Нуклеиновые кислоты- Биорганика. Методичка-Нуклеиновые кислоты. Нуклеиновыекислоты Целое этонечтобольшее, чемсуммачастей
 Скачать 397.55 Kb.
|
-основныесвойства.В физиологических условиях среды (рН7,4) фосфатные группы в молекулах ДНК и РНК полностью ионизированы, поэтому в условиях внутренней среды живых организмов нуклеиновые кислоты существуют в форме полианионов, те. несут множество отрицательных зарядов. Фосфатные группы нуклеиновых кислот сильно полярны и характеризуются значениями рК I < 2. Поверхность нуклеиновых кислот в целом несет отрицательный заряд, т.к. внешние фосфатные группы полностью ионизированы уже при рН = 4 (рН внутриклеточной среды близко к нейтральному значению. Именно поэтому нуклеиновые кислоты склонны к взаимодействию с полиами- нами, у которых между атомами азота содержатся две или три метиленовые группы. Большой интерес вызывает кислотно-основное взаимодействие нуклеиновых кислот с белками, в результате которого, собственно и формируются сложные белки – нуклеопротеины. Особенно эффективными оказываются взаимодействия нуклеиновых кислот с белками, имеющими оснóвный характер р 8), т.к. в биосредах суммарный заряд этих белков принимает положительные значения. Как уже отмечалось ранее, ДНК образует комплексы с гистона- ми, входящими в состав хромосом. Гистоны электростатически взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфатными группами, расположенными по периферии двойной спирали ДНК, и образуют достаточно прочный комплекс, в котором ДНК оказывается стабилизированой дополнительно. Вследствие изменения ионного состава среды, в которой находится данный комплекс, может происходить дестабилизация ДНК, чем и определяется регуляторная роль гис- тонов в функционировании генома. Надо отметить, что кислотно-основные свойства нуклеиновых кислот обусловлены не только наличием в них фосфатных групп, но и присутствием 236 азотистых оснований. Кислотно-основные свойства гетероциклических оснований влияют главным образом на состояние и прочность водородных связей и стэкинг-взаимодействий, стабилизирующих вторичную структуру ДНК. Хелатирующаяспособность. Вводных растворах нуклеиновые кислоты проявляют свойства активных полидентатных лигандов. Полидентатность нуклеиновых кислот обусловлена наличием ионизированных фосфатных групп и полярных групп азотистых оснований (карбонильных, имино- и др, способных к образованию координационных связей с катионами металлов. С помощью ионизированных фосфатных групп нуклеиновые кислоты хелатируют катионы щелочных и щелочноземельных металлов, причем с катионами щелочных металлов нуклеиновые кислоты образуют лабильные, ас катионами щелочноземельных металлов (Mg 2+ ,Ca 2+ ) – более прочные комплексы. За счет взаимодействия с полярными группами азотистых оснований нуклеиновые кислоты образуют достаточно стабильные комплексы с катионами металлов. Денатурация. Все внешние факторы, которые приводят к ослаблению или нарушению водородных связей или стэкинг-взаимодействий, вызывают денатурацию нуклеиновых кислот. При этом происходит нарушение вторичной и третичной структуры нуклеиновых кислотно сохраняется первичная структура молекул (рис. 37). Факторы, вызывающие денатурацию нуклеиновых кислот абсолютно те же, что и факторы, приводящие к денатурации белков, но интенсивность денатурирующего действия конкретного фактора в случае нуклеиновых кислот может быть иной. При денатурации ДНК ее двойная спираль полностью или частично разделяется (раскручивается) на составляющие цепи. Контроль за процессом денатурации ДНК можно осуществлять с использованием ряда методов. Чаще всего измеряют поглощение в УФ-области спектра. Интенсивность поглощения света пуриновыми и пиримидиновыми основаниями зависит оттого, присутствует ли оно в свободном состоянии или входит в состав полинуклеотидов. При образовании двухспиральной структуры ДНК интенсивность поглощение света каждым основанием уменьшается (гипохромный эффект. Разрушение двухцепочечной спирали ДНК при денатурации вызывает увеличение интенсивности поглощения УФ-света пуриновыми и пиримидиновыми основаниями (гиперхромный эффект. Если относительное поглощение при 260 нм отложить по оси ордината температуру (как фактор денатурации) – по оси абсцисс, то получается образная кривая (рис. 38). Она показывает, что при нагревании ДНК ведет себя подобно кристаллам двухцепочечная молекула расплетается на составляющие ее цепи впределахнебольшоготемператур- ногоинтервала. Поэтому денатурациюДНК нередко называют плавлением, а температуру, при которой ДНК денатурирована на 50%, - температурой плавления Т пл . Нужно отметить, что Т пл зависит от относительного содержания пар гуанин – цитозин и аденин – тимин, поскольку первая пара более прочная. образные профили плавления показывают, что денатурация ДНК – процесс кооперативный, те. каждое предшествующее изменение повышает вероятность последующего. Так, если в определенном месте спирали происходит нарушение водородных связей, то это приводит к нарушению стэкинг-взаимодействий, что облегчает разрыв последующих водородных связей и т. д. 237 Нагревание Охлаждение 65 70 75 80 85 90 t, С 1,40 1,30 1,20 1,10 Относительное поглощение при 280 нм Рис. 37 Изменение вторичной структуры ДНК в процессе денатурации Рис. 38 График денатурации (плавления) ДНК Так как при денатурации нуклеиновых кислот их первичная структура сохраняется, то данный процесс может иметь обратимый характер. На способности нуклеиновых кислот восстанавливать свою нативную конформацию после денатурации (ренативация) основан чрезвычайно важный метод определения степени гомологичности, или родственности нуклеиновых кислот. Этот метод называют молекулярнойгибридизацией. Сущность этого метода сводится к следующему сначала смешиваются растворы ДНК, выделенных их организмов разного вида (например, лягушки и кролика затем эти растворы нагревают (для денатурации ДНК, а потом охлаждают. При этом возникают двухспи- ральные структуры разного состава наряду с двухспиральными молекулами, идентичными исходным молекулам ДНК, могут образовываться гибридные молекулы, содержащие одну полинуклеотидную цепь из ДНК лягушки, а другую – из ДНК кролика. Такие гибридные молекулы несовершенны спирализован- ные участки в них чередуются с неспирализованными, в которых полинуклео- тидные цепи не комплементарны друг другу. Изучение гибридизации ДНК – ДНК позволило биологам сделать вывод, что первичная структура ДНК характеризуется видовой специфичностью. Сходным образом может происходить гибридизация ДНК – РНК в этом случае гибридная молекула содержит одну дезоксирибонуклеотидную цепь и одну рибонуклеотидную. При гибридизации ДНК и РНК, выделенных их одного итого же организма, образуются совершенные гибриды. Иначе говоря, вся РНК организма комплементарна ДНК того же организма. Это означает, что все соображения относительно видовой специфичности ДНК в равной степени применимы и к РНК. Жидкокристаллическоесостояниенуклеиновыхкислот. Для нуклеиновых кислот характерна определенная ориентационно-пространственная организация нуклеотидов, каждый из которых анизотропен, причем, при образовании комплементарной пары азотистых оснований в полинуклеотидной цепи анизотропные свойства усиливаются. Следовательно, при описании свойств двойной спирали ДНК роль анизотропии становится весьма существенным фактором. Для крупных молекул ДНК, молекулярная масса которых достигает 238 10 9 Да, вполне естественно, что в растворе отдельные фрагменты молекулы могут находится в жидкокристаллическом состоянии. Число таких фрагментов и их ориентация в пространстве сильно влияют на состояние ДНК в клетке и на ее биологические функции. Кроме того, различные жидкокристаллические состояния могут формироваться в системах полинуклеотиды – вода или нуклеопротеины – вода. В таких системах могут происходить множественные переходы из одного жидкокристаллического состояния в другое, которые будут изменять биологические функции системы в целом под действием направленного поля или самопроизвольно. В настоящее время установлено, что жидкокристаллические состояния нуклеиновых кислот или их молекулярных комплексов с белками играют важную роль в процессах передачи наследственной информации и биосинтеза новых нуклеиновых кислот и белков на молекулярном уровне. БИОЛОГИЧЕСКИЕФУНКЦИИНУКЛЕОТИДОВ ИНУКЛЕИНОВЫХКИСЛОТ Нуклеиновые кислоты, прежде всего ДНК, являются материальными носителями наследственной информации и определяют видовую специфичность организма, сложившуюся входе биологической эволюции. Важно уяснить, что именно азотистые основания – пуриновые или пиримидиновые, являются носителями наследственной (генетической) информации, подобно тому, как боковые заместители аминокислот определяют химические и функциональные свойства аминокислоты. Сочетания трех рядом стоящих нуклеотидов вцепи ДНК называются триплетамиоснований или кодонами. Все кодоны ДНК составляют генетическийкод(см. главу 12 Раздела II ). Молекула ДНК организованна в клетке в структурные единицы – гены. Гены, в свою очередь, локализованы в хромосомах, которые находятся в ядре животных или растительных клеток. Именно ген содержит информацию, определяющую фенотипический признак организма цвет глаз и волос, рост, пол и др. Все количество ДНК, содержащееся в клетке, называется геномом. Наука, объектом исследования которой является совокупность всей наследственной информации организма, те. наука о геноме, называется геномикой ив последнее время претерпевает бурное развитие. Количество генов в геноме человека ранее оценивалось в 60–80 тысяч. По последним данным, их меньше – 25–35 тысяч. Причем большинство генов из генома молчит (у человека примерно 4 / 5 от общего количества генов неактивны, те. не кодирует молекулярные процессы, жизненно необходимые для клетки и организма в целом. Генетическая информация передается от родительской клетки к дочерней путем репликации – точного воспроизведения ДНК in vivo. Генетическая информация, заложенная в ДНК, в процессе транскрипции переписывается в полинуклеотидную последовательность мРНК. Матричная РНК, в свою очередь, взаимодействует с соответствующими специфическими аминоацил-тРНК, в результате чего происходит последовательное присоединение аминокислот. Перевод генетической информации из РНК в специфическую аминокислотную последовательность белка называется трансляцией. 239 Термины репликации, транскрипции и трансляции можно легко усвоить, если проводить аналогию с процессом создания книги. Для набора в типографии готовят много копий, или реплик (репликация. Если из книги переписывают отрывок, это соответствует транскрипции. Если книга написана на другом языке, ее переводят (трансляция от нуклеотидов к аминокислотам. Схематично процесс передачи генетической информации можно представить следующим образом трансляция накопление белка транскрипция РНК репликация накопление ДНК ДНК Механизмы репликации, транскрипции и трансляции рассматриваются в главах 11 и 12 Раздела II. Хотелось бы особенно отметить важную биологическую роль аденозин- трифосфорнойкислоты (АТФ, которая является универсальным хранилищем химической энергии, обеспечивая тем самым практически все процессы синтеза ряда биологически активных веществ in vivo (см. главу 10 Раздела II). В сущности, везде, где есть жизнь, присутствует и АТФ. После смерти организма синтез АТФ прекращается, и молекулы данного соединения претерпевают ряд химических превращений до инозинмонофосфата (ИМФ) – вещества, вкус которого слегка напоминает вкус мяса. Ангидридная структура трифосфатной цепи АТФ обусловливает высокое содержание энергии, а нуклеозидная часть молекулы служит для узнавания и связывания с различными ферментами. Более простые производные фосфорной кислоты, имеющие ангидридную природу (например, ацетилфосфат, дифосфат), наряду с АТФ характеризуются повышенным содержанием энергии. Реакционную способность и повышенную энергоемкость ангидридов можно объяснить конкуренцией фосфорильной и карбонильной групп за несвязанные электроны одного итого же атома кислорода. В результате гидролиза такая конкуренция ослабляется, что приводит к большей стабилизации. Следовательно, образование продукта энергетически более выгодно по отношению к исходному веществу. Для ангидридов фосфорной кислоты образование продуктов гидролиза выгодно потому, что при этом уменьшается электростатическое отталкивание между отрицательными зарядами в ди- и трифосфатной цепи. Молекула АТФ способна передавать свою потенциальную энергию множеству других биологически важных соединений. Так, например, энергия образования пептидной связи in vivообеспечивается за счет энергии АТФ. Следует также подчеркнуть важную роль циклических нуклеотидов 3′,5′- циклоаденозинмонофосфата (цАМФ) и 3 ′,5′-циклогуанозинмонофосфата (цГМФ), которая состоит в регуляции межклеточных процессов коммуникации см. главу 9 настоящего Раздела. 240 Р H О НО HN N N N O H 2 N Р H O OH O H CH 2 O H H О НО цАМФцГМФ Межклеточная коммуникация осуществляется главным образом по нескольким механизмам, заключающихся в передаче электрических импульсов в нервной системе (см. главу 16 Разделав передаче информации через химических посредников, роль которых выполняют гормоны и нейромедиаторы. Всегда в регуляции этих процессов в большей или меньшей степени принимает циклические нуклеотиды, которые синтезируются из высокоэнергетических предшественников (АТФ, ГТФ) с участием ферментов аденил- и гуанилциклаз. На любой из перечисленных выше процессов цАМФ и цГМФ оказывают противоположное действие если цАМФ прекращает реакцию, то цГМФ будет эту реакцию стимулировать. Следует пояснить, что циклофосфатное кольцо в цАМФ и цГМФ – это высокоэнергетическая структура, изменение свободной энергии гидролиза этих соединений при физиологических условиях приблизительно на –12,5 кДж·моль -1 отличается от соответствующей величины для нециклических форм. ВОПРОСЫДЛЯСАМОПРОВЕРКИ 1. Перечислитеосновныеисследования, результатыкоторыхспособствоваливыяснению химическогостроенияибиологическихфункцийнуклеиновыхкислот. 2. Какиесоединенияобразуютсяврезультатеполногокислотногогидролизануклеиновых кислот ВчемзаключаетсяосновноеотличиехимическогостроенияДНКиРНК? 3. Производнымикакихорганическихсоединенийявляютсяазотсодержащиегетероцик- лическиеоснования, входящиевсоставнуклеиновыхкислот? 4. ВчемзаключаетсяотличиемолекулРНКотмолекулДНКпокачественномусоставу азотистыхоснований? 5. Перечислитеизвестныевамглавныеиминорныеазотистыеоснования, входящиевсо- ставнуклеиновыхкислот. 6. Какимиособенностямихимическогостроенияифизико-химическихсвойствобладают пуриновыеипиримидиновыеазотистыеоснования? 7. Какиесоединенияназываютнуклеозидами, акакиенуклеотидами? 8. СформулируйтеправилаЧаргаффа. 9. КакиеположениялегливосновумоделивторичнойструктурыДНКУотсонаиКрика? 10. ВчемсостоятразличиявструктуреА, Ви Z-формДНК? 241 11. Вчемзаключаютсяособенности упаковки молекулДНКвклетках? Перечислите особенностиосновныхвидовтретичнойструктурыДНК. 12. Вчемсостоитотличиеструктурно-функциональнойорганизацииРНКотДНК? 13. НакакиеосновныетипыподразделяютРНК? 14. Охарактеризуйтефизико-химическиесвойствануклеиновыхкислот. 15. Какиефакторывызываютденатурациюнуклеиновыхкислотиспомощьюкакихме- тодовиподходовисследуетсяпроцессденатурацииДНК? 16. Начемоснованметодмолекулярнойгибридизациинуклеиновыхкислотикакоезначе- ниеонимеетдлябиологическихисследований? 17. СформулируйтеосновныебиологическиефункцииДНКиРНК. 18. ВчемзаключаетсяважностьАТФициклическихнуклеотидоввбиохимическихпроцес- сах? ЗАДАЧИ 1. Рассчитайтесреднююдлину (вмм) двухцепочечныхмолекулДНК, находящихсяводной клеткеуразличныхпредставителейживотногомира, еслиизвестноколичествонук- леотидныхпар (вмлн.) всоставеклеточнойДНК: а) млекопитающие – 5500; б) амфибии – 6500; в) рыбы – 2000; г) птицы – 2000; д) ракообразные – 2800; е) моллюски – 1100; ж) губки – 100; з) бактерии – 2; и) грибы – 20. 2. Клеткапеченикрысысодержит 9,1·10 12 гДНК. Допуская, чтовсяДНКравномерно распределенамежду 42-мяхромосомамиисуществуютвкаждойхромосомеввиде единоймолекулы, рассчитайтедлинудвухцепочечнойДНК (всм), находящейсяводной хромосоме (числоАвогадро 6·10 23 ). 3. МолекулярнаямассафрагментаДНКравна 500000. Рассчитайтеобъемфрагмента молекулыДНК (внм 3 ) приусловии, чтоонаимеетформуцилиндра. 4. Всоставерибосомыклетки E. coli содержитсяпоодноймолекуле 23S, 16S и 5S РНК. РассчитайтепроцентноесоотношениетрехвидовРНКврибосомекишечнойпалочки. 5. ТемператураплавленияДНКлинейнозависитотсодержанияГЦ-парвеесоставе, и этазависимостьимеетвид: Т пл = 69,3 = А, гдеА – содержаниеГЦ-пар (%). Рас- считайтетемпературуплавленияобразцовДНКвстандартныхсолевыхрастворах, выделенныхизразличныхбактерий, содержаниеГЦ-парвкоторыхсоответственно равно а) 37,6; б) 47,6; в) 55,9; г) 61,0; д) 71,2. 6. ТемператураплавленияДНК, выделеннойизпроростковпшеницы, равна С. РассчитайтесодержаниеГЦ- иАТ-парвпроцентахвэтойДНК (данныео зависимостиТ пл отсодержанияГЦ-парвДНКсм. впредыдущейзадаче). 7. Рассчитайтекоэффициентмолярногопоглощенияаденина, еслираствор, содержащий мкгаденинав 100 млн. раствора NaOH, имеетоптическуюплотность 0,458 при 262 нм 9ширинакюветысоставляет 1 см. Молекулярнаямассааденинаравна 135. 8. Рассчитайтемолярнуюконцентрацию: а) растворагуанина, еслиоптическаяплот- ностьегопри 260 нм, рН = 7,0 равна 0,625; б) растворатимина, еслиоптическая плотностьегопри 260 нм, рН = 7,0 равна 0,075. Ширинакюветысоставляет 1 см. Ко- эффициентмолярногопоглощениягуанинаравен 7,2·10 3 ( л/моль)/см: тимина - 5,4·10 3 ( л/моль)/см. 9. РастворДНК, выделеннойизкишечнойпалочки, имеетоптическуюплотность 0,793 при 260 нм (рН = 4,5, ширинакюветысоставляет 1 см. Коэффициентмолярногопо- глощенияравен 197. ВычислитеконцентрациюДНКивраствореивыразитееевмилли- граммахна 1 млраствора. 10. Водныйраствор, содержащий 500 мг/лнатриевойсолиУТФ, имеетоптическуюплот- ность 1,014 при 262 нм (рН = 7,0). вычислитекоэффициентмолярногопоглощенияна- триевойсолиУТФ (М = 586) приданныхусловиях. 11. Рассчитайтеоптическуюплотность (ширинакюветы 1 см, рН = 7,0) следующихрас- творов: а) 67,5·10 -3 ммоль/лрастворацитозинапри 260 нм б) 9,0·10 -3 ммоль/лраствора 242 урацилапри 260 нм, есликоэффициентымолярногопоглощениядляэтихоснованийпри 260 нм (рН = 7,0) равнысоответственно и 8,2·10 3 ( л/моль)/см. |