Методические указания по молекулярной генетике указания обобщают современные данные в области молекулярной генетики, включая достижения науки последних лет, которые закладывают фундамент знаний, необходимых для дальнейшего обучения
 Скачать 273.42 Kb.
|
|
• включение этих генов в автономно реплицирующуюся генетическую структуру (векторную молекулу) и создание рекомбинантной молекулы ДНК; • введение векторной молекулы (с включенным в нее геном) в клетку-реципиент, где она встраивается в хромосомный аппарат. Экспериментальный перенос генов в другой геном называется ТРАНСГЕНЕЗОМ. В настоящее время раскрыта тонкая структура гена. Известно, что ген содержит информацию на первичную структуру одного полипептида. Число кодонов в гене не может быть меньше числа аминокислот в белке. Средний размер гена 1000-1200 нуклеотидов. Существуют разные подходы выявления последовательности нуклеотидов в гене. Принципиально возможно познание структуры гена путем изучения последовательности аминокислот в белке. Но это длинный путь, если учесть, что одна и та же аминокислота может кодироваться несколькими триплетами. Другой подход более реальный: путем анализа последовательностей нуклеотидов в информационных РНК, которые какое-то время существуют в цитоплазме и могут быть выделены. Гены для пересадки могут быть либо искусственно синтезированы, либо выделены из ДНК прокариот и хромосом эукариот. В настоящее время выделение высокомолекулярной ДНК проводят на ультрацентрифугах в градиенте плотности хлористого цезия. Известно два пути искусственного синтеза гена: химический и ферментативный. Для ХИМИЧЕСКОГО СИНТЕЗА необходимо иметь полностью расшифрованную последовательность нуклеотидов. Впервые в 1970 году индийским ученым Корана Г. (США) был осуществлен искусственный синтез гена. Он синтезировал последовательность нуклеотидов в ДНК, специфическую для структуры гена транспортной аланиновой РНК в клетках пекарских дрожжей. Более двух лет затратили на этот синтез гена. Последовательность нуклеотидов в нити ДНК определялась по информационной РНК. Но этот ген был не способен работать in vitro. Причиной являлся синтез только структурной части гена, в нем не было регуляторных участков. Для транскрипции необходимо, чтобы фермент РНК-полимераза "узнавала" место промотора, где локализована точка инициации синтеза, и в этом месте "садилась" на матрицу. В 1976 г, в той же лаборатории был синтезирован ген тирозиновой тРНК бактерии 18 кишечной палочки, состоящий не только из структурного участка (126 нуклеотидных пар), но и регуляторных частей - промотора и терминатора. Этот искусственно созданный по специальной программе ген был выведен в бактериальную клетку и функционировал как природный. Другим примером химического синтеза гена является синтез гена, кодирующего фермент, расщепляющий лактозу. Синтезированный ген в пробирке был встроен в плазмиду и введен в бактерию; кишечная палочка приобрела способность усваивать лактозу. Однако, химическим путем можно синтезировать небольшие по размеру гены прокариот, синтез сложных генов эукариот, состоящих из тысячи и более нуклеотидов, путем химического синтеза пока создать не удается. Кроме того, химический синтез очень трудоемкий и для генной инженерии в настоящее время практически не используется. Наиболее успешным оказался ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ гена. Центральная догма молекулярной генетики утверждает, что считка информации происходит в направлении: ДНКРНКбелок. Но ряд авторов, начиная с 1948 года, выступали с соображениями, что РНК может быть предшественником ДНК. Подобное наблюдается у онкогенных РНК - содержащих вирусов. С РНК-вируса, попавшего в клетку, синтезируется провирус (ДНК - копия РНК) с помощью фермента обратная транскриптаза (ревертаза), а сам процесс называется обратной транскрипцией. Этот фермент был открыт в 1970 году Теминым, Мазутани, Балтимором. Клонирование (размножение) кДНК по известной иРНК было разработано Г.Бойером, С.Коэном и П Бергом в 1973 году (рис. 1). На 1 этапе на основе иРНК по принципу комплементарности синтезируют односпиральную кДНК. На 2-3 этапах удаляют иРНК и достраивают вторую часть кДНК. Деполимеризацию исходной РНК-цепочки осуществляют путем щелочного гидролиза. Цепи ДНК устойчивы к обработке щелочью, а РНК полностью деполимеризуется. Двуцепочечную кДНК получают путем достраивания одноцепочечной кДНК под действием фермента ДНК-полимеразы. После такой обработки кДНК можно встраивать в вектор. Такая кДНК не имеет вставок - интронов, т.е. схема ее строения в этом смысле не отличается от бактериального гена. Ген, полученный путем ферментативного синтеза, может функционировать в бактериальной клетке, на нем синтезируется иРНК, а затем белок, таким путем под руководством академика В.А.Энгельгардта был получен ген, определяющей синтез фермента галактозидазы, введенный в фаг. При размножении фага в клетке получили множество копий, что обеспечило синтез большого количества фермента. Это имеет не только теоретическое, но и практическое значение, так как галактозидаза применяется в 19 пищевой промьшленности. Следовательно, если иметь в пробирке выделенные молекулы иРНК, принадлежащие данному гену, то он может быть синтезирован с помощью фермента. Матрицей служит иРНК, ее выделяют, добавляют нуклеотиды, затравку, ферменты. На основе этих данных в 1972-1973 гг. во многих лабораториях мира были синтезированы гены глобина человека, кролика, голубя, мыши, утки, гены митохондрии печени крыс и другие. Гены, синтезированные с помощью ревертазы, не имеют регулярной части и промотора. Отсутствие регуляторных участков препятствует функционированию этих искусственных генов в животных клетках. При переносе в микробную клетку к структурным генам присоединяют промотор, извлеченный из микробной клетки. Были синтезированы два гена, отвечающие за синтез цепей инсулина, введены в геном кишечной палочки, которая стала продуцировать инсулин. Важным достижением генной инженерии является синтез гена соматостатина, этот ген функционирует в микробной клетке. Таким же методом под руководством академика Ю.А.Овчинникова и Н.П.Дубинина осуществлен синтез генов, кодирующих нитрогормоны человека (лейцин-энкефалин и брадикинин). Ферментативный синтез гена имеет большие возможности: принципиально осуществимо проводить искусственный синтез любых индивидуальных генов путем транскрибирования их с соответствующих матричных РНК. Основным затруднением является синтез не структурных, а регуляторных генов, необходимых для их нормальной работы. Это в ряде случаев ограничивает использование искусственно синтезированных генов. Кроме этого, иРНК в клетках содержится в очень незначительном количестве и она обладает нестойкостью. В настоящее время получают рекомбинативные (гибридные) молекулы ДНК путем гибридизации in vitro фрагментов ДНК вирусного, бактериального и в меньшей степени эукариотного происхождения. Операции по получению рекомбннативных молекул состоят из нескольких этапов: 1 этап - выделение чужеродной ДНК для переноса в другую клетку. Это делают с помощью ферментов - РЕСТРИКТИРУЮЩИХ ЭНДОНУКЛЕАЗ (РЕСТРИКТАЗ). Эти ферменты являются обычной принадлежностью бактериальной клетки, образуя как бы естественную систему защиты от чужеродной генетической информации. Рестриктазы опознают чужеродные последовательности нуклеотидов, подвергают разрушению чужеродную ДНК, разрезая ее словно скальпелем на отдельные участки. Причем каждая рестриктаза может действовать только на определенную последовательность нуклеотидов, так называемые САЙТЫ-УЧАСТКИ ОПОЗНАНИЯ. В настоящее время известно более 200 рестриктаз, но наибольшее применение нашла 20 рестриктаза кишечной палочки (EcoR-1). Она разрезает в строго определенном месте: на равных расстояниях от центра сайта узнавания. Действие каждой рестриктазы специфично, т.е. фермент атакует определенные участки (сайты) в последовательностях нуклеотидов молекул ДНК. При разрыве ДНК образуются фрагменты с однонитчатыми участками на концах: один с последовательностью ААТТЦ, другой- ЦТТАА. Такие концы называют "липкими". Действительно, если оставить на время раствор фрагментов, полученных с помощью рестриктаз, эти фрагменты сливаются, восстанавливая прежнюю структуру. Между комплементарными основаниями образуются водородные связи, соединяющие А с Т, Т с А. 2 этап - сшивание (лигирование) чужеродной ДНК с векторной (направляющей) молекулой ДНК. ВЕКТОР - это нечто вроде молекулярного "такси", способного переносить чужую ДНК внутрь бактериальной клетки таким образом, чтобы она там могла реплицироваться. Существуют разные типы векторов: ПЛАЗМИДЫ, БАКТЕРИОФАГИ (фаг лямбда), ВИРУСЫ (обезьяний вирус SV40), способные переносить и постоянно поддерживать в реципиентах чужеродную генетическую информацию. ПЛАЗМИДЫ - это встречающиеся в клетках внехромосомные элементы, представляющие собой замкнутые кольцевые молекулы двуцепочечной ДНК. Они способны реплицироваться независимо от геномной ДНК бактерий. Крупные плазмиды могут содержать до 100 генов. Такие плазмиды часто несут генетическую информацию, которая позволяет им переходить из одной клетки в другую во время процесса конъюгации. В мелких плазмидах число генов может составлять всего около 10, и они неспособны переходить из клетки в клетку при конъюгации- Число генов в плазмиде непостоянно. Обмен генетической информацией с геномом клетки или с другими плазмидами происходит путем переноса определенных участков плазмидной ДНК, способных к перемещению (транспозиции), с одной молекулы ДНК на другую и называемых поэтому транспозонами. Часто плазмиды содержат гены, белковые продукты которых обеспечивают нечувствительность к тем или иным антибиотикам. Разные плазмиды содержат разные гены резистентности к антибактериальным препаратам. Большая часть таких препаратов - антибиотиков используется в качестве лекарств при лечении ряда заболеваний человека. Бактерия, имеющая разные плазмиды, приобретает устойчивость к различным антибиотикам, к солям тяжелых металлов. При действии определенного антибиотика на бактериальные клетки плазмиды, придающие устойчивость к нему, быстро распространяются среди бактерий, сохраняя им жизнь. Чтобы включить кДНК в плазмиду, замкнутое кольцо плазмиды надо "разомкнуть". Для этого плазмиды 21 подвергают воздействию рестриктаз. Самым простым вектором можно считать плазмиду кишечной палочки, относящуюся к группе колициногенных факторов, детерминирующих у кишечной палочки синтез антибиотика колимицина. Из кольцевой плазмида превращается в линейную структуру, в которой имеются "липкие" концы по отношению к фрагментам чужеродной ДНК. Липкие концы должны иметь комплементарные основания, они соединяются водородными связями независимо от структуры и происхождения ДНК. Затем с помощью ферментов - лигаз образуется плазмида, которая называется рекомбинантной (с включенным участком чужеродной ДНК). Описанная процедура, в ходе которой чужеродная ДНК встраивается между двумя концами плазмидной ДНК с помощью фермента, называемого ДНК-лигазой, достигается методом ГОМОПОЛИМЕРНЫХ КОНЦОВ (рис. 3). Метод гомополимерных концов основан на присоединении к 3' - концам цепей, образующих двуцепочечную ДНК, коротких отрезков одноцепочечной ДНК с регулярной последовательностью (гомополимерных). Если каждый подобный гомополимер состоит из нуклеотидов одного вида и если два таких гомополимера с взаимно комплементарными основаниями присоединены соответственно к плазмиде и к ДНК, то последние, оказавшись рядом, замкнутся друг на друга с образованием рекомбинантной плазмиды. Как происходит внедрение гибридной молекулы в бактериальную или животную клетку? Способ введения зависит от вектора. Для бактерий - это ТРАНСФОРМАЦИЯ. В случае использования фагов и вирусов перенос генетического материала осуществляется посредством ТРАНСДУКЦИИ. ТРАНСФОРМАЦИЯ - введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, обработанные специальным образом, так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Трансформированные бактерии вместе с плазмидой приобретают устойчивость к определенному антибиотику. Это позволяет их отделить от нетрансформированных бактерий, погибающих на среде, содержащей этот антибиотик. Для этого бактерии высевают на студнеобразную питательную среду, предварительно разведя их так, чтобы при рассеве клетки находились на значительном расстоянии друг от друга. Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков - клон. СКРИНИНГ - отбор среди клонов трансформированных бактерий тех которые содержат плазмиды, несущие нужный ген человека. Для этого все бактериальные колонии накрывают специальным фильтром. Когда его снимают, на нем остается отпечаток колоний, так как часть клеток из каждого клона прилипает к фильтру. Затем проводят 22 молекулярную гибридизацию. Фильтры погружают раствор с радиоактивно меченным зондом. Зонд - это полинуклеотид, комплементарный части искомого гена. Он гибридизуется лишь с те рекомбинантными плазмидами, которые содержат нужный ген. После гибридизации на фильтр в темноте накладывают рентгеновскую фотопленку через несколько часов ее проявляют. Положение засвеченных участков на пленке, образовавшихся из-за радиоактивной метки зонда, позволяет найти среди множества клонов трансформированных бактерий те, которые имеют плазмиды с нужным геном. С помощью клонирования можно получить более миллиона копий любого фрагмента ДНК человека или другого высшего организма. Это позволяет изучить первичную структуру клонированного фрагмента, что приближает нас пониманию организации структуры хромосомы. Если клонированный фрагмент кодирует белок, то экспериментально можно изучить механизм, регулируют транскрипцию этого гена, а также наработать нужный белок в том количестве, которое требуется для медицинских или исследовательских целей. Кроме того, фрагмент ДНК одного организма можно ввести в клетки другого организма. Уже предпринимаются попытки вводить в те или иные культурные растения гены, обеспечивающие устойчивость к ряду болезней. Сегодня накапливаются клонированные фрагменты ДНК человека, pяда сельскохозяйственных животных и растений. Коллекцию разных клонов называют КЛОНОТЕКОЙ, ГЕНОМНОЙ БИБЛИОТЕКОЙ или БАНКОМ ГЕНОВ. Для полной библиотеки генома человека требуется получить около 800 тыс.разных клонов. Установлено, что чужеродная ДНК, будучи ведена в состав ДНК плазмиды или вируса, может сохраняться там, не претерпевая серьезных изменений нуклеотидной последовательности на протяжении нескольких сот генераций. Доказано, что бактериальные гены в составе гибридных молекул функционируют нормально. Гены, выделенные из ДНК эукариот (гриб растений, животных) в плазмиды встраиваются хорошо и размножаются неограниченном количестве. Матричная иРНК на них образуется, так что процесс транскрипции идет нормально. Осложнение возникло с процессом трансляции- синтезом белковых молекул. Эукариотный белок в бактериальных клетках синтезировался. Так была открыта сложная структура гена эукариот, состоящая экзонов и интронов. Нахождение условий функционирования генов эукариот в бактерии позволяло бы решить проблему получения многих биологически активных веществ (гормонов). Одним из достижений генной инженерии является синтез гормона соматостатина, полученный в результате введения этого гена в кишечную палочку. Соматостатин регулирует поступление в кровь гормона роста, образуется он в гипоталамической области. 23 Плазмиды, содержащие этот ген, были введены в бактерию и состыкованы с имеющимся в ее геноме регуляторным геном бетагалактозидазы. Наличие регуляторного участка обеспечило процесс транскрипции и трансляции. Однако создание искусственных генов, получение рекомбинантных молекул ДНК и введение их в клетки, в частности прокариот, может привести к появлению новых организмов с признаками, никогда ранее не имевшимися на Земле. Так, в США пересадили гены стафилококка кишечной палочки. В результате образовался гибридный штамм, обладающий свойствами обоих микроорганизмов. При манипуляции с геномом этой бактерии возникшие новые организмы могут приобрести патогенные свойства, быть устойчивыми к известным лекарственным препаратам и оказаться особо опасными для человека, поскольку в ходе предыдущей эволюции человеческий организм никогда не встречался с такими формами и может оказаться безоружным, В связи с этим на Международной конференции в США в 1974 г. были выработаны определенные правила, обязательные при манипуляциях с генетическим материалом и предложен ряд мер, которые должны сделать практически невозможным случайный выход из лабораторий в природу патогенных рекомбинантных микроорганизмов. Успехи генной инженерии должны быть использованы на благо человека: в борьбе против наследственных болезней, для создания новых микроорганизмов -продуцентов биологически активных веществ, синтеза растительных и животных белков и др. Генетическая инженерия развивается стремительно и уже располагает достаточными средствами и методами воздействия на наследственные заболевания. Генетики США пытаются заставить расти и размножаться клетки, синтезирующие молекулы фактора роста некроза опухолей (TNF). В эксперименте мышам со злокачественной меланомой удалось пересадить клетки, продуцирующие избыток TNF. Большинство их затем выводится из организма вместе с разрушенными клетками опухоли. Это дало основание провести цикл генотерапии раковым больным. Одновременно биотехнологическая компания из Калифорнии начала разработку фармацевтических препаратов, содержащих клетки, в которых дефектные гены замещены здоровыми. Такие универсальные донорские клетки готовы к пересадке больному. Другой биотехнологический препарат - сидераза разработан в Кембридже для терапии наследственной болезни Гоше, вызванной недостаточностью фермента глюкоцереброзидазы и сопровождающейся тяжелой анемией, артритом, ревматическими симптомами, увеличением печени и селезенки, постоянными отеками. Ученым удалось вплотную приблизиться к генотерапии наследственной эмфиземы и муковисцидоза. Нормально работающий ген фермента альфа-1-антитрипсина, 24 блокирующего работу легочной протеазы, был встроен в аденовирус, которым инфицировали больных животных. Спустя неделю после имплантации существенно уменьшились отеки слизистой и легких. Поскольку модифицированный аденовирус, использованный для переноса нормальных генов, безопасен, появилась возможность применить его и для лечения людей. |