Нуклеиновые кислоты- Биорганика. Методичка-Нуклеиновые кислоты. Нуклеиновыекислоты Целое этонечтобольшее, чемсуммачастей
 Скачать 397.55 Kb.
|
|
* ПРАВИЛА ЧАР ГА Ф ФА правило правило правило правило Суммарное содержание пуриновых нуклеотидов равно суммарному содержанию пиримидиновых А + ГЦ+ У + Т Содержание тимина равно содержанию аденина А = Т Содержание гуанина равно содержанию цитозина Г = Ц Количество аденина и цитозина равно количеству гуанина и тимина А + Ц = Г + Т *Такие соотношения несвойственны РНК Величину отношения содержания суммы гуанина и цитозина к сумме содержания аденина и тимина, характеризующего нуклеотидный состав данного вида ДНК, называют коэффициентомспецифичности. Каждая ДНК имеет индивидуальный коэффициент специфичности, который, как правило, изменяется от 0,3 до 2,8. При изучении нуклеотидного состава ДНК были получены данные, которые помогли установить ее пространственную структуру (см. ниже. Наблюдавшийся в конце XX века быстрый прогресс в различных областях молекулярной биологии во многом обусловлен появлением эффективных методов определения первичной структуры ДНК. К таким методам относится селективная химическая модификация различных типов азотистых оснований в составе ДНК с последующим расщеплением межнуклеотидных связей в модифицированных звеньях. Реакции селективной модификации по каждому типу азотистых оснований проводятся таким образом, чтобы в каждой молекуле ДНК в среднем модифицировалось только одно звено данного типа. Поскольку все звенья данного типа в составе молекулы эквиваленты и реагируют с модифицирующим агентом с одинаковыми скоростями, тов суммарном итоге каждое звено этого типа окажется частично модифицированным. Дальнейшая обработка ДНК вторичным амином или щелочью приводит к отщеплению модифицированных азотистых оснований отцепи ДНК и разрыву полинуклеотид- ной цепи в местах отщепления гетероциклов. Все вышеперечисленные операции схематично представлены на рисунке 30. Кроме метода химической модификации нуклеиновых кислот, в настоящее время широко применяется метод секвенирования ДНК с помощью высо- коспецифичных ферментов – рестриктаз на отдельные фрагменты, а также использование ДНК-полимеразы – фермента синтеза ДНК in vivo (см. главу 11 Раздела II и главу 19 Раздела IV). Набор реакций, применяемых в настоящее время для химической модификации ДНК, достаточно велики его рассмотрение выходит за рамки материала настоящего пособия. 228 Т Т Ц Ц А Г Разрыв цепиДНК Т Т Ц Ц А Г Г Т Т Ц Ц СН 3 А Г Г Т Т Ц Ц А Г ФрагментДНК Модификация азотистого основания Отщеплениеили замещение модифицированного основания Рис. 30 Селективная химическая модификация азотистых оснований в молекуле ДНК ВторичнаяструктураДНК. Расшифровка вторичной структуры ДНК – одно из крупнейших открытий молекулярной биологии, поскольку благодаря ему был раскрыт механизм передачи наследственной информации в ряду поколений. В 1953 г. американский биохимик Д. Уотсон и английский физик Ф. Крик на основании большого числа экспериментальных данных (картины дифракции рентгеновских лучей на нити ДНК) предложили модель структуры молекулы ДНК, существующей вводном растворе. В основе модели Уотсона и Крика заложены следующие основные положения 1. Молекулы ДНК построены из двух полинуклеотидных цепей, ориентированных антипараллельно и по всей длине связанных друг с другом водородными связями (причем в образовании водородных связей участвует каждый мононуклеотид). 2. Водородные связи между цепями образуются за счет специфических взаимодействий остатка аденина одной цепи с остатком тимина другой цепи пара АТ) и остатка гуанина одной цепи с остатком цитозина другой цепи (па 229 пара ГЦ. Образование водородных связей в парах АТ и ГЦ показано на рисунке 31. 1,08 нм нм N N N N N H H N H 3 C O N O H N N H N O N N H H N N O N H H ..... ПараАТ ПараЦГ ..... Рис. 31 Комплементарные пары азотистых оснований, стабилизирующие двойную спираль ДНК Основания, образующие пару, являются комплементарными друг другу в том смысле, что возникновение водородных связей между ними наиболее вероятно, чем при других сочетаниях (например, Ас Г или A с Ц. Комплементарность объясняется эффектами функциональных заместителей, которые имеют различное геометрическое расположение относительно плоскости гетероциклического кольца, а также пространственной структурой молекулы ДНК в целом. 3. Первичная структура одной цепи молекулы ДНК в составе двойной цепи комплементарна первичной структуре другой цепи. Это положение легко понять на примере следующей схемы (5 ′3′) АТ Т – Ц – Т – Ц – ГЦ Г – Г M M M M M M M M M M M T– A – A – ГГЦ ГЦ Ц (3 ′5′) Если в положении n (считая с конца) первой цепи находится остаток аденина, тов положении n (считая с конца) второй цепи находится комплементарный ему остаток тимина, а не другое азотистое основание. Таким образом, зная первичную структуру одной цепи ДНК и используя принцип комплементарности азотистых оснований, можно легко записать первичную структуру другой цепи. 4. Обе цепи закручены в спираль – двойнаяспираль или дуплекс, которая имеет общую ось (рис. 32). При этом цепи могут быть разделены только путем раскручивания (такие спирали называют плектонемическими). Азотистые основания обращены внутрь спирали их плоскости перпендикулярны оси спирали и параллельны друг другу, образуя внутри спирали стопку оснований. Между основаниями в этой стопке возникают гидрофобные, или стэкинг- взаимодействия, которые, наряду с водородными связями, способствуют стабилизации структуры двойной спирали в пространстве. Азотистые основания упакованы очень плотно и не контактируют с окружающим водным раствором. Пентозофосфатные части располагаются по периферии, образуя ковалентный остов спирали с обращенными наружу гидрофильными фосфатными группами, как правило, ионизированными в условиях рН физиологических жидкостей. Именно взаимодействие гидрофильных пентофосфатных групп с окружающим водным раствором определяет степень гидратации молекул ДНК. В зависимости от степени гидратации молекулы ДНК могут существовать в двух формах Аи В. А-форма (кристаллическая) существует при условии, когда содержании воды не превышает 40% и образуется при дегидратации В-формы ДНК. Один оборот спирали ДНК в А-форме содержит примерно 11 нуклеотидов. В-форма (паракристалли- ческая) представляет собой классическую уотсон- криковскую двойную спираль, содержащую примерно нуклеотидов на один оборот спирали. Образование В-формы наблюдается в более разбавленных растворах, те. когда содержание воды превышает 40 %. Две эти формы отличаются не только числом нуклеотидов на один оборот спирали, но и другими структурными особенностями. Предположительно, in vivo преобладает В-форма ДНК. Обнаружена еще и форма ДНК, модель которой была предложена А. Ричем и его сотрудниками. форма представляет собой лево- закрученную двуспираль- ную ДНК, содержащую 12 нуклеотидов на один оборот спирали. Предполагается, что форма ДНК участвует в процессе кроссинговера эукариота также в регуляции генной активности. ТретичнаяструктураДНК. В частицах вирусов, клетках бактерий и высших организмов, молекулы ДНК плотно упакованы и образуют довольно сложные структуры. Например, в хромосоме E. coli содержится молекула ДНК Рис. 32 Схематичное изображение двойной спирали ДНК 231 длиной более 1 мм, хотя длина самой клетки не превышает 5 мкм. Вирусную ДНК можно отнести к сравнительно мелким полимерным биомолекулам, но если ее вытянуть, то она окажется во много раз длиннее, чем сам вирус. Сопоставление среднего диаметра молекулы гемоглобина (65 Ǻ), длины молекулы одного из самых длинных белков – коллагена (3 000 Ǻ) с длиной молекулы ДНК подчеркивает огромные размеры молекул нуклеиновых кислот. Для измерения длины молекул нуклеиновых кислот в биохимии введена специальная единица длины, равная 1 000 пар нуклеотидов в случае двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот – т.п.н. или kb (от англ. kilobase – тысяча) или 1000 нуклеотидов в случае одноцепочечных молекул – т.н. или kb. Так единица длины одноцепочечной ДНК величиной в 1 kb имеет контурную длину 0,34 мкм и массу около 660 000. Выделенные из вирусных частиц молекулы ДНК имеют либо линейную, либо кольцевую форму. Линейные молекулы ДНК in vivo свертываются в плот- ныйклубок. В таком состоянии они более устойчивы к деградации. Например, кольцевая форма ДНК находится в фаге ϕΧ174. Кольцевую ковалентно- связанную структуру имеют двухцепочечные ДНК бактерий, вирусов, плазмид, митохондрий и др. Двухцепочечные кольцевые ДНК легко переходят в супер- спирализованноесостояние, которое обеспечивает более плотную упаковку громадной молекулы ДНК в малом объеме ядра или клетки. Представление о возможных третичных структурах ДНК дает рисунок 33. Рис. 33 Третичная структура молекул ДНК а – линейная б – кольцевая в – суперспирализованная (суперкольцевая); г – компактный клубок Третичная структура ДНК эукариот также проявляется в многократной суперспирализации молекулы, однако, в отличие от прокариот, она осуществляется в составе комплексов ДНК с белками (нуклеопротеины). Основная нук- леопротеиновая структура, содержащая ДНК – это хроматин (дезоксирибонук- леопротеин). Структурная организация хроматина сложна и изучена далеко не полностью. Примерно 2 / 3 массы хроматина приходится на белки, остальное количество на ДНК. Кроме того, в состав хроматина входит до 10% РНК. Половина всех белков хроматина – это гистоны. На электронно-микроскопических 232 фотографиях хроматина легко можно рассмотреть образования, напоминающие бусы. Каждая бусина содержит 8 молекул гистонов и намотанную на них (примерно полтора витка) молекулу ДНК длиной около 150 нуклеотидных пар. Такую структуру называют нуклеосомой (рис. 34). При таком способе укладки длина молекулы ДНК уменьшается примерно враз по сравнению с вытянутой спирализованной молекулой. Рис. 34 Схема укладки молекул ДНК в хромосомах Длина молекул ДНК в среднем составляет около 3–5 см, а длина хромосом всего несколько микрометров. Следовательно, степень укладки ДНК в хромосомах благодаря дополнительному скручиванию нуклеосомной нитки бус достигает нескольких тысяч. Высшие уровни укладки ДНК еще недостаточно хорошо изучены. В препаратах ДНК, выделенных из природных объектов, в малых количествах обнаруживаются кремний, магний, кальций, стронций и ряд других микроэлементов, которые, по-видимому, участвуют в стабилизации пространственной структуры ДНК. Предполагают также, что в некоторых случаях кремний в форме кремниевой кислоты может заменять фосфатные остатки в молекуле ДНК, что, по-видимому, играет некую биологическую роль. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯОРГАНИЗАЦИЯМОЛЕКУЛРНК В связи стем, что молекулы РНК имеют одноцепочечную структуру, их состав, в отличие от ДНК, не подчиняется правилам Чаргаффа. Поэтому, как вторичная, таки третичная структуры РНК нерегулярны построению. Поскольку все РНК являются копиями одной из цепей ДНК, то копирование участков, содержащих палиндромы, те. последовательности нуклеотидов, повторяющихся в обратном порядке, приводит к образованию так называемых шпилек в молекулах РНК. Молекулы РНК, в отличие от ДНК, отличаются большим структурными функциональным разнообразием. По особенностям строения и выполняемым биологическим функциям различают три основные типа РНК 1. Рибосомные РНК (рРНК) – компоненты рибосом. На долю рРНК приходится около 80% всей РНК клетки. Обнаружено 3 вида рРНК: 28S-рРНК, молекулярная масса около 1,5 млн. (содержит примерно 4000 нуклеотидных остатков 18S-рРНК, молекулярная масса около 700 000; 5 S-рРНК, молекулярная масса около 30 000 (примерно 100 нуклеотидных остатков. Молекула рРНК 233 имеет вторичной структуры в виде спиральных участков, соединенных изогнутой одиночной цепью (рис. 35). Третичная структура рРНК имеет форму палочки или клубка и составляет скелет рибосомы. Снаружи на нее нанизываются рибосомные белки. 2. Транспортные РНК (тРНК) составляют около 15% всей клеточной РНК. Обнаружено около десятка видов тРНК, различающихся по первичной структуре. Молекулярная масса тРНК составляет около 25 000. Характерной особенностью тРНК является наличие в ней редких (минорных) оснований. Вторичная структура тРНК имеет вид клеверного листа (рис. 36). Она образуется вследствие внутрицепочечного комплементарного спаривания нуклеотидов отдельных участков тРНК. Участки тРНК, не образующие водородных связей между нуклеотидами, в пространстве организуются в петли или в линейные звенья. В молекуле тРНК выделяют следующие участки ак- цепторныйучасток, состоящий из х линейно расположенных нуклеотидов анти- кодоноваяпетля, обычно образуемая ю нуклеотидами псевдоуридиловаяпетля, состоящая из 7 нуклеотидов и обязательно содержащая остаток псевдоуридиловой кислоты петля, состоящая обычно из 8-10 нуклеотидных остатков, среди которых обязательно имеется несколько остатков дигидроурацила; доба- вочнаяпетля, которая различна по размерами составу у разных тРНК. Третичная структура тРНК уже имеет форму не клеверного листа, а локтевогосгиба, так как лепестки петель клеверного листка заворачиваются на тело молекулы, удерживаясь дополнительными внутримолекулярными ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями. 3. Матричные РНК (мРНК) составляют около 2% от всей РНК клетки. Имеется огромное количество мРНК, которые различаются по первичной структуре. Причем такое разнообразие мРНК не меньше, чем число белков в организме. Вторичная структура мРНК представляет собой изогнутую цепь, а третичная подобна нити, намотанной на катушку, роль которой играет особый транспортный белок – информофер. Рис. 35 Вторичная структура рРНК Антикодоновая петля Добавочная петля 5 , 3 , D- петля Акцепторный участок Псевдоуридиловая петля Рис. 36 Вторичная структура тРНК 234 ХИМИЧЕСКИЙСИНТЕЗПОЛИНУКЛЕОТИДОВ Вопросы разработки методов синтеза олиго- и полинуклеотидов в последнее время привлекают большое внимание исследователей. Это связано стем, что синтетические олигонуклеотиды стали использоваться для идентификации фрагментов природных нуклеиновых кислот, изучении их химических свойства также как инструмент исследования в молекулярной биологии и молекулярной генетике (для расшифровки генетического кода, функционирования генома, процессов взаимодействий нуклеиновых кислот с белками, в том числе ферментами нуклеинового обмена, антибиотиками и т.д.). При разработке методик химического синтеза полидезоксирибо- и поли- рибонуклеотидов перед химиками-синтетиками встают те же проблемы, что ив синтезе полипептидов. Подбор условий оптимального синтеза направленна достижение высоких выходов на отдельных стадиях в последовательности превращений, включающей процессы последовательного наращивания полинук- леотидной цепи, исключающие случайное присоединение мономеров введения на каждой из стадий защитных групп для предотвращения побочных реакций стадии конденсации и деблокирования. Например, в синтезе рибонуклеотидов часто требуется блокировать одну из вторичных гидроксильных групп в положении, что делает возможным селективное фосфорилирование соседней вторичной гидроксильной группы в положении –3′. Рассмотрим теоретические основы некоторых приемов, используемых в синтезе полинуклеотидов. Блокирование аминогруппы аденина, гуанина или цитозина может оказаться необходимым для предотвращения образования фосфамидов при фосфорилировании. В настоящее время для блокирования аминогрупп азотистых оснований используют ацильную, N-диметиламинометиленовую и другие группы. Блокирование гидроксильной группы пентозы наиболее важно для сведения к минимуму выхода побочных продуктов и изомеров. С этой целью используют монометокситритильную, ацильную, трет-бутилдиметилсилильную, тетрагидропиранильную и другие защитные группы. Блокирование фосфатных групп осуществляется введением 2,2,2-трихлорэтильной, ароматических (остатков фенола, о-фенола, анилина) и других групп. После завершения реакции синтеза защитные группы можно удалить в мягких условиях, не затрагивающих целостности фосфодиэфирной связи. Образование фосфодиэфирной связи – термодинамически невыгодный процесс, поэтому для его осуществления необходимо сначала перевести нуклеотиды в активное состояние, а затем ввести конденсирующий агент, способный активировать фосфатную группу. Чаще всего исходными соединениями при образовании фосфодиэфирной связи служат нуклеозид-3′-фосфат и нуклео- зид со свободной ОН группой. В этом случае фосфорилируется более реакционно способная первичная гидроксильная группа. Для фосфорилирования нуклеозида, как правило, применяют хлорфосфаты. Твердофазный синтез олигонуклеотидов не достиг такого же высокого уровня, как твердофазный синтез полипептидов из-за проблем, связанных с подбором подходящей нерастворимой матрицы. Практическим стимулом для развития твердофазного синтеза полидезоксирибонуклеотидов послужило их 235 промышленное использование в генной инженерии, те. в технологии рекомбинантных ДНК (см. главу 19 Раздела IV). ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕСВОЙСТВАНУКЛЕИНОВЫХКИСЛОТ Уникальные биохимические и физико-химическими свойства нуклеиновых кислот определяются высокой молекулярной массой, особенностями химического состава и структурной организации на различных уровнях надмолекулярного строения. Среди характерных физико-химических свойств нуклеиновых кислот (и их растворов) следует выделить самые главные кислотно-основныесвойства, хелатирующуюспособность, способностькденатурации; оптические, коллоидные, осмотическиесвойства и высокуювязкость растворов. Кроме того, нуклеиновые кислоты в среде живой клетки могут находиться в жидкокристаллическом состоянии, что является крайне важным при описании их биохимических свойств. При растворении вводе нуклеиновые кислоты набухают и образуют вязкие коллоидного типа растворы. Растворимость нуклеиновых кислот главным образом определяется гидрофильностью фосфатных группа также особенностями надмолекулярной упаковки. Кислотно |