ферменты. Вакцины. Лекция 6 вакцины
 Скачать 162.5 Kb.
|
|
Лекция 6 ВАКЦИНЫ Характеристика вакцин ≪Я - автор вакцины, но не могу утверждать, что она совершенно, полностью безвредна. Прежде чем наступать таким образом на инфекции, следует спросить у людей: хотят ли они идти по этому пути? Известны ли им все ≪за≫ и ≪против≫? Как хотите, но обязанность сохранить жизнь даёт нам одно право - знать. А я пока не знаю, что лучше...≫ (Гистин Рамон - создатель дифтерийного анатоксина) Вакцины (Vaccines) - препараты, изначально предназначенные для профилактики инфекции, для создания активного иммунитета. Основным действующим началом каждой вакцины является иммуноген, т. е. корпускулярная или растворенная субстанция, несущая на себе химические структуры, аналогичные антигенным компонентам возбудителя заболевания, вызывающим иммунный ответ. Предупреждение распространения инфекций с помощью иммунизации, без сомнения, является одним из величайших достижений человечества в области медицины. По данным Всемирной организации здравоохранения и Детского фонда Организации Объединенных Наций за 2007 год, благодаря вакцинации против четырех болезней - коклюша, дифтерии, столбняка (КДС) и кори - за год было предотвращено почти 2,5 миллиона случаев смерти во всех возрастных группах. В 2006 году глобальный охват детей грудного возраста вакцинацией против КДС достиг 79% по сравнению с 20% в 1980 году. В более широких масштабах стали также применяться и некоторые недостаточно используемые вакцины, включая вакцины против гепатита В, краснухи и желтой лихорадки. В 2006-2007 годах в разных странах испытания проходили 25 новых вакцин. Технология разработки и производства вакцин длится несколько лет, потому что вакцина испытывается по многим тестам, причем каждый следующий тест проводится только после успеха предыдущего; используются очень хорошо оборудованные и достаточно дорогие технологические линии. За XX столетие средняя продолжительность жизни людей увеличилась примерно на 30 лет, что в немалой степени обусловлено массовой вакцинацией. Половина существующих вакцин появилась в течение последних 25-30 лет, что соответствует разработке примерно одной вакцины в год, по сравнению с одной в пять лет, как это было в более ранний период. Как известно, эффективность вакцинации связана с индукцией протективного гуморального и/или клеточного иммунного ответа, который в свою очередь определяется особенностями структуры антигенов возбудителей, против которых производится вакцинация. Также ее эффективность обусловлена характером взаимодействия микроорганизма с системой врожденного иммунитета. В настоящее время успешно используются вакцины против патогенов, вызывающих остро текущие инфекции. Для латентных или хронических заболеваний, вызываемых такими возбудителями, как ВИЧ, герпес-вирус человека, вирус гепатита С, микобактерии туберкулеза и др., а также болезней, вызываемых микроорганизмами, характеризующимися внутривидовой изменчивостью (серологические варианты; антигенный дрейф или шифт), эффективные вакцины необходимо разрабатывать. С развитием знаний о функционировании иммунной системы сфера применения вакцин постоянно расширяется. Разрабатываются препараты для иммунотерапии онкологических заболеваний. В перспективе - конструирование вакцин для лечения и предупреждения аллергии, аутоиммунных заболеваний. К 2000 году объем продаж вакцин в мире составил почти 4 млрд. долларов, в 2004 около 10 млрд. долл., к 2015 ожидается реализация на 30-40 млрд. долларов. Как известно, основу каждой вакцины составляют протектив- ные антигены, представляющие собой лишь небольшую часть микробной клетки или вируса и обеспечивающие развитие специфического иммунного ответа. Протективные антигены по химической природе могут быть белками, гликопротеидами, липополисахаридобелковыми комплексами. Они могут быть структурными компонентами микробной клетки (коклюшная палочка, стрептококки и др.), секретироваться ими (бактериальные токсины), а у вирусов располагаются преимущественно в составе суперкапсида или капсида вириона. Для вакцинации используются живые, убитые микроорганизмы, их структурные компоненты и вторичные метаболиты в качестве чужеродных антигенов, способных вызвать специфический иммунитет в организме. В первую очередь очень важны такие свойства микробных белков, жиров, углеводов и их комплексов в качестве вакцин как эффективность (антигенность и иммуногенность) и безвредность для человека. Общеизвестна классификация, подразделяющая вакцины на: живые, убитые, химические и анатоксины. Столь же актуально классифицировать вакцины на: субъединичные, генно-инженер- ные, синтетические, съедобные, терапевтические, противоопухолевые, ДНК-вакцины; а также форсифицированные и комбинированные. Живые вакцины получают путём ослабления (аттенуации) вирулентности, с сохранением антигенной стуруктуры и иммуногенности потенциально патогенных микроорганизмов (чумная палочка, бруцеллы, возбудитель туляремии). Аттенуируются штаммы физическим (изменение температурного режима, осмотического градиента, воздействием УФЛ и др.) и химическим (низкие концентрации антибиотиков, желчи, красителей и др.) способами, пассажем на невосприимчивых животных; курином эмбрионе и культуре тканевых клеток в случае вирусов. Вакцинный штамм, после введения, размножается в организме привитого и вызывает вакцинальный инфекционный процесс. У большинства привитых вакцинальная инфекция протекает без клинических симптомов и приводит к формированию, как правило, стойкого иммунитета. Примером живых вакцин могут служить вакцины для профилактики краснухи (Рудивакс), кори (Рувакс), полиомиелита (Полно Сэбин Веро), паротита (Имовакс Орейон). Живые вакцины выпускаются в лиофилизированном виде (кроме полиомиелитной). На фоне преимуществ живых вакцин имеется и одно предостережение, а именно: возможность реверсии вирулентных форм, что может стать причиной заболевания вакцинируемого. По этой причине живые вакцины должны быть тщательно протестированы. Пациенты с иммунодефицитами (получающие иммуносупрессивную терапию, при СПИДе и опухолях) не должны получать такие вакцины. Эффективность живых вакцин определяется в конечном счете способностью аттенуированного микроорганизма размножаться в организме привитого, воспроизводя иммунологически активные компоненты непосредственно в тканях. Живые вакцины наиболее иммуногенны, но есть трудности в стандартизации и особые требования к транспортировке и условиям длительного хранения. Инактивированные вакцины получают способами физической и химической инактивации высокопатогенных штаммов полноценных в отношении вирулентности и антигенной структуры (так возбудители коклюша инактивируются формалином, лептоспиры — высокой температурой, холерный вибрион - формалином). Такие вакцины являются достаточно стабильными и безопасными. При использовании убитых вакцин иммунизирующий эффект зависит от количества иммуногена, вводимого в составе препарата, поэтому с целью создания более полноценных иммуногенных стимулов приходится прибегать к концентрации и очистке микробных клеток или вирусных частиц. С целью усиления иммунного ответа нередко требуется применение нескольких доз (бустерная иммунизация). В целом инактивированные вакцины достаточно иммуногенны, менее реактогенны чем живые, легко стандартизируются, их проще хранить, транспортировать. Иммунизирующую способность инактивированных и всех других нереплицирующихся вакцин удается повысить путем: - сорбции иммуногена на крупномолекулярных химически инертных полимерах; - добавления адъювантов, стимулирующих иммунные реакции организма; - заключения иммуногена в мельчайшие капсулы, которые медленно рассасываются, способствуя депонированию вакцины в месте введения и пролонгированию действия иммуногенных стимулов. Химические вакцины состоят из компонентов клеток микроорганизмов, включающих протективные антигены, способные обеспечить адекватный иммунный ответ. Чаще это макромолекулярные глико- или липопротеиды микробных клеток, т.е. основные антигены, которые определяют иммуногенные характеристики микроорганизма. Примерами химических вакцин, в которых используются фрагменты микроорганизмов, являются вакцины против Streptococcus pneumoniae, против менингококка типа А, брюшнотифозная спиртовая вакцина, содержащая Vi - антиген возбудителя, полисахаридные вакцины (Менинго А+С, Акт-ХИБ, Пневмо 23, Тифим Ви), ацеллюлярные коклюшные вакцины и др. Такие вакцины стандартны, у них низкая реактогенность, но и слабая иммуногенность. Анатоксины получают путём выделения, очистки и инактивации вторичного метаболита микроорганизмов - экзотоксина. Эти препараты представляют собой бактериальные токсины, обезвреженные воздействием формалина при повышенной температуре с последующей очисткой и концентрацией. Анатоксины сорбируют на различных минеральных адсорбентах, например на гидроокиси алюминия. Адсорбция значительно повышает иммуногенную активность анатоксинов. Это связано как с созданием «депо» препарата в месте введения, так с адъювантным действием сорбента, вызывающего местное воспаление, усиление плазмоцитарной реакции в регионарных лимфатических узлах. Анатоксины характеризуются достаточной иммуногеностью и специфичностью, создают прочный, активный, приобретённый иммунитет. Технология получения анатоксина из дифтерийного экзотоксина разработана в 1922 году Г.Рамоном. Возбудитель дифтерии Corynebacterium diphtheriae культивирован на жидкой питательной среде, затем из культурной жидкости выделен и очищен дифтерийный экзотоксин и инактивирован 0,3-0,4% раствором формалина в нейтральной среде при 37°С в течение 1 месяца. Инактивированный токсин с сохранённой антигенной структурой и иммуногенностью - анатоксин адсорбирован на гидрате окиси алюминия (адъювант). Таким же способом получают столбнячный, стафилококковый, ботулинический и другие анатоксины. Генно-инженерные вакцины, полученные технологией рекомбинантной ДНК и содержащие продукты экспрессии отдельных генов микроорганизма, наработанные в специальных клеточных системах (протективные антигены различных возбудителей, синтезируются в дрожжевых клетках или в кишечной палочке). Особую группу генетических вакцин составляют ДНК-вакцины, которые могут использоваться не только в профилактических, но и в терапевтических целях для лечения некоторых аутоиммунных заболеваний, аллергических состояний, злокачественных новообразований. Столь же актуально получение съедобных вакцин. При разработке рекомбинантной вакцины против гепатита В, гены вируса, кодирующие синтез поверхностного неинфекционного антигена - HesAg встраиваются в вектор на основе плазмиды. Далее этот вектор трансфицируется в дрожжевые клетки (Saccharomyces cerevisiae). Модифицированная дрожжевая клетка начинает синтезировать HB,Ag. Последний выделяется из культуральной среды, очищается. Полученная таким образом рекомбинантная вакцина содержит около 95% HB,Ag и до 5% дрожжевого белка, но в нем полностью отсутствует ДНК дрожжевой клетки. Вакцинный антиген адсорбируется гидроксидом алюминия. ДНК-вакцины представляют собой генетические структуры или фрагменты ДНК, выделенные из клеток патогенных микроорганизмов, опухолевых клеток и др.; они ответственны за синтез протективных антигенов микроорганизмов, опухолъассоцинрованных антигенов и др., вызывающих в организме иммунный ответ. Такие генетические структуры при помощи плазмидных либо вирусных векторов трансфицируются в клетки человеческого организма, экспрессируются и синтезируют опухолеспецифические, микробные и др. белки (протективные антигены), вызывающие иммунный ответ либо активирующие защитные силы организма при той или иной патологии. Съедобные вакцины. Съедобные или мукозные вакцины впервые получены Мэйсон в 1992 году путем клонирования гена, детерминирующего HBtAg вируса гепатита В в клетках табака. Трансгенный табак при росте продуцирует наряду с растительными белками и НВ Ag. В последующих разработках гены, кодирующие HBАg были экспрессированы в геном картофеля, кукурузы и других растений. В настоящее время интенсивно разрабатываются технологии получения съедобных вакцин на основе трансгенных растений, чьи плоды, листья и семена годятся в пищу без термообработки (томаты, бананы, салатные листья и др). В случае успеха отпадает потребность в дорогостоящей очистке антигенов, которая необходима при создании вакцин для парентерального введения. Антигены, экспрессируемые в растениях, защищены растительными клеточными стенками от протеолиза при прохождении пищеварительного тракта и могут быть легко доставлены к клеткам слизистой оболочки кишечника, ответственным за мукозную систему иммунитета. Интенсивно разрабатываются методы усиления экспрессии целевых генов в трансгенных растениях, так как съедобные вакцины, как и в целом генно-инженерные вакцины характеризуются недостаточной иммуногенностью (табл. 18). Синтетические вакцины, где в качестве иммуногена используется химический аналог протективного белка, полученный методом химического синтеза. Вакцины представляют собой синтезированные из аминокислот пептидные фрагменты, которые соответствуют по аминокислотной последовательности темструктурам микробного белка, которые вызывают иммунный ответ. Важным преимуществом син тетических вакцин по сравнению с традиционными является то, что они не содержат микроорганизмов, продуктов их жизнедеятельности, достаточно иммуногены, не столь требовательны к условиям хранения. При создании данного типа вакцин можно комбинировать несколько разных пептидов, несущих антигенные детерминанты патогенных микроорганизмов, есть возможность выбирать наиболее иммуногенные синтетические пептиды для их коплексирования с носителем. Вместе с тем, синтетические вакцины менее эффективны, по сравнению с традиционными, они менее иммуногенны, нежели антигены нативного микроба. Однако, использование одного или двух иммуногенных белков вместо целого возбудителя обеспечивает формирование иммунитета при значительном снижении реактогенности вакцины и ее побочного действия. Примером может служить экспериментальная вакцина против гепатита В (Эувакс В). Комбинированные (ассоциированные) вакцины содержат в своем составе протективные антигены нескольких групп микроорганизмов (бактериальные и вирусные антигены, анатоксины), конъюгированных с адъювантами. Например, биопрепарат ≪Инфарникс Гекса≫ — это комбинированная вакцина для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша (ацеллюлярный компонент), гепатита В, полиомиелита и заболевания, возбудителем которого является Haemophilus influenzae типа b. Содержит дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, 3 очищенных коклюшных антигена (коклюшный анатоксин (РТ), нитчатый гемагглютинин (FNA) и пернактин (PRN; белок наружной мембраны весом 69 кДа), очищенный поверхностный антиген (HBsAg) вируса гепатита В (HBV) и очищенный полирибозил-рибитол-фосфатный капсульный полисахарид (PRP) Haemophilus influenzae типа b (Hib), ковалентно связанный со столбнячным анатоксином, адсорбированные на солях алюминия. Вакцина также содержит инактивированные вирусы полиомиелита 3 типов (IPV). К комбинированным вакцинам относятся препараты: ≪АКДС-Геп В≫ (вакцина против коклюша, дифтерии, столбняка и гепатита В адсорбированная жидкая), ≪Пентаксим≫ (вакцина для профилактики дифтерии и столбняка адсорбированная, коклюша ацеллюлярная, полиомиелита инактивированная, инфекции, вызываемой Haemophilus influenzae тип Ь, конъюгированная), ≪Приорикс≫ (вакцина против кори, паротита и краснухи, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций) и др. Форсифицированные вакцины. К этим препаратам относят вакцины нового поколения, полученные путем химического ковалентного связывания (конъюгация) иммуномодуляторов с микробными антигенами, входящими в состав вакцин. Использование иммуномодулирующих препаратов в вакцинопрофилактике, в первую очередь, диктуется необходимостью уменьшения дозы вводимого антигена. В качестве иммуномодуляторов используются некоторые синтетические полиэлектролиты, природные соединения и др. Эффект стимуляции антителогенеза полиэлектролитами связан с их способностью сорбироваться на клеточной мембране и прямо активировать деление и антигенезависимую дифференцировку В-лимфоцитов. Примером применения в составе вакцины природного иммуномодулятора является конъюгированная полимер-субъединичная гриппозная вакцина ≪Гриппол≫, в которой присутствие иммуномодулятора полиоксидония позволяет в 3 раза снизить прививочную дозу микробных антигенов. Полиоксидоний, как и ликопид, миелопид (МП-3) относятся к препаратам, оказывающим преимущественное воздействие на клетки макрофагальномоноцитарной системы. К иммуномодуляторам, воздействующим на Т-систему иммунитета, относятся препараты, полученные из тимуса крупного рогатого скота. Это хорошо известный Т-активин и иммунофан, которые используются в качестве форсификаторов вакцинального процесса. Разработаны форсифицированные брюшнотифозная вакцина на основе Vi- и О-антигенов, вакцина против гепатита А и В (≪ГЕП-А+В-ин-Вак≫) и бесклеточная коклюшная вакцина(форсификатор - полиоксидоний); поликомпонентная вакцина ВП-4 против условно-патогенных микробов (форсификатор - мультиплетные пептиды). Перспективным может также оказаться совместное применение вакцинных препаратов и иммунотропных лекарственных средств, восстанавливающих реакции иммунитета, в том числе и способность к продукции антител. Метод форсифицированной вакцинации можно считать актуальным, так как он открывает перспективы совершенствования вакцин в решении важного вопроса формирования протективного иммунитета, особенно при иммунодефицитных состояниях. Конъюгированные вакцины. Некоторые бактерии, вызывающие такие опасные заболевания, как менингиты или пневмонию (гемофилюс инфлюэнце, пневмококки), имеют антигены, трудно распознаваемые незрелой иммунной системой новорожденных и грудных детей. В конъюгированных вакцинах используется принцип связывания таких антигенов с протеинами или анатоксинами другого типа микроорганизмов, хорошо распознаваемых иммунной системой ребенка. Протективный иммунитет вырабатывается против конъюгированных антигенов. Терапевтические вакцины. Применение инактивированных вакцин с лечебной целью, с целью стимуляции иммунного ответа известно при хронической гонорее, хронической стафилококковой инфекции и других хронических инфекционных заболеваниях. В настоящее время спектр применения терапевтических (лечебных) вакцин нацелен не только на хронические заболевания, вызванные бактериями или вирусами (в частности, вирусами гепатитов В и С, вирусом папилломы, ВИЧ), но и на опухоли (прежде всего, меланому, рак молочной железы или прямой кишки), аллергические или аутоиммунные болезни (рассеянный склероз, диабет I типа, ревматоидный артрит). Противоопухолевые вакцины относятся к группе терапевтических вакцин. Они разрабатываются на основе аллогенных и аутологичных опухолевых клеток, несущих различные иммуно-генные детерминанты, усиливающие противоопухолевый иммунитет. Механизм действия противоопухолевых вакцин в общем сходен с таковым у вакцин, применяемых для профилактики инфекций, и в основе его лежит формирование специфического иммунного ответа на антиген. Основное отличие противоопухолевых вакцин состоит в том, что их использование с целью профилактики ограничено из-за различной вариации, нестабильности антигенной специфичности опухолей. Поэтому учитывая близость опухолевых антигенов к антигенам здоровых тканей организма и их слабую иммуногенность, вакцинотерапия опухолей чаще проводится с целью реабилитации в послеоперационном периоде для профилактики рецедивов и метастазирования. Компоненты, усиливающие иммуногенность вакцин Адъювант Фрейнда создан на основе минерального масла, сурфактанта и микобактерий. Его эффект основан на создании “депо”, в котором антиген сохраняется длительное время в высокой концентрации; более длительно стимулируется продукция антигенспецифических лимфоцитов к данному антигену у большинства иммунизированных больных. По этому принципу создано несколько адъювантов с различным соотношением водной и масляной фазы с разными сурфактантами и комбинациями масел Основная цель таких модификаций - добиться максимальной специфичности иммунного ответа на совместно введенный антиген с минимальными побочными эффектами (прежде всего воспалительными). Так, на основе минерального масла создан коммерческий адъювант Montanide (Seppic, France), который относится к группе адъювантов на основе масла и сурфактанта и используется в виде водно-масляных эмульсий. Гидроокись или фосфат алюминия — нерастворимые соли алюминия, усиливающие действие вакцины. Этот адъювант используется в составе противоинфекционных вакцин уже более 70 лет. Гидроокись алюминия образует гелевый матрикс, который увеличивает время нахождения антигена в месте введения, тем самым повышая его иммуногенность (эффект ≪депо≫). Кроме того, адъювантные свойства связываются с абсорбцией протеина наоснове разницы электрического заряда. Поэтому в отношении разных белков его свойства очень различаются в зависимости от их электрического потенциала. Позже in vitro было показано, что этот адъювант повышает на моноцитах периферической крови экспрессию HLA-антигенов II класса, молекул В7-2 (CD86) и CD83, которые являются маркерами зрелости дендритных клеток. Также повышается экспрессия молекул адгезии ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58), CD40 и продукция IL-4. В онкологии гидроокись алюминия применяется для создания противоопухолевых вакцин на основе антиидиотипических антител, имитирующих антигены меланомы, рака молочной железы, колоректальной карциномы. В общем адъюванты на основе солей алюминия более слабые по сравнению с другими адъювантами, однако и побочные воспалительные реакции у них незначительны. Они применяются при производстве цельновирионных вакцин (АКДС, при клещевом энцефалите, БЦЖ, брюшно-тифозная вакцина). Для субъединичных вакцин гидроксид алюминия является слабым адъювантом. CpG-олигонуклеотиды. Бактериальная ДНК содержит неметилированные CpG-динуклеотиды, которые гораздо реже встречаются в ДНК человека. Они действуют как сигналы опасности для клеток иммунной системы позвоночных и активируют врожденный и приобретенный иммунный ответ. Некоторые клетки иммунной системы имеют рецепторы (TLR9), способные связываться с CpG-последовательностями и, таким образом запускать целый каскад сигналов, которые в конечном итоге приводят к активации врожденного и приобретенного иммунного ответа. Такие иммуностимулирующие свойства CpG-олигонуклеотидов определяют возможность их использования для иммунотерапии опухолей. CpG — содержащие олигодезоксинуклеотиды, обладают существенно большей иммуногенной активностью по сравнению с адъювантом Фрейнда и применяются как самостоятельно, так и в комбинации с другими адъювантами. Разрабатываются синтетические олигодеоксинуклеотиды, содержащие CpG-последовательности, иммуностимулирующая активность которых подобна бактериальным. Иные компоненты в составе вакцины, кроме основного действующего начала: сорбент, консервант, стабилизатор и неспецифические примеси. К неспецифическим примесям могут быть отнесены белки питательного субстрата для культивирования вирусных вакцин, следовое количество антибиотика и белка сыворотки животных, вносимые в ряде случаев в среду культивирования (следовым называется количество вещества, неопределяемое современными методиками). Консерванты обеспечивают стерильность препаратов в тех случаях, когда возникают условия для бактериальной контаминации (появление на ампулах микротрещин при транспортировке; хранение вскрытой ампулы, флакона). Такие консерванты как мертиолят (1:10000), азид натрия, формальдегид (0,1-0,3%), феноксиэтанол, фенол и антибиотики (неомицин, гентамицин, полимиксин) подавляют постороннюю микрофлору в процессе хранения. Что касается веществ, используемых в качестве стабилизаторов, то в производстве вакцин используются те из них, которые безвредны для человеческого организма. Это сахароза, желатин, декстран, сорбит и альбумин; они способствуют длительному сохранению антигенной структуры и иммуногенности вакцин. В качестве индикатора pH часто используют метиловый красный. Можно сразу обнаружить ≪сдвиг≫ показателя кислотности по изменению цвета препарата и забраковать вакцину. |