Реферат ОНД. Реферат по дисциплине Введение в биотехнологиюна тему Генетическая инженерия получение генов, конструирование рекомбинантных днк, перенос генов в клетки организмареципиента, скрининг и отбор рекомбинантных клеток
 Скачать 31.54 Kb.
|
|
Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Уфимский государственный нефтяной технический университет» Кафедра «Биохимия и технология микробиологических производств» Реферат по дисциплине «Введение в биотехнологию»на тему «Генетическая инженерия: получение генов, конструирование рекомбинантных ДНК, перенос генов в клетки организма-реципиента, скрининг и отбор рекомбинантных клеток» Выполнил: ст. гр. БТБ-22-01 ____________ Махиянов А.З (подпись, дата) Проверил: доц.,канд. хим.наук ____________ Зайнашев А.Т (подпись, дата) Уфа 2023 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Генная инженерия - это новый раздел экспериментальной молекулярной биологии. Появление ее методологии стало возможным благодаря предшествующим работам многих исследователей в различных областях биохимии и молекулярной генетики. Генная инженерия значительно расширила экспериментальные границы молекулярной биологии, поскольку позволила вводить в различные типы клеток чужеродную ДНК и исследовать ее функционирование в гетерологическом окружении, что дало возможность выявлять общебиологические закономерности организации и выражения генетической информации в различных организмах. Данный подход открыл перспективы создания принципиально новых микробиологических продуцентов биологически активных веществ, а также животных и растений, несущих функционально активные чужеродные гены. Более того, появилась возможность искусственно создавать гены, обладающие свойствами двух или более природных белков. Все это удивительным образом революционировало биологическую науку и дало мощный импульс развитию биотехнологии. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2. Получение генов Существуют три способа получения генов: Выделение его из ДНК; Путем химико-ферментативного синтеза; Воссоздание на основе изолированной матричной РНК с помощью РНК-зависимой полимеразы; Выделение нужного гена из ДНК. Данный метод применяют в том случае, если структура ДНК, из которой выделяют нужный ген, хорошо известна, как сайты рестриктазы. Вначале получают гомогенную ДНК, затем ее обрабатывают комплексом рестриктаз. Рестрикты встраиваются в нужную плазмиду, которую вводят в клетки-реципиенты, и исследуют просинтезированные белки. Отбирают те клетки, которые синтезируют нужный белок, а ,следовательно, несут нужный ген. Химико-ферментативный синтез нужного гена. Его идея в следующем. На первом этапе химическим синтезом получают короткие олигонуклеотиды, которые затем соединяют при помощи фермента лигазы. В результате чего получают нужный ген, не имеющих лишних участков, который полностью соответствует природному гену. Воссоздание на основе изолированной матричной РНК с помощью РНК-зависимой полимеразы. Это самый популярный метод синтеза генов. Матричной РНК обычно много в клетках, специализирующихся на синтезе нужного белка. Она не содержит интронов соответствующих генов, поэтому может транслироваться в бактериальной клетке. Обратная транскриптаза — РНК-зависимая ДНК-полимераза — образует копии ДНК с геномов мРНК. 3. Конструирование рекомбинантных ДНК Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением двух и более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических средств. Мы уже знаем, что фрагменты ДНК получают с использованием ферментов рекстрикатаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты с тупыми и липкими концами. Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящие от концов фрагментов ДНК. Сшивка по одноименным “липким” концам. Некоторые рестриктазы, внося в цепи ДНК симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы на равных расстояниях от центра сайта узнавания и образующие “ступеньку”. Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями, поэтому ААТТ-концы не будут спариваться с АГЦТ-концами. Но любые два фрагмента, образовавшиеся под действием одной и той рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитиевыми участками комплементарных нуклеотидов. Но после такого спаривания полной целостности двойной спирали не восстановится, так как останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для его восстановления или же сшивания используют фрагмент ДНК- лигазу. Данный фермент в живой клетке выполняет ту же функцию – сшивание фрагментов ДНК, синтезирующиеся при репликации. Сшивка по "тупым" концам. Липкие концы не абсолютно необходимы для связывания фрагментов ДНК. Тупые концы также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам. Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами. В ситуации, когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или "переходники"). Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Существуют большие наборы таких генных "переходников". Естественно, что при использовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, промотор или участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обуславливают их экспрессию. Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец". При необходимости липкие концы можно превратить в тупые. Это достигается либо отщеплением липких концов с помощью фермента - эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы "застраивают", то есть с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых липких концах синтезируют вторую нить. 4. Перенос генов в клетки организма-реципиента Передача встроенных генов осуществляется путем трансформации и конъюгации. Если гены встраиваются в геном вируса, то наиболее распространенным способом передачи информации является трансформация. Чтобы клетку легко можно было трансформировать она должна быть компетентной. Компетентность бактериальных клеток достигают обработкой СаСl2, полиэтиленгликолем, воздействием теплового удара. ДНК легко проникают в клетку через цитоплазматическую мембрану протопластов. Трансформация представляет собой наиболее универсальный путь передачи генетической информации, она имеет наибольшее значение для генетической инженерии. Однако существуют еще два способа передачи генетической информации – конъюгация и трансфекция, которые можно рассматривать как варианты трансформации. При конъюгации происходит перенос лишь некоторых плазмид (конъюгативных). Неконъюгативные плазмиды также могут передаваться путем конъюгации Трансфекция – передача всего набора генов вируса или фага, приводящая к развитию вирусных частиц в клетке при участии плазмид-помощников. Трансфекцию клеток растений и животных осуществляют двумя способами: использованием очищенной ДНК и протопластов, а так же заражением целых многоклеточных организмов (в этом случае говорят об инфекции) вирусными частицами или ДНК. Кроме того, сконструированы многочисленные челночные векторы, способные к репликации в животной и бактериальной клетке и поддерживающие эффективный синтез клонируемого гена в животной клетке. 5.Скрининг и отбор рекомбинантных клеток После переноса сконструированных ДНК, как правило, лишь небольшая часть реципиентных клеток приобретает необходимый ген. Поэтому очень важный этап – идентификация клеток несущих ген-мишень. На первой стадии идентифицируют и отбирают клетки, несущие вектор, на основе которого осуществлен перенос ДНК. Отбор проводят по генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Главным образом маркерами служат гены устойчивости к антибиотикам. Поэтому отбор проводят высевом клеток на среды, содержащие конкретный антибиотик. После высева на этих средах вырастают только клетки, в составе которых находится вектор с генами антибиотиковой устойчивости. На второй стадии отбирают клетки, несущие вектор и ген- мишень. Для этого используют две группы методов: основанные на непосредственном анализе ДНК клеток- реципиентов основанные на идентификации признака, кодируемого геном-мишенью Скрининг библиотеки - поиск нужного клона (фрагмента ДНК) Зонд - одноцепочечная молекула ДНК или РНК с определенной последовательностью оснований, несущая метку (радиоактивную, флуоресцентную, иммунологическую) •гомологичные гены (участки ДНК) близких видов •гены того же генного семейства •искусственно синтезированные молекулы ДНК ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проделанная работа позволяет сделать вывод о том, что на технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Сейчас, даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет. В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Что такое генная инженерия // URL: https://ktonanovenkogo.ru/voprosy-i-otvety/gennaya-inzheneriya-ehto.html Конструирование рекомбинантных ДНК // StudFiles URL: https://studfile.net/preview/6882437/page:4/ Перенос генов в клетки организма-реципиента // StudFiles URL: https://studfile.net/preview/6882437/page:38/ Генная инженерия // URL: https://dodiplom.ru/ready/127078 Скрининг и отбор рекомбинантных клеток // StudFiles URL: https://studfile.net/preview/4597178/page:4/ Получение генов // StudFiles URL: https://studfile.net/preview/5750640/page:37/ Методы получения генов // Allbest URL: https://otherreferats.allbest.ru/biology/00128522_0.html |