Учение о вирусах. учение о вирусах. Облигатные внутриклеточные паразиты
 Скачать 2.82 Mb.
|
|
! ! ! Вирусы (лат. virus - яд) – неклеточные формы жизни, обладающие собственным геномом, способные к воспроизведению в клетках более высокоорганизо- ванных существ ( облигатные внутриклеточные паразиты ). 1798 – применение вакцин против оспы – Jenner ( Эдуард Дженнер) 1885 – применение вакцин против бешенства – Pasterus ( Луи Пастер) 1892 – открытие принципиально нового типа филь- трующихся и инфекционных агентов, особой структурной организации в микромире – ви- русы растений, вирусы табачной мозаики – Дмитрий Иосифович Ивановский 1898 – открытие возбудителя ящура – вирусы животных 1911 – открытие онкогенных вирусов - Раус 1917 – открытие бактериофагов – Феликс д‘Эрелль ХХ век – открытие возбудителей известных забо- леваний человека и новых вирусов I гипотеза: Вирусы – это потомки древних до- клеточных форм жизни, остановив- шихся в своем развитии на опреде- ленном этапе. II гипотеза: Вирусы – потомки бактерий или др. одноклеточных организмов, по неизвестным причинам двинувшие- ся в своем развитии вспять, дегра- дировавшие. III гипотеза «взбесившихся генов»: Вирусы – составные части клеток живых существ по неизвестным причинам ставшие автономными системами. 1. Чрезвычайно малые размеры – проходят через бактериальные фильтры, можно увидеть лишь в электронный микроскоп. Размеры можно определить при электронной микроскопии, методом ультрацентрифугирования, методом ультрафильтрации через фильтры с известным d пор. 2. Не имеют клеточного строения – неклеточные формы жизни. 3. Содержат только один тип нуклеиновых кислот – ДНК или РНК. 4. Отсутствует обмен веществ и ферменты обмена , могут содержать ферменты инвазивности для проникновения и размножения внутри клеток. ! 5. Являются абсолютными внутриклеточными паразитами – не растут на питательных средах, их культивируют в организме животных, куриных эмбрионах, специальных культурах клеток, т.е. в живых клетках с повышенным обменом веществ – тканевые культуры . 6. « Генетические паразиты »: дезорганизуют работу клеточных систем синтеза белка и НК. 7. Характерен особый способ размножения – репродукция ( разобщенный или дизъюнк- тивный): образуются составные части вируса, затем происходит их «сборка» в зрелую вирусную частицу ( вирион ). 1) внеклеточная или вирион, 2) внутриклеточная или вегетативная форма, 3) внутриклеточная – неразмножающаяся – провирус Атрибуты жизни вирусов: 1. Обладают способностью к размножению – репродукция. 2. Характеризуются определенной наследствен- ностью, воспроизводя себе подобных. 3. Характерно наличие изменчивости. При этом у вирусов можно наблюдать как генотипическую изменчивость, связанную с изменением на- следственного вещества, так и фенотипическую изменчивость, связанную с проявлением одного и того же генотипа в разных условиях. 4. Приспособляемость к условиям внешней среды. 5. Наличие определенной экологической ниши в биосфере. Каждый вирус имеет круг естественных хозяев. Он может быть очень широким (при бешенстве поражаются все млекопитающие) или очень узким. ! Циркуляция вирусов может происходить со сменой хозяев ( арбовирусы – вирусы, переда- ваемые членистоногими – флавивирусы (вирус желтой лихорадки, вирус клещевого энцефалита), робовирусы – вирусы, передаваемые грызу- нами - вирус ГЛПС) или без нее (вирус кори) ! Циркуляция вирусов может быть: 1) горизонтальной – распространение среди популяции хозяев, 2) вертикальной – распространение от родителей потомству: а) через хромосомы клеток (ретровирусы) б) через плаценту (вирусы краснухи, кори, ветряной оспы) – дети с врожденными уродствами ! Классическая триада врожденной краснухи – катаракта, глухота, пороки сердца в) при прохождении плода через инфицированный родовой канал (герпесвирусы, папилломавирус, ретровирус) 6 Вирусы способны к эволюции, движущей силой которой является естественный отбор. 7. На вирусы, вызывающие болезни человека, полностью распространяются закономерности инфекционного процесса. свидетельствуют следующие факты: 1. Наличие у ряда вирусов фрагмен- тированного генома : реовирусы, миксовирусы, у которых геном состоит из нескольких фрагментов, заключенных в один вирион. 2. Наличие у ряда вирусов растений разобщенного генома Геном у них фрагментирован, разобщен и помещен в разные вирусные частицы. 3. Наличие интеграбельных вирусов Для них понятие определенной особи становится бессмысленным на стадии, когда вирусный геном превращается в группу клеточных генов ! 4. Наличие вироидов – частиц, представленных низкомолекулярной кольцевой суперспирализованной РНК (м.м. = 110-140 Кд). 5. Наличие вирусов – сателлитов Примером среди вирусов животных могут служить аденосателлиты Геном их состоит из однониточной ДНК с мол. массой 1,5-1,8·10´Д. Вирусы не способны к репродукции без участия аденовируса, но имеют собственные белки. 1 – нуклеиновая кислота , 2 – белковая оболочка – капсид , состоящий из отдельных белковых молекул – капсомеров. Выделяют 3 типа симметрии: а) спиральный, б) икосаэдрический,в) смешанный, 3 – внешняя оболочка – суперкапсид : липопротеидная оболочка с включениями гликопротеидов и белков в виде «шипиков» 4 – мембрана или матрикс , состоящий из М- белка 5 – сердцевина – соr: состоит из НК и внутренних белков 1. По тропизму к определенным тканям: - нейротропные (вирус клещевого энцефалита), - дермотропные (вирус оспы), - пневмотропные (вирус гриппа), - пантропные (во многих тканях – вирус паротита); 2. По механизму проникновения в организм хозяина: - кишечные вирусы – 82 представителя, - респираторные – 174 представителя, - трансмиссивные – 400 представителей, из них 1/3 патогенны для человека, - инфекции наружных покровов – 32 вируса ! 3. В зависимости от хозяина: - вирусы бактерий – бактериофаги, - вирусы растений, - вирусы беспозвоночных, - вирусы позвоночных животных, - вирусы человека; 4. По способности вызывать заболевания у человека и животных (по Громашевскому): - антропонозные инфекции, свойственные только человеку (вирус кори, вирус краснухи), - зоонозные вирусные инфекции, свойственные только животным (вирус чумы уток), - зооантропонозные вирусные инфекции (вирус ящура, бешенства) 5. По форме: - палочковидные (вирус везикулярного стоматита), - сферические (вирус полиомиелита, ротавирус, вирус краснухи, ВИЧ) - нитевидные (филовирусы – вирусы Марбург и Эбол) - пулевидные (вирус бешенства), - овоидные (вирус натуральной оспы - поксвирус) 6. По величине: - большие-гиганты (вирус оспы) - средние - мелкие-карлики (вирус полиомиелита) Аденовирус Вирус полиомиелита 7. По содержанию НК: 1. РНК-содержащие: 1 - с положительным (плюс-нить РНК) геномом, выполняет наследственную функцию и функцию иРНК. 2 - с отрицательным (минус-нить РНК) геномом, выполняет только наследственную функцию. 2. ДНК-содержащие. 8. По наличию cуперкапсида: - простые: НК+капсид (вирус гепатита А) - сложные: НК+капсид+суперкапсид (вирусы гепатита В, гриппа, герпеса и др.) Белки вирусов: Выделяют 4 группы вирусспецифических белков: 1 гр. - белки капсидов и суперкапсидов – это структурные белки. 2 гр. – связывающие белки или прикрепительные : выполняют структурную и функциональную роль. Некоторые являются ферментами, участвуют в прикреплении и проникновении в чувствительные клетки. 3 гр. – ферменты, связанные с вирионом и участвующие в процессах транскрипции ( внутренние белки). 4 гр. – ферменты, репрессоры и другие белки: не входят в состав вириона, кодируются геномом вируса, могут экспрессироваться на поверхности зараженных клеток и выделяться в кровь. ! Функции белков вирусов: 1 - защитная функция 2 - антигенная функция: антигенами являются белки капсида, суперкапсида и др. Их относят к тимусзависимым антигенам. 3 - ферментативная функция: вирусы не обладают обменом веществ, но содержат ферменты, необходимые для проникновения в чувствительные клетки и для репродукции. 4 - репрессорная функция: белки оболочки могут действовать как репрессоры на уровне трансляции или транскрипции - прекращается синтез белка клетки или вируса 5 - рецепторная функция: ее выполняют прикрепительные белки вирусов 6 - токсическая: повышают проницаемость сосудов, пирогенное действие, могут обладать свойствами суперантигенов. ! Нуклеиновые кислоты составляют 1-50% веса вируса. У вирусов различают 4 типа нуклеиновых кислот: 1 - двунитчатая ДНК 2 - однонитчатая ДНК 3 - двунитчатая РНК 4 - однонитчатая РНК: 1) плюс-нитевая РНК 2) минус-нитевая РНК ! В структуре вирусной частицы различают несколько групп антигенов : • ядерные (или кордовые), • капсидные (или оболочечные) • суперкапсидные . •на поверхности ряда вирусов ( вирус гриппа ) встречаются V- антигены – гемагглютинин и нейраминидаза Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты, способные к размножению только в живых клетках. Различают 3 типа взаимодействия вируса с клеткой: 1. Продуктивный тип : характеризуется образованием нового дочернего поколения вирионов и заканчивается: - гибелью зараженных клеток – цитолитическая форма, - выходом потомства без гибели клетки – нецитолитическая форма. 2. Абортивный тип : не завершается образованием новых вирионов, инфекционный процесс в клетке прерывается на каком-то этапе. 3. Интегративный тип или вирогения – харак- теризуется встраиванием – интеграцией вирусной ДНК в виде провируса в хромосому пораженной клетки и их совместным сосуществованием и совместной репликацией. В результате: а) не образуются новые вирионы, б) вирусный геном может передаваться дочерним клеткам, в) может развиться опухолевая или неопластическая трансформация клетки в результате нарушений в деятельности регуляторных механизмов, контролирующих деление. 1. Адсорбция вируса на клетке. 2. Проникновение вируса в клетку путем эндоцитоза (виропексис) или путем слияния оболочки вируса с клеточной мембраной. 3. Раздевание. 4. Транскрипция вирусного генома. 5. Трансляция вирусных информационных РНК и синтез вирусных белков. 6. Репликация вирусной ДНК или РНК. 7. Сборка вирусной частицы. 8. Выход вирусов из пораженной клетки путем «взрыва» или почкованием. 1. Двунитевые ДНК-вирусы !. Репликация происходит полуконсервативным меха- низмом: после расплетения нитей ДНК к ним комплементарно достраиваются новые нити. Каждая вновь синтезированная молекула ДНК состоит из 1-й родительской и 1-й синтезированной нити. К этим вирусам относится большая группа вирусов, которые содержат двунитевую ДНК в линейной ( герпесвирусы, аденовирусы и поксвирусы) или в кольцевой форме (папилломавирусы) У этих вирусов, кроме поксвирусов, транскрипция вирусного генома происходит в ядре, у поксвирусов за счет собственной РНК-полимеразы – в цитоплазме клетки. ! Уникальный механизм репликации у вируса гепатита В. Геном гепаднавирусов представлен двунитевой кольцевой ДНК, одна нить которой короче другой нити (неполная плюс-нить) и сначала она достраивается. Затем полная двунитевая ДНК с помощью клеточной РНК-полимеразы транскрибируется с образованием небольших молекул иРНК и полной однонитевой плюс-РНК (прегеномная РНК – матрица). Синтезированные иРНК участвуют в процессе трансляции белков, в т.ч. вирусной РНК-зависимой ДНК-полимеразы ( обратной транскриптазы ), с помощью которой мигрирующая в цитоплазму прегеномная РНК обратно транскрибируется в минус-нить ДНК – матрицу для синтеза плюс-нити ДНК. Процесс заканчивается образованием двунитевой ДНК, содержащей неполную плюс-нить. ! Однонитевые ДНК-вирусы Единственные представители – парвовирусы Используют клеточные ДНК-полимеразы для создания двунитевого вирусного генома – репликативной формы. На исходной вирусной ДНК (плюс-нить) комплементарно синтезируется минус-нить ДНК (матрица для синтеза плюс-нити ДНК нового вириона). Параллельно синтезируется иРНК с трансляцией вирусных пептидов. ! Плюс-однонитевые РНК-вирусы. Большая группа – пикорнавирусы, флавивирусы, тогавирусы , у которых геномная плюс-нить РНК выполняет функцию иРНК. РНК полиовирусов после проникновения в клетку связывается с рибосомами, работая как иРНК, и на ее основе синтезируется большой полипептид , который расщепляется на фрагменты : РНК-зависимую РНК- полимеразу , вирусные протеазы и капсидные белки Полимераза по геномной плюс-нити РНК синтезирует минус-нить РНК; формируется временно двойная РНК – промежуточное репликативное звено (полная плюс- нить РНК и много частично завершенных минус-нитей). Когда образованы все минус-нити, они используются как шаблоны для синтеза новых плюс-нитей РНК. Этот механизм используется для размножения геномной РНК вируса и для синтеза вирусных белков. ! Минус-однонитевые РНК-вирусы Рабдовирусы, парамиксовирусы, ортомиксовирусы имеют РНК-зависимую РНК-полимеразу Проникшая в клетку геномная минус- нить РНК трансформируется вирусной РНК- зависимой РНК-полимеразой в неполные и полные плюс-нити РНК Неполные копии выполняют роль иРНК для синтеза вирусных белков. Полные копии – матрица (промежуточная стадия) для синтеза минус-нитей геномной РНК потомства. ! Двунитевые РНК-вирусы Механизм репликации этих вирусов ( реовирусов и ротавирусов ) сходен с репликацией минус- однонитевых РНК-вирусов. Отличие состоит в том, что образовавшиеся в процессе транскрипции плюс-нити функционируют не только как иРНК , но и участвуют в репликации – матрицы для синтеза минус-нитей РНК. Последние в комплексе с плюс- нитями РНК образуют геномные двунитевые РНК вирионов. Репликация вирусных НК происходит в цитоплазме клеток. ! Ретровирусы (плюс-нитевые диплоидные РНК- содержащие вирусы) Обратная транскриптаза синтезирует (на матрице РНК-вируса) минус-нить ДНК , с которой копируется плюс-нить ДНК с образованием двойной нити ДНК , замкнутой в кольцо. Далее двойная нить ДНК интегрирует с хромосомой клетки, образуя провирус. Многочисленные вирионные РНК образуются в результате транскрипции одной из нитей интегрированной ДНК при участии клеточной ДНК- зависимой РНК-полимеразы. ! Для лабораторной диагностики вирусных инфекций используют методы: 1) вирусоскопи- ческий, 2) вирусологический, 3) серологический, 4) молекулярно-генетический, 5) биологический. 1) Световая микроскопия позволяет обнаружить вирусные включения, электронная микроскопия - вирионы, по особенностям их строения диагностировать соответствующую инфекцию (пример, ротавирусную). 2) Вирусологическое исследование включает 3 этапа: 1. заражение исследуемым материалом, 2. индикацию вируса, 3. идентификацию вируса. Используют заражение лабораторных животных, куриных эмбрионов, культур тканей ( первичные,полуперевиваемые,перевиваемые ). ! Типы культур клеток: 1) первичные культуры, способные к 5-10- кратному пассированию – эмбриональные клетки; 2) полуперевиваемые - морфологически однородные клетки легких и почек человека, сохраняющие в 50-100 пассажах диплоидный набор хромосом; 3) неограниченно перевиваемые ( опухолевые клетки). Первичные культуры клеток. Источником получения первичных культур клеток являются обладающие большой потенцией роста эмбриональные ткани птиц (главным образом куриные фибробласты), экспериментальных животных, обезьян, но чаще всего готовят их из трипсинизированных тканей абортированных 8- 14- недельных плодов человека. Перевиваемые культуры клеток. Это стабильные или иммортализованные (бессмертные) линии клеток, автономно размножающиеся. Получают их из нормальных тканей человека (амниона - FL, А-0, А-1; почек - Rh, 1ШЧ, диплоидных клеток); животных (почек обезьян - Vero, MS, BSC-1; почек кролика - ПК и его роговицы -SIRK) и из злокачественных опухолей (шейки матки- HeLa, гортани - НЕр-2, полости рта - KB, костного мозга человека - Д-6 и др.), которые выращиваются путем последовательных пассажей на питательных средах. Эти типы клеток выращивают при температуре 36-37 °С в ультратермостатах, получая в течение 5-7 суток хороший монослой в виде пласта, сцепленного со стенками матрацев, флаконов и пробирок. ! Индикация вирусов: 1) в реакции гемадсорбции (РГАд), основанной на способности клеток, в которых вирусы репродуцируются, адсорбировать эритроциты. Для ее постановки в культуру клеток, зараженную вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток прилипают эритроциты, что видно при микроскопии. 2) в реакции гемагглютинации (РГА), применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллан- тоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. 3) при электронной микроскопии , 4) по ЦПД (при световой микроскопии могут определяться погибшие клетки, симпласты, синцитий, внутриклеточные включения), 5) при цветной пробе, 6) методом бляшкообразования, 7) при иммунофлюоресценции ! Цветная проба основана на разнице в цвете среды с индикатором фенолрот, в которой растет жизнеспособ- ная культура клеток, и среды, где находится культура, зараженная вирусом. В процессе роста и размножения клеток тканевой культуры накапливаются кислые продукты обмена веществ, что приводит к сдвигу рН в кислую сторону. Среда с фенолрот, первоначально имевшая красный цвет (исходное значение рН 7,4-7,6), вследствие снижения рН до 7,0-6,8 приобретает желтый цвет . Заражение культуры клеток вирусом приводит к развитию в ней дегенеративных процессов: подавление метаболизма, значительно снижается гликолиз, в результате чего кислых продуктов накапливается мало, рН среды не изменяется и среда с фенолрот остается красного цвета. По сохранению красного цвета среды или переходу его в желтый можно судить о наличии или отсутствии вируса в исследуемом материале, внесенном в культуру клеток С помощью цветной реакции можно определить соответствие вируса и вируснейтрализующей сыворотки, если их предварительно смешать и эту смесь после инкубации внести в культуру клеток. Специфическая сыворотка нейтрализует вирус и он не оказывает ЦПД на клетки культуры. Поэтому клетки продолжают нормально жить и размножаться, что приводит к переходу среды в желтый цвет. Т.о., цветную реакцию используют: 1) для выявления вируса и его титрования; 2) с целью идентификации вируса по нейтрализующему действию специфической сыворотки; 3) для обнаружения и титрования вирус нейтрализующих антител в исследуемых сыворотках. Цветная проба получила широкое применение в диагностике полиомиелита, при инфекциях, вызываемых вирусами Коксаки А и В, ECHO, аденовирусами и некоторыми арбовирусами. Идентификацию выделенного вируса до уровня семейства можно провести с помощью определения : - типа нуклеиновой кислоты ( проба с бромдезоксиуридоном ), - особенностей строения НК ( электронная микроскопия ), - размером вириона ( фильтрование через мембранные фильтры с порами диаметром 50 и 100 нм ), - наличия суперкапсидной оболочки ( проба с эфиром ), - гемагглютининов ( реакция гемагглютинации ), - типа симметрии нуклеокапсида ( электронная микроскопия ). Идентификацию вирусов (до рода, вида, внутри вида) можно провести с помощью определения : - антигенного строения ( реакция нейтрализации с соответствующими иммунными сыворотками ). Сущность этой реакции состоит в том, что после обработки гомологичными антителами вирус утрачивает свою биологическую активность и клетка хозяина развивается так же, как и неинфицированная вирусом. Об этом судят по отсутствию ЦПД, отриц. ЦП, результатам реакции торможения гемагглютинации (РТГА), отсутствию изменений при заражении куриных эмбрионов, выживаемости чувствительных животных. Серодиагностика и иммуноиндикация реализуются в реакциях: радиоизотопный иммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакция связывания комплемента (РСК), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и других. Обязательно исследуются парные сыворотки. При этом четырехкратное нарастание титра антител во 2-й сыворотке в большинстве случаев - показатель протекающей или свежеперенесенной инфекции. При исследовании одной сыворотки, взятой в острой стадии болезни, диагностическое значение имеет обнаружение антител класса IgМ, свидетельствующее об острой инфекции. |