методика. Методика проточной цитометрии

• Название: Методика проточной цитометрии
• Дата: 09.10.2018
• Размер: 19.01 Kb.
• Имя файла: методика.docx
• Тип: Документы; #52931

Комплексная оценка морфофункциональной реакции клеточных культур при сокультивировании с МНЧ была основана на определении жизнеспособности клеток, детекции основных показателей клеточного гомеостаза (маркеров активации – CD25, пролиферации – CD71 и апоптотической гибели – CD95), а также исследовании уровня провоспалительных и антивоспалительных цитокинов, секретируемых (МНК) по окончании времени инкубации.

Детекцию основных показателей клеточного гомеостаза (маркеров активации – CD25, пролиферации – CD71 и апоптотической гибели – CD95) проводили методом проточной цитометрии.

Принцип метода заключается в определении рассеивания света лазерного луча при прохождении через него клеток, окрашенных моноклональными антителами, меченными флуоресцентными метками.

Методика проточной цитометрии

После культивации клеток с наночастицами без биополимерного покрытия проводился анализ уровня экспрессии поверхностных маркеров и жизнеспособности с помощью лазерного проточного цитометра.

1. 
   Перед проведением фенотипического анализа экспериментальных и контрольных культур, проводили оценку их клеточности методом проточной цитометрии с использованием программы «Guava ViaCount» (Millipore, США), на проточном цитометре «Guava EasyCite Plus» (Millipore, США), согласно протоколу производителя.
   
2. 
   Далее проводили оценку фенотипического профиля с использованием коктейля моноклональных антител к CD45(ViaBlue); CD25(FITC), CD71(АРС), CD95(PE) («eВioscience», USA), приготовленного ex temporo. Кроме того в набор входил изотипический контроль.
   
3. 
   Для выполнения фенотипического анализа приготавливались две аликвоты (1 и 2), каждая из которых содержала 1×10⁶ клеток.
   
4. 
   Клеточная суспензия центрифугировалась с ускорением 300×g в течение 10 минут, затем полностью удалялся супернатант.
   
5. 
   Каждую аликвоту ресуспендировали в 100 мкл буфера.
   
6. 
   Добавлялось 10 мкл фенотипического коктейля в аликвоту 1 и 10 мкл изотипного контрольного коктейля в аликвоту 2.
   
7. 
   Содержимое аликвот хорошо перемешивалось и инкубировалось 10 минут в темноте в холодильнике (2-8°C).
   

8. 
   Клетки промывались добавлением 1 мл буфера и центрифугировались с ускорением 300×g в течение 10 минут, затем полностью удалялся супернатант.
   
9. 
   Осадок клеток ресуспендировали с помощью буфера для анализа.
   
10. 
    Анализ проводился с использованием программы «MACSQuantify™ Software’s» (Miltenyi Biotec, Германия), методом проточной лазерной цитометрии на проточном цитометре «MACSQuant Analyzer 10» (Miltenyi Biotec, Германия), согласно протоколу производителя. Результаты цитометрического анализа были проанализированы с помощью программы «KALUZA Analysis Software» (Beckman Coulter, США).
    

Методика мультиплексного анализа.

1. Добавиляли 100 мкл буфера (Bio-Plex assay buffer) в каждую лунку планшета.

2. После вортексирования приготовленной смеси магнитных частиц (х1), добавили по 50 мкл суспензии магнитных частиц в каждую лунку планшета.

3. Промыли планшет 2 раза с использованием 100 мкл Bio-Plex assay buffer (на металлической подложке).

4. Размороженные образцы, стандарты, бланки провортексировали 30 сек. Добавили по 50 мкл в каждую лунку планшета (соответственно заранее приготовленному бланку-протоколу).

5. Закрыли планшет светозащитной пленкой. Инкубировали на шейкере 1 ч при 850±50 rpm при комнатной температуре.

6. Вортексировали 5 сек 20х детектирующие антитела (АТ) за 10 мин до конца инкубации. Развели 20х АТ с помощью Detection Ab Dilluent до 1х суспензии.

7. Промыли планшет три раза с использованием 100 мкл Bio-Plex assay buffer (металлическая подложка).

8. Вортексировали суспензию 1х АТ. Добавили по 25 мкл в каждую лунку планшета.

9. Закрыли планшет и инкубировали в течении 30 мин при комнатной температуре при 850±50 rpm.

10. Вортексировали 5 сек 100х концентрат стрептовидина-фикоэритрина (SA-PE) за 10 мин до конца инкубации. Развели 100х SA-PE с помощью assay buffer до 1х суспензии, поставили в темное место.

11. Промыли планшет три раза с использованием 100 мкл Bio-Plex assay buffer (металлическая подложка).

12. Провортексировали суспензию 1х SA-PE. Добавили по 50 мкл в каждую лунку планшета.

13. Закрыли планшет и инкубировали в течении 10 мин при комнатной температуре при 850±50 rpm.

14. Промыли планшет три раза с использованием 100 мкл Bio-Plex assay buffer (металлическая подложка).

15. Ресуспендировали магнитные частицы в 125 мкл assay buffer. Закрыли планшет и встряхнули на шейкере 30 сек при 850±50 rpm.

16. Подготовленный планшет с образцами тестировали на приборе Bio-Plex, Luminex200

17. Полученные данные сохранили в формате Microsoft Excel, для дальнейшего их анализа