аутологичных опухолевых клеток. Другой способ методически более сложен и заключается в изготовлении вакцины на основе отдельных компонентов опухолевой клетки, обладающих антигенностью - это пептиды, белки теплового шока, полисахариды. Пептидные противоопухолевые вакцины разрабатываются на основе антигенов MAGE-1 и MAGE-3, типичных для меланом и рака молочной железы, меланом и карцином головы и шеи; на основе СА 125(TD-1) при раке яичника; на основе PSA (TD-3) при раке простаты; на основе MUC-1 (TD-4) - это муциновый антиген, вяывляемый при раке молочной железы, яичников, щитовидной железы, легких. Также разрабатываются вакцины, в состав которых входит несколько высокоочищенных опухолевых антигенов или их синтетических аналогов (поливалентные вакцины), что повышает вероятность индукции иммунного ответа в отношении различных клеточных клонов одной опухоли.С целью усиления иммуногенности противоопухолевых антигенов применяются адъюванты - БЦЖ, пектины, липид А, мурамилдипептид, гликопептиды бактерий и другие иммуномодуляторы. Иммуногенность опухолевых антигенов также можно усилить путем химической модификации их структуры; конъюгацией с непатогенными вирусами и бактериями; усилением экспрессии генов, кодирующих синтез опухолевых антигенов в организме вакцинируемого. Около сотни вакцин проходят клинические испытания, в основном это аллогенные вакцины и лишь 20-25% - аутологичные, т.е. созданные на основе опухолевых антигенов, взятых у вакцинируемого больного. По специфичности оба типа вакцин (аллогенные и аутологичные) подразделяются на антиген-специфические, поливалентные и дендритно-клеточные. Антиген-специфические вакцины потенциально характеризуются большей избирательностью действия. Наиболее перспективны разработки вакцин при раке молочной железы, предстательной железы, толстого кишечника и легких. Повышенный интерес к разработке вакцин при меланоме и карциноме почек, так как эти опухоли хорошо поддаются иммунотерапии. |