Микрофлора тела человека
 Скачать 4.59 Mb.
|
|
Микрофлора тела человека Кафарская Л.И. Роль нормальной микрофлоры • Микрофлора играет важную роль в поддержании здоровья на оптимальном уровне. • В настоящее время микрофлора рассматривается как метаболически активный орган. • Микрофлора и слизистые находятся в тесном взаимодействии, оказывая взаимное влияние Микрофлора тела человека • Постоянная часть – облигатная, индигнная, аутохтонная (постоянно входящие в состав нормофлоры и играющие важную роль в метаболизме хозяина). • Факультативная часть – транзиторная (часто встречается у здоровых, состав не постоянный). Функции нормальной микрофлора • Создание колонизационной резистентности (КР), механизма, предотвращающего заселение экзогенными микроорганизмами и их избыточный рост. • Синтез веществ (органические кислоты, перекись), подавляющих рост экзогенных микробов. • Конкуренция за места прикрепления на слизистых и за источники питания. • Стимуляция гуморального и клеточного иммунитета, локального иммунитета Функции нормальной микрофлора • Регуляция газового состава кишечника и других полостей организма. • Продукция энзимов, участвующих в метаболизме белков, жиров, углеводов. • Детоксикация экзогенных и эндогенных субстратов и метоболитов (естественный биосорбент). • Образование свободных метаболитов • Образование желчи Функции нормальной микрофлора • Повышение резистентности эпителиальных клеток к мутагенам (канцерогенам). • Морфокинетическая • Антимутагенная • Канцеролитическая • Хранилище микробных плазмидных и хромосомных генов • Обеспечение цитопротекции. История культурального метода На протяжении многих лет, со времен Пастера и Коха для исследования микрофлоры применяются классические культуральные методы. Получены фундаментальные данные о составе микрофлоры тела человека Выделены и идентифицированы более 500 видов микроорганизмов В последние годы, проведен мониторинг качественного и количественного изменения по возрастам. ПЦР конвенциональная – качественный метод Высокая специфичность, чувствительность, высокая скорость, прямое определение возбудителя Проводится в несколько этапов. Необходимость стадии электрофореза ПЦР в реальном времени Молекулярно-генетические методы исследования микрофлоры • Для детекции и количественного определения большого количества родов и групп микроорганизмов. • используются группоспецифические, подгруппоспецифические праймеры. • Группа C. leptum • 5’ GCACAAGCAGTGGAGT 3’ • Видоспецифические праймеры – детекция определенных видов микроорганизмов. Молекулярно-генетические методы исследования микрофлоры • Создание праймера 2-х этапный процесс – «записать» нуклеотидную последовательность и синтез праймера. • Определение нуклеотидной последовательности Секвенирование. Новые методы изучения микрофлоры • В 1999 году группа ученых из (Франция) и Университета Ридинга (Великобритания) применили для исследования микробной популяции кишечника метод секвенирования генов 16S РНК • Идеальный маркер для идентификации микроорганизмов ген, кодирующий 16S рибосомальную РНК. • Этот ген есть в геноме всех бактерий и архей, но отсутствует у эукариот и вирусов, имеет как консервативные участки, одинаковые у всех прокариот, так и видоспецифичные. • Нуклеотидные последовательности 16S РНК всех известных бактерий общедоступны (ген банк). Новые методы изучения микрофлоры • Только 24% полученных последовательностей 16S РНК принадлежали известным ранее микроорганизмам. Три четверти представителей микрофлоры не культивируются. Микрофлора кож и Аэробные коринеформные бактерии • Corynebacterium – подмышечные впадины,грудная клетка, промежность, кожа носа. • Brevibacterium – на руках, стопах ног. Анаэробные коринеформные. • Propionibacterium acnes – на крыльях носа, головы спины(сальные железы). • На фоне гормональной перестройки играют значительную роль в возникновении юношеских acne vulgaris Микрофлора кожи Коринеформные – обнаруживают чаще в кожных складках. Микрофлора кожи • Propionibacterium . Облигатно анаэробные грамположительные неспоробразующие . • Обнаруживаются в глубоких слоях кожи. Микрофлора кож и Микрококки • Staphylococcus aureus – нос, промежность, подмышечные области. • Staphylococcus epidermidis – кожа рук, ног, лба. • Micrococcus luteus – в кожных складках, бедрах, чаще в пубертатный период. • Анаэробны кокки – Peptosreptococcus – кожа лба. Микрофлора кожи Стафилококки Микрофлора кожи Стафилококки – электронная микроскопия Микрофлора кожи • Эпидермальный стафилококк – рост на кровяном агаре без гемолиза. Микрофлора кожи • Микрококки на кровяном агаре колонии, продуцирующие желтый пигмент. Микрофлора кожи Бациллы- транзиторно Микрофлора кожи Бациллы гемолиз на кровяном агаре. Микрофлора кожи Микрофлора наруж ны х слуховы х проходов. • Коагулозонегативные стафилококки, • Коринебактерии. При патологических процессах – • Псевдомонады, протеи, эшерихии. Микрофлора респираторного тракта Ротовая полость • Стрептококки – Streptococcus salivarius. • Стафилококки – S. aureus , S. epidermidis , анаэробные кокки в слюне. • Haemophilus inffluenzae – часто у здоровых. • Облигатноанаэробные неспорообразующие анаэробы(превотеллы, порфиромонасы) • Лактобактерии, лептотрихии. • Грибы рода Candida Микрофлора респираторного тракта • Стрептококки • на кровяном агаре. Микрофлора респираторного тракта Стрептококки ( Streptococcus mutans) Микрофлора респираторного тракта Стрептококки – электронная микроскопия. Гемофильные палочки Микрофлора носоглотки • Небны е миндалины - гемолитические стрептококки (S.pyogenes), S.pneumoniae, анаэробные кокки, H.influenza, неспорообразующие анаэробы • Нос - S. aureus , S. epidermidis , непатогенные нейссерии,иногда коринебактерии. • Трахея, бронхиолы, альвеолы- стерильны. Необходимые условия формирования нормальной микрофлоры Наличие внешних источников здорового бактериального представительства (мать и родственники, близко контактирующие с ребенком Грудное вскармливание (противомикробные компоненты грудного молока) Селективное заселение представителей нормальной микрофлоры из множества микроорганизмов окружающей среды. Противомикробные соединения Иммуноглобины: slgA, SlgG, SlgM Лактоферрин, лактоферрин В и Н Лизоцим Лактопероксидаза Антитела к-казеин и α-лактальбумин Хаптокоррин (Haptocorrin) Муцины Лактадхерин (Lactadherin) Свободный секреторный компонент Олигосахариды и пребиотики Жирные кислоты Материнские лейкоциты и цитокины sCD14 Комплемент и дополнительные рецепторы β- дефензин-1 Бифидофактор Устойчивые/стимулирующие соединения Цитокины II-10 и TGFβ Антиидиотипические антитела Соединения развития иммунитета Макрофаги Нейтрофилы Лимфоциты Цитокины Факторы роста Гормоны Молочные пептиды Полиненасыщенные жирные кислоты с длинной цепью Нуклеотиды Молекулы адгезии Противовоспалительные соединения Цитокины: II-10 и TGFβ Антагонист рецептора II-1 TNFα и рецепторы II-6 sCD14 Молекулы адгезии Полиненасыщенные жирные кислоты с длинной цепью Гормоны и факторы роста Остеопротегерин Полиненасыщенные жирные кислоты с длинной цепью Гормоны и факторы роста Соединения с иммунологическими свойствами в грудном молоке Кишечник-часть иммунной системы. В реализации иммунных механизмов на уровне интестинального тракта принимают участие три ключевых и одновременно взаимосвязанных компонента: - Нормальная микрофлора . - Лимфоидная ткань, ассоциированная со слизистой оболочкой кишечника - Цитокины , как фактор межклеточного взаимодействия. Молекулярно-генетические методы в изучении микрофлоры Использование молекулярно-генетических методов коренным образом изменило наши представления о составе микрофлоры Интестинальная микрофлора представлена преимущественно облигатно анаэробными группами микроорганизмов Большинство видов микроорганизмов относится к некультивируемым микроорганизмам Преобладающие группы бактерий 1 доминирующая группа до 43% Clostridium coccoides group Clostridium, Eubacterium, Ruminococcus, Coprococcus, Dorea, Lachnospira, Roseburia and Butyrivibrio 2- доминирующая Clostridium leptum группа 19-25% Anaerqfilum Clostridium,Eubacterium,Ruminococcus 3- группа Cytophaga-Flavobacter-Bacteroides 1- минорная группа Bifidobacterium около 5-10% 2 – минорная группа Lactobadllus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus Leuconostoc Особенности микрофлоры у здоровых детей раннего возраста. Бифидобактерии облигатная флора детей раннего возраста. К концу 2 недели жизни обнаружены у 40-60% новорожденных. Доминируют у 96%-100% клинически здоровых детей, на грудном вскармливании, у 75% на искусственном. У взрослых бифидобактерии составляют менее 10% микробиоты. Их присутствие жизненно важно. Важнейшая функция создание КР, препятствуют транслокации условнопатогенных из кишечника. Концентрация 109-1010 мт От 1до 4 видов бифидобактерий B. longum, B. adolescentis, B. breve, B. pseudocatenulatum Микрофлора кишечника Лактобактерии. • Облигатная флора . К концу 1-го месяца жизни обнаружены у 57%детей, находящихся на грудном вскармливании • В мере взросления их количество увеличива- лось. • Содержание в большей степени зависит от вводимых кисломо- лочных продуктов. • Количество 106 –108 в 1 г. Микрофлора кишечника Бактероиды. • Неспоробразующие грамотрицательные анаэробы. • Способны отщеплять остатки фукозы от поверхности клеток хозяина используя в качестве источника энергии или как строительный материал для синтеза различных молекул, включая богатые фукозой капсулы • В 8 месяцев – 80% • В 10 месяцев у 100%. • Высокочувствительны к действию кислорода, необходимо снижение О-В в кишечнике. Концентрация 109-1010 в 1 г. Особенности микрофлоры у здоровых детей раннего возраста. « Условно бактероиды» - многочисленная группа грамотрицательных, палочковидных анаэробных бактерий. Роды: Bacteroides, Alistipes, Porphiromonas, Prevotella Содержание резко повышается и достигает концентрации взрослых 10 9-10 КОЕ/г. к 6-7 месяцам. Данные микроорганизмы стимулируют формирование иммунной системы ребенка, ускоряя созревание IgA- и IgG-секретирующих клеток «Биологический реактор» производство энергии Особенности микрофлоры толстого кишечника у клинически здоровых детей раннего возраста. Лецитиназонегативные клостридии у 45,7% в конце 1-го месяца жизни, у 80- 100% к концу 1 года. Лецитиназопозитивные у 30-40%. Производят бутират нутритивный фактор для колоноцитов. Стимулируют пролиферацию кишечного эпителия. К клостридиям пока отнесены Сегментированные фрагментарные филаментозные бактерии, не культивируются грамположительные, неспорообразующие палочковидные, анаэробы. В 10 месяцев у 33,3%, в 1 год 46,5% в количестве Lg 10,0+0,4. облигатно анаэрбные, кокки. Встречаются у 33% -53,9% до 1 года. Концентрация Lg 9,9+0,5. Сегментированные филаментозные бактерии, некультивируются Особенности микрофлоры толстого кишечника у клинически здоровых детей раннего возраста К клостридиям отнесены Segmented filamentous bacteria (SFB) – некультивируемая группа микроорганизмов, грамположительные, пока отнесены к клостридиям Находятся в тесном контакте с эпителицитами тонкого кишечника (в инвагинациях мембраны) Просеквенированы геномы нескольких изолятов • Играют ключевую роль в постнатальном созревании иммунной функции толстой кишки • Стимулируют Тн17 лимфоциты. Микрофлора кишечника Клостридии. Clostridium difficile. • Присутствуют в небольшом количестве. Их популяция • Резко возрастает при использовании некоторых антибиотиков- клиндамицин. Вызывают псевдомембранозный колит Микрофлора кишечника • Эшерихии. • Количество 106-108 в 1 г. • Синтезируют 9 витаминов. Микрофлора кишечника Эшерихии электронная микроскопия Микрофлора кишечника Рост эшерихии на среде Эндо Микрофлора кишечника Клебсиеллы. • В высокой концентрации у детей • 80-100% детей в возрасте 7-12 месяцев. • После 1,5 лет элиминируются. • Транзиторная микрофлора Рост клебсиелл на агаре эндо. Микрофлора кишечника Микрофлора кишечника Псевдомонады –окраска по Граму. Псевдомонады встречаются редко 3-5% Микрофлора кишечника Кандида Микрофлора кишечника Стафилококки. • Коагулазонегатив- ные стафилококки у 80-100%, • Коагулазопозитив- ные у 60% детей раннего возраста. Микрофлора кишечника Стрептококки Микрофлора кишечника Стрептококки электронная микроскопия Микрофлора кишечника Энтерококк Микрофлора кишечника Энтерококк электронная микроскопия. Нормальный представитель микрофлоры. Концентрация 10 6 -10 8 Микрофлора кишечника Бациллы. Транзиторная микрофлора. У здоровых детей –редко. Особенности микрофлоры у клинически здоровых детей раннего возраста • Высокие популяционные уровни бифидобактерий и бактероидов у 100% детей. • Лактобактерии не у всех. • Высокая частота выделения и концентрация аллохтонных микроорганизмов: • Коагулазопозитивные стафилококки • Цитратассимилирующие энтеробактерии • Эшерихии с низкой биохимической активностью и продуцирующие гемолизины. • Лецитиназопозитивные клостридии. • К концу первого года жизни происходит полная или частичная элиминация условнопатогенных бактерий Микрофлора и иммунная система кишечника Нарушение качественного и количественного состава микрофлоры – опасно для здоровья. Основными механизмами, участвующими в контроле качественного и количественного состава микроорганизмов, являются факторы естественной резистентности и иммунологической защиты, созревание которых происходит по мере взросления ребенка. Контакты с бактериальными антигенами определяют созревание иммунной системы. Состав микрофлоры кишечника должен косвенно отражать особенности физиологического состояния как защитных, так и других систем организма в различные периоды жизни Заключение • Микрофлора кишечника рассматривается как метаболически активный орган • Преобладающими группами микроорганизмов у людей более старшего возраста являются группы клостридий • Бифидобактерии важнейшая и доминирующая группа микроорганизмов у грудных младенцев Микрофлора мочеполового тракта Наруж ны е половы е органы - • Стафилококки, зеленящие стрептококки, • Энтерококки, пептострептококки, коринебактерии, энтеробактерии, неспорообразующие анаэробы, дрожжи. Микроэкология влагалища Половые пути женщины: • Плоский эпителий влагалища • Цилиндрический эпителий шейки матки • Вагинальный секрет Микроэкология влагалища • Вагинальный эпителий – сквамозный многослойный эпителий, созревание эпителиоцитов находится под контролем гормонов яичников(индуцируют накопление гликогена в вагинальном эпителии). • Гликоген расщепляется лактобакте- • риями с продукцией молочной кислоты. • Низкие значения рН Вагинальная микрофлора Вагинальный эпителиоцит. К нему адгезированы лактобактерии (палочки Додерлайна). Поддерживают КР влагалища, продуцируют молочную кислоту, перекись водорода. Вагинальная микрофлора Вагинальные лактобактерии. Количество их у женщин репродуктивного возраста 10 7 -10 8 Типичные представители: L. acidophilus L. fermentum L. plantarum L. casei Лактобактерии препятствуют контаминации вагинального тракта экзогенными микроорганизмами и таким образом обеспечивают колонизационную резистентность. Антибактериальная активность прежде всего связана с выработкой в процессе брожения молочной и других органических кислот, что обеспечивает низкое содержание рН, а также – способность продуцировать перекись водорода Вагинальная микрофлора Выявляются у 7-12% здоровых женщин (во время беременности – выше 20%) и концентрациях варьируют от 10 3 до 10 7 КОЕ/мл. Выделяют большое количество кислых продуктов, тем способствуя поддержанию во влагалище кислой среды (низкой рН) Пептосрептококки Относятся к представителям нормальной флоры генитального тракта. Частота их выделения в норме варьирует от 40 до 90% случаев, а количество анаэробных кокков в вагинальном отделяемом составляет от 10 3 до 10 4 КОЕ/мл Пропионобактерии Типичный представитель – P. аcnes, которые могут быть выделены с частотой до 25% в количестве 10 4 КОЕ/мл (в норме) Превотеллы Неспоорбразующие, грамотрицательные анвэробные палочки. Основной вид – P.bivia и P.disiens. В норме частота встречаемости может достигать 60%, количественный уровень не превышает в норме 10 4 КОЕ/мл Mobiluncus Выделяются только у 5% здоровых женщин. Основное значение приобретают у женщин с бектериальным вагинозом. Отмечается значительное увеличение концентрации этих бактерий на фоне снижения уровня вагинальных лактобактерий, при этом частота контаминации достигает от 30% до 50% случаев. Обладают способностью прикрепляться к эпителиоцитам влагалища. Кроме того, у них обнаружены муколитические ферменты: муциназа, нейраминидаза Вагинальная микрофлора Вейлонелла облигатно анаэробные грамотрицательные кокки. « Ключевые клетки» « Ключевые клетки» Мобилюнкусы Причины дисбактериоза Химиотерапевтический – назначение антибиотиков (ампициллин, клиндамицин). Постлучевой – воздействие ионизирующей радиации(аплазия костного мозга, гибель микрофлоры и эпителиоцитов кишечника). Постинфекционный – после перенесенных инфекций. Воздействие стрессовых факторов. Коррекция микрофлоры кишечника Биологически активны е вещества: • Диетические добавки – естественые питатель- ные вещества(витамины, минералы, протеины, ферменты)+ микроорганизмы(пробиотики),используют как дополнение к основной пище. • Функциональное питание – готовые для продажи пищевые продукты, в которые добавляют биопрепараты. Это модифицированные продукты, которые улучшают состояние здоровья более оптимально, чем исходный продукт (бифидокефир). Функциональное питание Коррекция микрофлоры кишечника Пробиотики – живые микроорганизмы (бифидобактерии, лактобактерии), нормофлора кишечника здорового человека. Могут включаться в питание, как биодобавки . Критерии отбора перспективных штаммов- пробиотиков. • Происхождение штамма – типичный для данной экологической ниши. • Жизнеспособность – выживаемость в ЖКТ. • Способность к адгезии. • Высокая антагонистическая активность. • Иммуномодулирующие свойства • Модуляция метаболической активности индигенной флоры • Безопасность • Производственные характеристики Влияние пробиотических препаратов на состав микрофлоры кишечника у детей раннего возраста Пробиотик – эффективно восстанавливает молочнокислую флору. Не приводит к элиминации условнопатогенных бактерий. Постоянная контаминация микроорганизмами окружающей среды Основными механизмами, участвующими в контроле качественного и количественного состава микроорганизмов,являются факторы естественной резистентности и иммунологической защиты, созревание которых происходит по мере взросления ребенка Бифидосодержащие • Монокомпонентные - бифидумбактерин, • Поликомпонентные -Линекс (B.infantis, L.acidophilus, E. faecium), Примадофилус • Бифиформ (В. longum и E. faecium). • Комбинированные и сорбированные • Бифилиз сухой (B.bifidum и лизоцим). • Пробифор(B. bifidum, адсорбированные на активированном угле Пробиотические препараты Пребиотические продукты • 1995 год – Неперевариваемые компоненты пищи, способные избирательно стимулировать рост 1 и 2 видов микроорганизмов в толстой кишке. • В настоящее время пребиотик и бифидогенный факторы уравнены. • инулин и олигофруктоза, галактоолигосахариды • Не адсорбируются, не расщепляются в верхних отделах ЖКТ Лактосодержащие • Моносодержащие • Лактобактерин сухой (L.plantarum 8RA-3) • Поли-компонентные - Ацилакт сухой (L.acidophilus - 3 разных штамма). • Аципол (L.acidophilus и полисахарид кефирных грибков) Пребиотические продукты • Пребиотики – цепи, состоящие из 3–10 мономеров углевода • Низкий гликемичсекий индекс • Низкое содержание калорий • Устойчивы к действию пищеварительных ферментов человека ( связи между фруктозой – и глюкозой, с короткоцепочечными жирными кислотами) • Большинство бифидобактерий обладает соответствующим β-fructosidase Симбиотики • Смесь пробиотика и пребиотика. • В идеале – синергизм. Пробиотики – будущее • Изолированы и охарактеризованы молекулярно-генетическими методами новые перспективные штаммы бифидобактерий. • С использованием технологии рекомбинантных ДНК получены генетически измененные штаммы. • создаются пробиотические штаммы с заданными уникальными свойствами. В нашей лаборатории созданы оригинальные векторные системы: Для получения рекомбинантных бифидобактерий-продуцентов фактора роста фибробластов и интерлейкина–10 – цитокинов (ИЛ-10 способен уменьшать продукцию ИЛ-1, фактора некроза опухолей, ИЛ-6 макрофагами), является противовоспалительным цитокином. Эти штаммы перспективны для лечения неспецифического язвенного колита болезни Крона язвенно-некротического энтероколита недоношенных. Пробиотики – будущее Развитие генной инженерии бифидобактерий позволит создавать пробиотические штаммы бифидобактерий с заданными свойствами – способными продуцировать рекомбинантные человеческие белки – цитокины, ферменты, антитела. |