антибиотики микробиология. микра антибиотики. Метод бумажных дисков на питательном агаре

• Название: Метод бумажных дисков на питательном агаре
• Анкор: антибиотики микробиология
• Дата: 03.05.2022
• Размер: 18.59 Kb.
• Имя файла: микра антибиотики.docx
• Тип: Документы; #509852

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

1. 
   Метод бумажных дисков на питательном агаре. Антибиотики из дисков диффундируют в агар. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры судят о ее чувствительности к антибиотикам. Этот метод нельзя применять, если антибиотики плохо диффундируют в агар. Преимущество метода – можно определить чувствительность исследуемой бактериальной культуры сразу к нескольким антибиотикам.
   
2. 
   Метод серийных разведений в МПБ. Обычно берут 12 пробирок по 1 мл МПБ в пробирке. После последовательных разведений антибиотика в МПБ, в каждую пробирку добавляют 0,1 мл взвеси клеток испытуемой бактериальной культуры, содержащей 106-107 клеток. Посевы инкубируют в термостате 18-24 ч. Результаты отмечают по наличию роста. Если есть рост бактерий – среда мутная. Если нет роста бактерий – среда прозрачная. Если среда в пробирке мутная, то в данной концентрации антибиотик не действует, если прозрачная– антибиотик действует. По последней пробирке с прозрачной средой определяют минимальную ингибирующую дозу антибиотика. Одновременно ставят контрольные пробы: 1-ый контроль (контроль бактериальной культуры) - 1 мл МПБ + взвесь бактерий без антибиотика, 2-ой контроль (контроль антибиотика) - 1 мл МПБ + антибиотик, но без взвеси бактерий. В контрольных пробирках должны быть следующие результаты: 1-ый контроль – помутнение среды (есть рост); 2-ой контроль – среда прозрачная (нет роста). Для того, чтобы узнать какое действие оказал антибиотик (бактерицидное или бактериостатическое), петлей делают посевы из пробирок на сектора ПА. Роста нет – бактерицидное действие, рост есть – бактериостатическое действие. Преимущество метода – определение минимальной концентрации антибиотика, которая ингибирует (подавляет) рост бактериальной культуры.
   
3. 
   Метод «канавки» (предложен А. Флемингом). Берут чашку Петри с питательным агаром. В центре по диаметру вырезают полоску агара шириной 1 см. Затем канавку заполняют агаром, смешанным с антибиотиком. После застывания канавки перпендикулярно делают посев исследуемых культур (4-5). После инкубации в термостате чувствительность определяют по длине зоны задержки роста, чем она больше, тем культура чувствительнее и наоборот. Преимущество метода – можно определить чувствительность сразу нескольких культур к данному антибиотику.
   
4. 
   Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскла­дывают диски с антибиотиками («метод дис­ков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). Метод дисков — качес­твенныйи позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.
   
   
5. 
   Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, кото­рый позволяет invitroпредотвратить видимый рост микробов в питательной среде или пол­ностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиоти­ка в крови должна быть значительно выше ми­нимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования ус­тойчивых микробов.
   Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов.
   
   
6. 
   Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.
   Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с ин­струкцией.
   На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинако­вом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чув­ствительности к антибиотикам.
   Для получения достоверных результатов необходимо приме­нять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувстви­тельность микроорганизмов методом серийных разведений.
   
   

7. 
   Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в буль­оне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добав­ляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10⁶—10⁷ бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питатель­ной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя про­бирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий, под влиянием содержа­щейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.
   Оценку результатов определения чувствительности микро­организмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штам­мов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.
   К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаружи­ваемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков.  К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, созда­ющиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата. Устойчивыми являются микроорганизмы, рост кото­рых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.
   
   
8. 
   Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда проби­рок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом — исследуемой жидкости.  Затем  в  каждую  пробирку вносят   взвесь   тест-бактерий,   приготовленную   в   среде   Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина,   тетрациклинов,   эритромицина   в   качестве  тест-бактерий используют  стандартный  штамм   S. aureus,  а  при  определении стрептомицина — Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы   тест-бактериями.   Концентрация   антибиотика   опреде­ляется умножением наибольшего разведения исследуемой жид­кости,   задерживающей   рост   тест-бактерий,   на   минимальную концентрацию   эталонного   антибиотика,   задерживающего   рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, рав­но  1:1024,  а   минимальная  концентрация  эталонного  антибио­тика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение   1024х0,313=320 мкг/мл  составляет  концен­трацию антибиотика в 1 мл.
    
   
9. 
   Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандарт­ного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питатель­ного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды поме­щают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лактамазу судят по наличию роста стандартного штамма стафило­кокка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска).