Пр. пр № 5 Коректик орталар 2003(1). Микроазаларды оректенуі
 Скачать 48 Kb.
|
|
Зертханалық жұмыс № 5 Тема: Микроағзалардың қоректенуі. 1. Қоректік орталарға сипаттама беру. 2. Қоректік орталарды дайындау тәсілі. 1. Микроағзалар үшін қоректік орталарды дайындау кезінде, олардың қоректрену элементеріне деген қажеттідлігін есептеу қажет. Құрамы бойынша қоректік орталар екі топқа бөлінеді: табиғи және жасанды (синтетикалық). Табиғи деп – күрделі белгісіз химиялық құрамына ие жануар және өсімдік тектес өнімдерден тұратын орталарды айтады. Осындай орталарға жасылы қсімдіктердің әртүрлі бөлшектері, жануар ұлпалары, уыт, ашытқылар, көкеністер, көң, топрақ, теңіз, өзен сулары және минерлды заттар жатады. Олардың көпшілігін экстракт немесе тұнба түрінде қолданады. Табиғи орталарда көптеген микроағзалар жақсы өседі, себебі мұндай орталар өсуге және дамуға қажетті барлық компоненттерге ие. Бірақ құрамы белгііз орталар микпроағзалардың физиологиялық зат алмасуын зерттеу үшін аз жарамды, себебі олар осындай заттарды мо даму кезінде бөлуі мүмкін. Бұл мынамен байланысты: табиғи орталардың құрамы өте күрделі, сонымен бірге күнделіктіге жатпайды, себебі шикізатқа және орта дайындау тәсіліне қарай ол өзгеруі мүмкін. Бұл микроағзалардың өсуіне әсерін тигізеді. Құрамы белгісіз табиғи орталарды микроағзалардың өсінділерін бір қалыпта ұстап тұру, олардың биомассасының жиналуы және диагностикалық мақсатар үшін қолданады. Құрамы белгісіз орталардың қатарына жартылай синтетикалық орталарды жатқызуға болады. Олардың құрамына химиялық қосылыстармен бірге құрамы белгісіз заттарда кіреді. Синтетикалық орталар – құрамына тек қана белгілі, концентрациясы нақты таза химиялық қосылыстар кіретін орталарды айтады. Синтетикалық орталарды дистеллденген суда дайындау қажет. Микроағазалардың дұрыс өсуін немесе оның тіршілігіндегі қандайда бір өнімнің максималды биосинтезделуін қамтамсыздандыратын синтетикалық орталарды құрастыру үшін , берілген ағзалардың зат алмасу ерекшіліктерін және олардың қоректені көзіне деген қажеттілігін білу қажет. Қазырғы кезде микробиологияда синтетикалық орталар жеткілікті, олар өздерінің сапасы жағынан табиғи орталрдан кем емес. Синтетикалық орталар құрамы жағынан қарапайым немесе күрделі болуы мүмкін. Микроағзалардың зат алмасуын зерттеу үшін синтетикалық орталар өте қолайлы. Орта құрамына кіретін заттардың құрамын және мөлерін біле отырып, олардың қажеттілігін және белгілі бір өнімге ауысыун оқу болады. Микробтологияның ең бір мақсатына – қандайда бір субстратта микроағзалардың санын (КОЕ — колония түзушілік бірлігі) бөліп алу жатады. Немец ғалымы Р. Кох ет сорпасы негізінде универсалды орта ұсынды, онда органикалық құрамында азоты бар қосылыстарды қабылдайтын микроағзалар жақсы өседі. Кейінірек С. Н. Виноградский микробиология практикасына микроағзалардың жеке топтарын анықтау үшін элективті (таңдалмалы) орталарды енгізді. Бұл орталар микроағзаның бір түрінің немесе туыстық микроағзалардың топтарын, басқаларының жетілуі үшін жарамдылығы төмен немесе мүлдем жарамсыз микробтардың топтарының жетілуіне мүмкіндік беруді қамтамасыздандырады. Қандайда бір сай келетін микроағзалар тобының физиологиялық ерекшілігтерін біле отырып, микроағзалардың осы тобы ғана дамыйтын культвтрлеу жағдайын (орта құрамы, оның белсенділігі, аэрация жағдайы, температура және т.б) таңдап алуға болады. Бұл зертханада әртүрлі биологиялық процесстерді жүргізуге және алдын ала орталарды залалсыздандырмай өндіруге мүмкіндік береді. Осындай орталарды ең бастысы микроағзаларды табиғи тіршілік ететін жерлерінен бөліп алуда және жиналатын өсінділерді алу үшін қолданады. «Элективті орталар» анықтамасына оданда кең анықтама «Элективті жағдай» кіреді. Консистенциясы бойынша қоректік орталар келесі түрлерге бөлінеді: сұйық, тығыз, жартылай сұйық немесе қоймалжын. Тығыз қоректік орталарды – бактерия сандайын есептеу, олардың таза өсінділерін бөліп алу үшін және басқада мақсаттарда қолданады. Бұндай орталарды сұйық 1,5 – 2,5 % агар – агар немесе 10 – 15 % желатин қосып дайындайды. Жартылай сұйық орталарды дайындау кезінде агар – агарды 0,1 – 0,2 % мөлшерде қосады. Агар – агар – теңіз балдырларынан арнайы технологиямен алынатын өсімдікті коллоид. Оның құрамына азот заттары өте аз полисахаридтер кіреді. Ол гелді пласина, субстрат, ұнтақ түрінде шығарылады. Микроағзалардың көпшілігі оны субстрат ретінде қабылдамайды, сондықтанда агар инвертті қаттылаушы орта ретінде қолайлы. Агардың еру температурасы – 100 º, салқындату 50º, қату темпер - 40 °С Желатын – сүйек – шеміршіктерді қайнату жолы арқылы алынатын, құрамында азотты заттары бар қышқыл өнім. Желатиннің еру температурасы (22 – 25 º), көптеген микроағзалардың инкубациялану (30 – 37 º) температурасынан төмен. Бұл көптеген микроағзалардың желатинді ыдырату қабілетілігіне және ерекішіліктеріне байланысты. Тығыз қоректік орталар ретінде С. Н. Виноградскиймен микробиология практикасына енгізілген гелді пластиналар кең қолданылады. Азоттың органикалық формасын пайдалынатын микроағзаларды өсіру үшін өте кең ет – пептонды орталар қолданылады, оларға: ет – пептонды сорта (ЕПС), ет – пептонды агар (ЕПА) және ет – пептонды желатин (ЕПЖ) жатады. 2. Қоректік орталарды дайындау тәсілі. ЕПС ортаны дайындау үшін ет сорпасын қолданады, оны келесі түрде алады: 500 г сүйексіз, майсыз және шеміршексіз шабылған свежий етті бар эмальды мескейге (кастрюльде) 1 л су құйып, 50 º дейін қыздырады және комната температурасында 12 сағатқа немесе 50 -55 º 1 сағатқа тұнуға қалдырады. Етті қысып алады, экстракты бір қабат мақталы марлыдан сүзіп алады, коллойды ақуыздардың іруі үшін 30 минут аралығында қайнатады, одан кейін екі рет (1-ші рет мақтасы бар марлыдан, 2-ші рет қығаз фильтр арқылы) сүзіп алады. Фильтратқа 1 л су қосып, колбаға көшіріп құяды, мақталы тығынмен тығындап, 120 º 20 минут аралығында стерилдейді (колба тығынын үстінен қағаздан жасалынған қақпақшамен жабады). Мақталы тығындар тығыз болуы керек, себебі олар стерилизациядан кейін ауадан бөтен бактериялардың еніп кетуінен сақтап тұратын фильтр. Ет сортпасын қоректік орта дайындау үшін кез келген уақытта қолдануға болады. Егер оларды сол кезде дайындаса, алдын ала стерилдеу керек емес. Зертханалық жағдайда тұнбаны етпен бірге қайнатады, одан кейін етті бөліп алады. Сапасы жақсы сорпа алынады. Қоректігі ерекше жоғары ет сорпасын алу үшін , етпен суды түндыру кезінде кішкене пепсин қосады және сорпаны күкірт қышқылымен қышқылқандырады. Пепсин қосымша еттің ақуызды қосылыстарын гидролиздейді және бактериялармен сіңірілетін қоректік заттардың мөлшері жоғарлайды. Етті ет экстрактімен алмастыруға болады, ол үшін 1 л ортаға 5 гр экстракт алады. Ет – пептонды сорпаны дайындау кезінде ортаның калориясын жоғарлату үшін ет сорпасына 5 -10 г пептон және белсенді осмостық жағдайды құру үшін 5 г ас тұзын қосады (пептон – ақуыздың жоғары молекулярлы массасын гидролиздейтін бірінші өнім). Ортаны пептон ерігенше қыздырады және жиі жиі араластырып тұрады. Одан кейін орта реакциясы әлсіз сілті немесе нейтралды жеткізгенше 20 % Na2 CO2 құйады (ылғал қызыл лакмусты қағаз көгілдір болғанша, бұл жерде фенолфталеин әлі сілтілі реакция бермейді, оны ортаға қосқан кезінде фарфорлы табақшада ақшыл қызғылт түс білінбейді). Бромтимолблау индикаторын қолданған өте қолайлы. Оның 1 -2 тамшысын шынылы таяқшамен фарфорлы табақшаға салады да, үстінен сорпа тамызады. Нейтральды орда бромтмолблау бөтелкелі – жасыл, ал қышқылды ортада – сары және сілтіліде – көк түске боялады. Реакцияны орнатып болғаннан кейін, ортаны 5 -10 минут қайтадан қыздырады және реакцияның өзгеруінің әсерінен ірітілген ақуыздар қағаз фильтр арқылы сүзіліп өтеді, бұл жерде сорпаны түссіздендіруге ұшыратылмайды немесе оның ақуыздарын бөліп алмайды. Мөлдір ет – пептонды сорпаны пробиркаға құяды, мақталы тығынмен тығындайды және 120 º С 20 минут аралығында стерилдейді. ЕПА - 1 л ет – пептонды сорпаға 15 -20 гр кесілген агар – агарды қосады. Ортаны агар ерітілгенше қайнатады (еру температурасы 100 º, қату – 40 ºС) , 20 % Na2 CO2 қосу арқылы ортаның реакциясын әлсіз сілтіге келтіреді, одан кейін воронка арқылы пробиркаларға құяды (10 мл табақшаға – агарды стобик түрінде, 5 мл жинастырылған, бүгілген агар алу үшін құяды). Агарды құйу кезінде пробиркалардың шеті құрғақ екініне мән беру керек, әйтпесе пробиркалар шыныға жабысып қалады. Ортасы бар пробиркаларды автоклавта 120 º С 20 минут аралығында стерилдейді. ЕПЖ - 1 л ет – пептонды сорпаға 100 – 150 г желатин салады. Еру температурасы ортада құрамының проценттік мөлшеріне байланысты. 10 % желатин 24 º С, 15 % - 25 º С ериді. Жаз уақыттарында ортаны 15 % желатин қосып дайындайды. Ақырын қыздырып тұрып, желатин еригеннен кейін орта реакциясын әлсіз сілтігі келтіреді, 5 минут аралығында қайнатады, одан кейін 40 -50 º С салқындатады. Бір уақытта жұмыртқа ақуызын кішкене ғана суда булғайды да оны салқындаған желатинді ортаға құйады, жақсылап шайқайды да қайтадан қыздырады. Ақуыздар тұнбаға түскенен соң, орта мөлдір болады. Оны ыстық воронка арқылы сүзіп, пробиркаларға құйады және Кох кипитильникнигінде, ортаны 24 сағат ішінде әр 3 сағаттан сон 30 минут қызыдырп отырып бумен стерилдейді. Майсызданған сүт ортасы- Қоректік ортаны дайындау үшін майсызданған сүт, яғни көк сүт қоланылады, себебі сүттегі май кейбір микроағазлардың өсуіне жағымсыз әсерін тигізуі мүмкін. Көк сүтті 34 º С дейін сүтті қызыдырып, сепарирлеу арқылы алады. Майын сүт салқындағаннан кейінде алуға болады. Сүтті стерилдеу кезінде мынаны есте сақтау қажет – оны ұзақ уақыт автоклавта ұстауға болмайды, себебі сүттің құрамында болатын лактоза (сүт қанты) карамелденіп кетеді. Майсызданған сүтті стерилденген пробиркаларға құяды да 115 º С 15 минут ұстап тұрады. Стерилизация алдында көк сүттің қышқылдығы 22 º Т аспауы керек, әйтпесе сүт ұйып кетуі мүмкін. Стерилизациядан кейін оны термостатта 30º С 3 тәулік ұстайды, бұл спора түзетін және қыздыруға тұрақты басқада миркоптардың дамуына кедергі жасайды. 3 күннен сон сүті бар әр пробирканы қарап шығады және микроағазалар өскен пробиркаларға бракка жатқызады. Кейбір кезде автоклавта стерилдеуде сүттің күреңдеуі (побурение) мүмкін, бұл сүт қанттың карамелденуінен және казеиннің пептонизациялануынан болады. Ұзақ уақыт стерилдеу кезінде пробирка түбінде казеин қалдығы тұнбаға түседі, ол жартылай пептонизациялануы мүмкін. Артық қыздырылған, күреңделген сүтті орта ретінде қолдануға болмайды. |