Молекулярные маркеры. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ. ПРИЧИНЫ И ПОСЛЕДСТВИЯ ОШИБОК ГЕНОТИПИРОВАН. Молекулярные маркеры. Причины и последствия ошибок генотипирования
 Скачать 60.84 Kb.
|
|
ТИПЫ, ПРИЧИНЫ И СЛЕДСТВИЯ ОШИБОК ГЕНОТИПИРОВАНИЯ Очевидно, что достоверность заключений по любому эксперименту по генотипированию определяется качеством полученных результатов. Ошибки генотипирования могут быть обусловлены различными причинами. Их класификация приведена в обзорах [27, 36, 37, 38]. Минимизирование ошибок возможно при оценке особенностей используемых экспериментальных методов, их оптимизации, надлежащему использованию контролей, повторностей, отбору маркеров, а также разработки статистических подходов для выявления ошибок. Так, повышение вероятности ошибок связано с маркерами с более высокой гетерозиготностью, с большим количеством аллелей, большим количеством «stutter» бэндов и большими размерами продуктов [27]. Наличие статтерных бэндов затрудняет оценку гетерозиготности, например, когда две аллели гетерозиготы отличаются только на один повтор, статтеры их перекрывают, образуя смежные бэнды подобной интенсивности. Четыре типа ошибок генотипирования создают тенденцию к увеличению доли гомозиготности: выпадение аллелей, нуль аллели, неправильная оценка близлежащих аллелей как «stutter» бэндов, доминирование коротких аллелей, когда бóльшие по размеру аллели имеют слабый сигнал ниже порога обнаружения [38]. Ошибки генотипирования могут проявляться в нарушении Менделевского наследования, но есть такие, при наличии которых результат находится все же в соответствии с Менделевским наследованием. Хотя выявить последние гораздо сложнее, они могут оказывать серьезное влияние на достоверность статистического анализа. Даже выявленные подобные ошибки часто могут быть отнесены к более, чем одному источнику внутри родословной [39]. Так SNPs являются биаллельными маркерами, и их наследование соответствует Менделевскому [40], тем не менее, данный тип маркеров может быть причиной большей доли ошибок. Более того, все большие массивы данных содержат ряд ошибок, обусловленных оплошностями исследователя, недостатками программного обеспечения или просто биохимическими аномалиями, что еще усугубляет использование таких высокопроизводительных методов как SNP [41]. Ошибки генотипирования могут приводить к некорректности генетических карт при изучении картирования признаков интереса, некорректности определения родословной, очевидно их влияние на генетический анализ популяций. Важность выявления ошибок генотипирования становится все более очевидной с развитием международных программ, например, по изучению биоразнообразия и необходимостью обработки огромных массивов данных, получаемых в ряде лабораторий, когда достоверность и воспроизводимость результатов приобретают определяющее значение. Ошибки разделены исследователями на категории [37]. 1 - обусловленные особенностями собственно последовательности молекулы ДНК. В случае мутаций, локализованных в комплементарной последовательности одного из маркеров, амплификация нарушается; вставка или делеция близко к микросателлиту может иметь следствием одинаковый размер фрагментов или «считывание» только одного аллеля вместо двух. 2 - низкое качество и/или недостаточное количество ДНК. Как низкое качество, так и малое количество ДНК обуславливают «выпадение» (dropout) аллелей в гетерозиготах (амплификация только одной предпочтительно более короткой аллели). При контаминации образцов ДНК возможна амплификация контаминантных аллелей. Одним из решений проблемы в случае малого количества ДНК предложен метод разделения образца на несколько пробирок и проведение реакции амплификации в каждой из них [42]. 3 - артефакты, обусловленные реагентами. Ошибки, связанные с особенностью Tag-полимеразы добавлять к 3´-концу не принадлежащий к последовательности амплифицируемого фрагмента нуклеотид (как правило, аденин), в результате может появиться дополнительный бэнд (пик). Эта реакция чувствительна к последовательности 5´-конца праймера и длительному времени элонгации в ПЦР. «Slippage» («запинание») Tag-полимеразы на первых стадиях ПЦР приводит к появлению ложных аллелей. Реагенты низкого качества могут отрицательно влиять на условия ПЦР, неадекватные условия электрофореза могут приводить к искаженной картине распределения аллелей по размеру и т.д. 4 - человеческий фактор. Существенная доля ошибок генотипирования обусловлена именно этим фактором [36]. Так, это может быть связано с субъективностью оценки электрофореграмм и радиоавтограмм, и соответствующим некорректным обозначением аллелей, что в свою очередь зависит и от качества данных; загрязнение экзогенной ДНК или случайное перекрестное «заражение» образцов, использование неоптимальных протоколов, неоптимальных праймеров, температуры плавления в ПЦР, ошибки при вводе и обработке данных и др. [43]. На практике для выявления ошибок генотипирования проводится повторная реакция амплификации и сравнение полученных продуктов первоначального и повторного анализа для определенного ряда образцов, другими словами – анализ дублированных образцов. Количество (коэффициент, процент) ошибок генотипирования оценивается в различных экспериментах на аллель, на локус, на ПЦР, на мультилокус. Но, поскольку ошибки неслучайно распределены по аллелям, локусам, ПЦР, простое сравнение процентов ошибок между ними некорректно [38]. Так, при сравнении процента ошибки на локус выпадение аллели в гомозиготном локусе не проявляется, а выпадение аллели в гетерозиготном будет выглядеть как гомозигота. Поэтому аллельное выпадение в гомозиготе и гетеролокус с утраченной аллелью будут оценены одинаково и, следовательно, процент ошибки между локусами или популяциями, которые реально различаются в степени гетерозиготности, оценивается некорректно. Наиболее приемлемым считается определение доли ошибки на локус. Процент ошибки для определенной аллели или локуса дает определенную информацию на их целесообразность «исключения» из эксперимента для повышения достоверности результатов. Какой процент ошибки может быть значим для корректности оценки результатов – видно из примера: при 1% ошибки в обозначении аллели только в 62% случаев повторное сравнение генотипа индивидуума подтверждало идентичность, при 2% показатель снижался до 40% [27]. В моделируемых исследованиях было продемонстрировано, что ошибка в 3% отрицательно сказывалась на выявлении неравновесности сцепления признаков (linkage disequilibrium, LD), что мешает, например, выявлению взаимосвязи в комплексах генов, ответственных за болезнь [44]. Согласно определению исследователей [36], следует помнить, что потенциальные последствия ошибок на выводы обратно пропорциональны масштабам выводов. Универсального подхода для исключения ошибок генотипирования не существует, хотя бы по целому ряду объективных причин их природы. Тем не менее, исследователи [37] формулируют определяющие установки для уменьшения количества ошибок и снижения их влияния на конечный результат. В их числе – оценка качества предполагаемых к анализу образцов (качество ДНК) и уровень технических возможностей для реализации; проведение пилотных экспериментов для сравнительной оценки теоретического и реального коэффициента ошибки; контроль качества должен осуществляться на всех этапах исследования для выявления возможного больших вариантов ошибок. Экономия материальных и трудовых затрат должна быть подчинена снижению количества ошибок и повышению эффективности анализа полученных результатов. Только высококвалифицированный персонал, руководствуясь и используя стандарты качества проведения процедур тестирования, с возможно меньшими произвольными манипуляциями, с возможно большей автоматизацией процессов, способен минимизировать процент ошибок генотипирования. Разработан ряд подходов для выявления ошибок генотипирования и определения их процента, которые включают сравнение дублированных образцов, независимое обозначение размеров аллелей, проверку соответствия Менделевскому наследованию [45]. Но ни один из подходов не способен выявить все ошибки. Исследователи сравнили коммерческий набор микросателлитов и специально созданный высокоразрешающий набор для картирования (commercial genomewide set and custom-designed fine-resolution mapping set). Создание commercial genomewide set основано как на локализации, так и на способности амплифицировать ДНК в обычных условиях. Поэтому все проблемные праймеры заменяются на оптимальные. При конструировании праймеров для fine-resolution mapping set маркеры отбираются согласно их хромосомной локализации, и их амплифицирующая способность не всегда оптимальна. Эта особенность отразилась в первоначальных неудачах ПЦР. Так, ошибки Менделевского наследования составили 0,13% для первого набора праймеров и 1,19% для второго из-за трудностей подсчета некоторых аллелей во втором случае. Проверка исходных образцов и дубликатов (сoncordance checking) выявила только ошибки, обусловленные человеческим фактором: пропущенные аллели, обозначенные ошибочно и перепутанные образцы, тогда как Менделевское наследование показало дополнительные ошибки, такие как мутации и нуль аллели. Последний подход был более достоверен при использовании обоих типов наборов микросателлитов, тогда как специальный набор маркеров для картирования был более успешен при сравнении дубликатов образцов. Самый очевидный из подходов – повторное генотипирование и сравнение репрезентативного ряда образцов, хотя и связан с достаточно большими дополнительными экспериментальными затратами, все же не дает полной гарантии достоверного результата. Наиболее часто используемый статистический тест при анализе популяций – определение соответствия/отклонения равновесию Харди-Вайнберга (HWE) (Deviations from Hardy–Weinberg equilibrium, HWD) [46]. Принцип Харди-Вайнберга описывает, каким образом вариация в популяции поддерживается на основе Менделевского наследования. Закон Харди-Вайнберга гласит, что частота аллелей (т.е. вариаций генов) и генотипа в популяции, благодаря Менделевскому наследованию, в отсутствие эволюционных воздействий остается константной в поколениях. Ряд допущений необходимы для соблюдения этого принципа: диплоидные организмы, только половое размножение, поколения не перекрываются, не дублируются, случайные скрещивания (при инбридинге увеличивается гомозиготность всех генов), неопределенно большой объем популяции, нет миграций, мутаций и отбора. В локусе с двумя аллелями (p+q)=(p+q)2=p2+2pq+q2=1, т.е. пропорции генотипов, согласно Харди-Вайнбергу, равны p2+2pq+q2 (биномиальное распределение). Для более чем двух аллелей (p+q+r)2=p2+q2+r2+2pq+2pr+2qr. В более общем виде для аллелей А1, … Аn с частотой аллелей от p1 до pn (p1 + …+ pn)2. Отклонения от равновесия Харди-Вайнберга могут свидетельствовать об ошибках генотипирования. Но при этом следует помнить, что отклонения могут быть обусловлены и самой структурой популяции. Что, собственно, и важно выявить и разграничить. Для оценки того, насколько анализируемые данные совпадают с теоретически ожидаемыми, используется «критерий согласия» Пирсона, метод хи-квадрат (χ2). Сравниваются две совокупности: одна – эмпирическое распределение частот, другая представляет собой выборку с теми же параметрами (n, M, S и др.), что и эмпирическая, но ее частотное распределение построено в точном соответствии с выбранным теоретическим законом, которому предположительно подчиняется поведение изучаемой случайной величины. В общем виде формула критерия соответствия может быть записана следующим образом: Figfor1 где α – фактическая частота наблюдений; А – теоретическая ожидаемая частота для данного класса. К сожалению, проверка на несоответствие Менделевскому наследованию не исключает всех ошибок генотипирования [40]. Исследователями с использованием различных подходов, в том числе TaqMan, RFLP, секвенирование, масс-спектроскопия, SNPs (распределенных как в генных, так и в межгенных областях), было проанализировано 107000 генерированных генотипов. Из 313 SNPs, частоты минорных аллелей которых были в пределах 0,06–0,49, в 36 случаях (11,5%) наблюдались достоверные отклонения от HWE. Для 21 SNPs были выявлены ошибки генотипирования; для 5-ти SNPs – неспецифическое связывание; для 10-ти SNPs причины отклонения не были выяснены. Согласно каждой из использованных технологий и уровню значимости отклонений от HWE (0,01<P<0,05 или P<0,01), был сделан вывод, что источниками ошибок, по крайней мере отчасти, явилась используемая SNP методология. Результат ретроспективного анализа этих экспериментов по идентификации доли неспецифических проб и генотипических ошибок позволил авторам развить и стандартизировать процесс и в дальнейших исследованиях по генотипированию 96-ти образцов с использованием 1434 SNPs, снизить HWE до 10 (P<0,01). Можно полагать, что незначительный процент ошибок при генотипировании популяций с использованием микросателлитов при значительном количестве образцов и большом количестве аллелей не окажет серьезного влияния на характеристику структуры популяции. Однако было установлено, что ошибки, обусловленные особенностями образцов, могут существенно повлиять на результат, несмотря на большую выборку [38]. Для оценки влияния отдельных образцов на равновесие Харди-Вайнберга использовался «a jackknife» анализ, который осуществлялся с использованием соответствующих программ. Каждый образец последовательно удалялся из общего массива данных и для оставшихся образцов рассчитывался показатель Харди-Вайнберга для всех аллелей. «Влиятельными» образцами считались те, при удалении которых уровень значимости становился P>0,05, тогда как для всей суммы образцов был P≤0,05. Было выявлено 33 случая, когда удаление образца изменяло статус локуса, как влияющего на отклонение равновесия на находящийся в равновесии (P>0,05). Величина влияния определялась преобразованием величины P: figfor2 Таким образом, было показано, что равновесие Харди-Вайнберга было очень чувствительно к гомозиготности редких аллелей в отдельных индивидуумах, и более 50% этих случаев было обусловлено ошибками генотипирования образцов низкого качества. По определению исследователей это указывает на возможность того, что даже «нормальный» уровень лабораторных ошибок может обусловить переоценку влияния отдельных маркеров на равновесие Харди-Вайнберга и тем самым на оценку структуры популяции, в том числе «завышения» роли инбридинга. Любая ошибка, которая существенно влияет на частоту распределения, способствует некорректному отражению степени дифференциации популяции. Например, если аллель бóльшего размера имеет место только в одной из двух популяций, ошибка, вызывающая ее выпадение (dropout), делает эти две формации более схожими. Наоборот, если одна и та же аллель присутствует в двух популяциях, ее выпадение, снижая ее частоту, приводит к тому, что значительность дифференциации определяется вторичными различиями в частотах редких аллелей. Еще в начале 90-х годов при изучении генома человека появились данные о неамплификации отдельных аллелей, например, 7 из 23 аллелей (30%) на хромосоме 16 не амплифицировались у некоторых представителей родословной [47]. При генотипировании Cervus elaphus не амплифицировались 3 аллели из 16, что было выявлено по несовпадению в парах мать-потомство и существенным отклонением от равновесия Харди-Вайнберга [48]. Анализ двух из трех аллелей показал, что исключение даже нескольких неамплифицируемых гомозигот может иметь серьезный эффект на интерпретацию распределения частот в генотипе и неправильной оценке инбридинга в популяции. Поскольку многие естественные популяции проявляют Харди-Вайнберг неравновесие, как следствие инбридинга или смешивания, необходимо дифференцировать эти случаи и отклонения от равновесия, обусловленные нуль аллелями. Исследователями был предложен алгоритм расчета, который может быть использован для разделения локусов, проявляющих нуль аллели от таковых, отражающих биологический сигнал инбридинга [49]. В настоящее время явление неамплификации микросателлитных аллелей уже признано однозначно. Нуль аллели выявляются не только при использовании микросателлитов, но также и EST-SSR [28]. Молекулярная природа нуль аллелей обусловлена мутациями: заменами, вставками, делециями. Связь между наличием нуль аллелей и высокой вариабельностью фланкирующих областей была зафиксирована в ряде молекулярно-генетических исследований. Так компьютерная симуляция, осуществленная исследователями, и ее приложение к эмпирическим данным позволили заключить, что нуль аллели наблюдались в популяциях с высоким уровнем разнообразия во фланкирующих областях (≥0,001) [50]. Нуль аллели с большой вероятностью фиксировались в популяциях большого эффективного размера с высокой долей мутаций во фланкирующих областях и этим отличались от популяции («центральной»), на основе которой были клонированы аллели и сконструированы праймеры, Другими словами, высокая частота нуль аллелей в исследуемых популяциях была обусловлена высоким уровнем дифференциации между ними и «центральной» популяцией. Ошибки вследствие «stuttering» (обусловленные особенностями Таг-полимеразы), выпадение бóльших аллелей и нуль аллели, в отличие от стохастических (произвольных, случайных) ошибок, создают последовательные (consistent) отклонения от действительно имеющей место картины аллелей и соответственно отклонения от адекватности генотипирования [51]. Так, размеры и форма «stuttering» образцов варьируют среди локусов, некоторые маркеры проявляют низкий уровень «stuttering», тогда как другие могут образовывать два и более пиков. Интерпретация подобных образцов затруднена, например, соседних аллелей в гетерозиготе, различающихся на один динуклеотидный повтор. Такой аллель гетерозиготы может быть оценен как гомозигота с аллелью бóльшего размера. В целом это приведет к сдвигу в сторону аллелей бóльшего размера, снижая гетерозиготность и увеличивая кажущийся уровень инбридинга соответствующих локусов. Что касается выпадения аллели бóльшего размера, вследствие преимущественной амплификации более короткого аллеля, пик последнего может быть гораздо выше первого, а в образцах низкого качества бóльший аллель не амплифицируется вообще. Выпадение аллелей увеличивается с их размером, а в некоторых локусах даже увеличение концентрации ДНК не снижает уровень выпадения, указывая на технические ограничения при амплификации больших аллелей. Нуль аллели – третья причина последовательных ошибок генотипирования, не выявляются по определению, причина их главным образом в мутации в месте прайминга (присоединения праймера). В случае гетерозиготы образцы будут оценены как гомозигота, а в случае гомозиготы – как отсутствие реакции амплификации вообще. В общем, это приводит к снижению частоты гетерозиготности и повышению кажущегося уровня инбридинга. Исследователи рекомендуют стандартные процедуры и протокол, позволяющие предупредить, снизить уровень ошибок генотипирования при изучении диких популяций [52]. Они включают скрининг (отбор) микросателлитных локусов, повторный анализ части (subset) образцов, оценку полного массива данных, тестирование ошибок, уменьшение ошибок в последующих анализах и предоставление отчетности по частоте ошибок. В работе [53] при анализе 233 публикаций с упоминаемыми нуль аллелями было обращено внимание на несколько положений: как эти аллели были определены; был ли проведен редизайн праймеров для этих локусов; каким методом определялась их частота; проводилось ли их сиквенирование для выяснения молекулярной основы их «проявления»; были ли локусы с нуль аллелями оставлены или исключены из последующего анализа. Наиболее часто используемый в этих работах подход для выявления нуль аллелей был основан на наблюдаемом дефиците гетерозигот в популяциях. Использовалась также оценка отклонений от Харди-Вайнберг равновесия. Хотя на этот показатель оказывает влияние и структура субпопуляций, инбридинг или селекция, затронувшая место, близкорасположенное к микросателлиту. В нескольких работах был привлечен анализ родословной, что является более весомым свидетельством. Авторы пришли к выводу, что частоты нуль аллелей могут приводить к ложным выводам относительно родословной. Обусловленная нуль аллелями и наблюдаемая высокая гомозиготность может приводить к завышенной оценке дифференциации популяций. При высокой дифференциации популяций наличие нуль аллелей приводит к завышению индекса фиксации (FST) – меры дифференциации популяции и генетических расстояний. Поскольку праймеры, фланикрующие EST-SSRs, являются производными достаточно консервативных последовательностей, вероятно, для этих маркеров нуль аллели могут быть меньшей проблемой. Сравнение 25 EST-SSRs и 17 SSRs маркеров при генотипировании ряда представителей хвойных (Picea spp.) показало меньшую гетерозиготность для EST-SSRs маркеров (среднее H=0,65 vs 0,72). Но при этом значения вероятности инбридинга (F) для специфических SSR маркеров позволили идентифицировать локусы с мнимыми нуль аллелями, в результате указывая на существенно более низкий очевидный инбридинг (среднее F=0,046 vs 0,126) [54]. Как упоминалось выше, для молекулярных маркеров возможно проявление гомоплазии – негомологичности амплифицированных последовательностей одинакового размера. Использование микросателлитов и секвенирования фрагментов ДНК существенно повысило возможности исследователей по выявлению признаков, имеющих гомопластический характер и их влияния на популяционный анализ [55]. Первоначально концепцию гомоплазии использовали эволюционисты, описывая тот факт, что характерный признак, присутствующий в двух видах, может не иметь одного общего предка, а быть результатом конвергенции, параллелизма или риверсии. Таким образом, гомоплазия имеет значение при оценке филогенетических взаимоотношений между видами. Для молекулярного маркера гомоплазия имеет место тогда, когда различные копии локуса одинаковы по размеру и не разделяются электрофоретически (электроморфы), но не идентичны по происхождению. Например, микросателлиты мутируют с достаточно высокой скоростью и аллели одинакового размера имеют скрытые различия в последовательностях, которые могут быть выявлены только секвенированием или (SSCP, single-strand conformation polymorphism) [56]. Гомоплазия по размеру внутри и между популяциями побуждает исследователей определять ее индекс как вероятность того, что в данном локусе две копии гена одного состояния не идентичны по своему происхождению. Еще более значимо для интерпретации результатов проявление гомоплазии при AFLP анализе. Так, поскольку доля одинакового размера AFLP профилей составляла от 0 до 5% для близких сородичей и многократно возрастала для удаленных таксонов, исследователи высказали предположение, что изучение филогении с использованием AFLPs возможно только для близкородственных таксонов [57]. Используя AFLP при сравнительной характеристике Phaseolus lunatus и Lolium perenne, исследователи показали, что для обоих видов распределение по размеру фрагментов асимметрично с гораздо большей долей коротких фрагментов по сравнению с длинными [58]. Меньшего размера фрагменты более подвержены комиграции при электрофорезе и проявлению гомопластичности. Исследователи высказали гипотезу, что уровень гомоплазии по размеру является функцией размера и это может смещать оценки генетического разнообразия, основанного на частотах AFLP фрагментов. Проведя анализ in silico полных геномных последовательностей 14 видов, включая эукариоты, прокариоты и архея, исследователи выявили следующее: показанная ранее положительная корреляция между процентом гомоплазии и размером генома есть прямое следствие количества наблюдаемых бэндов и содержания ГЦ оснований в геноме [59]. Регрессия пропорции гомоплазии на количество бэндов была идентична для всех анализированных видов, несмотря на 1,000-кратную разницу в размерах генома. Поскольку исследователи признают, что генотипирование с помощью молекулярных маркеров весьма субъективная процедура в зависимости от подготовленности персонала и возможностей конкретной лаборатории, в качестве одного из критериев, например, для AFLP маркеров разработан алгоритм scanAFLP отбора маркеров на основе интенсивности распределения фрагментов среди образцов [60]. Метод сравнен с предложенным ранее AFLPscore [56], в котором в качестве критерия использовались пороги интенсивности флюоресценции продукта AFLP-полимеразной реакции. Алгоритмы использовались для сканирования популяции из 619 индивидуумов Arabis alpina из 191 места сбора и оценки генетической структуры, разнообразия и дифференциации. В каждой плашке на 96 ячеек использовали следующие контроли генотипирования, начиная с выделения ДНК: один отрицательный контроль (без образца), два образца включали во все плашки (повторности, положительный контроль для всех плашек) и два образца на каждую плашку анализировали дважды (положительный контроль на плашку). Кроме того, один образец в качестве дубликата собирали в каждом месте сбора. Из них 39 случайно отобранных включали в анализ в качестве «blind» контролей для расчета несовпадения уровня ошибок. Автоматизированная процедура отбора маркеров существенно уменьшила процент ошибок, понизив случайные сигналы, связанные как с индивидуумами, так и популяциями. Случайно отобранные наборы маркеров показали заметно меньшую вариабельность между дубликатами по сравнению с наборами, отобранными согласно определенному критерию. Следует обратить внимание на набор контролей для генотипирования. Подобный подход необходим при использовании любого типа молекулярных маркеров. Очевидно, что наряду с необходимостью выявления и уменьшения доли ошибок генотипирования, которые имеют место в любом эксперименте при использовании различных типов маркеров, важно соблюдать компромисс между выбраковкой локусов, порождающих ошибки, и повышением потенциала оставляемых локусов для усиления генетического сигнала популяции. Компромисс может быть различным в различных исследованиях, но главное, чтобы этот сигнал не был потерян в угоду «приемлемого» уровня ошибок, и исследователи предлагают эмпирический подход для достижения желаемого компромисса [61]. |