Методы получения химерных организмов получение трансгенных животных
- Одним из перспективных направлений микроманипуляций на ранних эмбрионах является искусственное получение химер, или генетических мозаиков.
- Понятие химера (греч.Chimaira) означает составное животное. Сущность биотехнологического метода получения химер заключается в искусственном объединении с помощью микрохирургических манипуляций эмбриональных клеток двух (и более) животных, относящихся к разным породам и даже видам. Таким образом, животные – химеры несут в одном организме признаки обоих эмбрионов, отличающихся между собой разными генотипами
- Агрегационный метод- был предложен практически одновременно и независимо друг от друга Тарковским в Варшаве и Минц в Филадельфии (1961-1962 гг.).
- Из матки беременных самок-докторов извлекают зародыши, достигшие стадии 8 бластомеров. Бластомеры, полученные от двух животных с различными генотипами (например, от мышей с белой черной окраской шерсти) помещают в условия, способствующие их агрегации и образованию 16-ти клеточного зародыша. Такие составные зародыши развиваются in vitro до стадии бластоцисты, после чего их вводят в матку приемной матери, у которой предварительно вызывают ложную беременность путем введения соответствующих гормонов. В результате получаются аллофенные мышата. Когда у мышонка появляется шерсть, окраска у него оказывается не белой или черной, как у родителей, а смешанной, с чередующимися черными и белыми пятнами или полосами. Это доказывает, что ткани животных-химер мозаичны, т.е. состоят из "белых" и "черных" клеток.
- Внутренние ткани таких животных, естественно, также мозаичны, хотя это проявляется не так очевидно, как в случае окраски шерсти. Различия могут касаться белков, выполняющих ферментативную функцию: они могут катализировать одни и те же реакции у мышей-родителей, нуждаться в одних и тех же кофакторах, но при этом быть не идентичными, хотя и сходными. Такие белки называются изоферментами, и их можно разделить с помощью электрофореза. Агрегационные химеры можно получать не только между двумя эмбрионами, но и между различным числом изолированных бластомеров или отдельными частями эмбрионов. Масса химерных эмбрионов не больше обычной и подвержена действию механизмов эмбриональной регуляции. Преимущество метода - не требует вмешательства микрохирургической техники, поэтому широко используется в эмбриогенетике.
- Инъекционный метод - был разработан Р. Гарднером в 1968 г.
- Используются эмбрионы на стадии бластоцисты. Бластоцисту фиксируют и, используя микроманипуляторы, вводят путем инъекции клетки внутриклеточной массы бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона - рецепиента. Этим методом можно инъецировать не только внутриклеточную массу ранних эмбрионов, но и более дифференцированные клетки.
- Инъекционный метод нашел применение при получении межвидовых химер. Первые межвидовые химеры были получены между двумя ближайшими видами мышей, которые обычно не скрещиваются: M. muskulus и M. caroli. Причем было отмечено, что химерные эмбрионы, полученные инъекционным методом, нормально развивались только при пересадке их в матку того вида, чья бластоциста была использована в качестве рецепиента. Например, в бластоцисту M. muskulus вводили внутриклеточную массу эмбриона M. caroli. Полученные химеры имплантировались в матку M. muskulus и благополучно развивались там, а в организме M. caroli погибали спустя две недели.
- Трансгенные животные - это индивидуумы, в геном которых искусственно введена дополнительная генетическая информация (трансген). Такая информация представляет собой либо отдельный участок ДНК с собственными (гомологичными) регуляторными последовательностями (эукариотическая транскрипционная единица), либо сконструированный из различных молекул ДНК гибридный (рекомбинантный) ген. Таким образом, трансген - это искусственно введенный и интегрировавшейся в ДНК животных чужеродный ген. Под трансгенезом понимают процесс переноса и интеграции чужеродной генетической информации в геном животных.
- Метод микроинъекции - первой и наиболее хорошо разработанной экспериментальной системой для получения трансгенных животных явилась мышь. Донорных самок мышей с экспериментальной суперовуляцией скрещивают с самцами-производителями, через 12 ч выделяют оплодотворенные яйцеклетки и помещают их в культуру. Далее в больший их двух пронуклеусов (обычно мужской) инъецируют рекомбинантную ДНК. Пережившие инъекцию яйцеклетки пересаживают самкам-реципиентам. Только часть трансплантированных ооцитов продолжает развиваться до рождения детенышей.
- Использование ретровирусных векторов:
- Ретровирусы – семейство эукариотических вирусов, генетический материал которых представлен одноцепочечной РНК.
- Восьмиклеточную морулу (рис. 2.18) освобождают от яйцевой оболочки и помещают в культуральную чашку с фибробластами, продуцирующими рекомбинантный ретровирус. Инфицированные эмбрионы, достигшие стадии бластулы, имплантируют псевдобеременным самкам. В результате формируются трансгенные организмы, мозаичные по числу и локализации встроек рекомбинантной ДНК в геном. Поэтому для получения чистых линий далее необходим масштабный аутбридинг.
- Введение ДНК в стволовые клетки:
- Модифицированные эмбриональные стволовые клетки могут быть использованы для получения трансгенных животных. Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (ES). В ES-клетки в культуре можно ввести целевой трансген различными методами (трансфекция, электропорация, ретровирусная инфекция и т.д.) без нарушения их плюрипотентности. Практическое достоинство этой схемы заключается в том, что она дает большие возможности для проведения селекции клеток по определенному параметру. Это может быть число копий трансгена, его локализация или характер экспрессии
Направления создания трансгенных животных
1) Источники для производства фармацевтических препаратов: Фармацевтические препараты, получаемые из культур животных клеток, зачастую имеют высокую стоимость. Один из путей преодоления этой проблемы – получение трансгенных животных, несущих человеческие гены.
- Самая мощная белоксинтезирующая система находится в клетках молочной железы:
- «Фарминг» (pharming) - процесс получения из молока трансгенных домашних животных белков человека или фармацевтических препаратов.
- Первый фармацевтический препарат из молока трансгенных животных (коза) - антитромбин III. В 2006 г. зарегистрирован как лекарство в Европейском союзе.
- Получены трансгенные куры, которые
- 1)продуцируют антитела против меланомы (рака кожи) в яичном белке;
- 2)производят человеческий интерферон.
- 2)Трансгенные животные, служащие источником пищи:
- В геном свиней перенесены гены, ускоряющие рост животных.
- Получен трансгенный лосось со встроенным геном гормона роста.
- Получены трансгенные коровы с повышенным содержанием казеина в молоке (важно для сыроваренного производства)
- Ведутся работы по получению трансгенных коров со минимальным содержанием лактозы в молоке (безлактозное молоко)
- 3) Трансгенные животные как источники трансплантантов для человека:
- Выведение генетически модифицированных свиней, органы которых могут использованы для трансплантации.
- Задачи:
- 1) преодоление иммунологических барьеров (гистосовметимость);
- 2) недопущение переноса патогенов от донорного животного к человеку;
- 3) анатомическая и физиологическая совместимость донорного органа с человеческим.
- Первые эксперименты- пересадка свиных трансгенных почек и сердца нечеловекообразным обезьянам (павианы)
- 4) Модельные системы для изучения болезней человека
- В настоящее время на мышах смоделированы такие заболевания человека, как СПИД, болезнь Альцгеймера, артрит, мышечная дистрофия, гипертония, образование опухолей, нейродегенеративны нарушения, дисфункция эндокринной системы, сердечно-сосудистые заболевания и многие другие.
- Получена дрозофила с болезнью Паркинсона
Под торговой маркой GloFish в США продаются разноцветные рыбки-зебры Danio rerio, окрашенные флуоресцентными белками кораллов. При соответствующем освещении красные, зеленые и желтые рыбки начинают ярко флуоресцировать, хотя природная окраска D. rerio скромного серого цвета. При наличии в воде определенных токсических веществ светящиеся данио меняют окраску, становясь, таким образом, живым индикатором загрязнений. - 5) Трансгенные домашние любимцы
- Декоративные рыбки – пример успешной коммерциализации трансгенных животных
 |
Скачать 1.97 Mb.