ОЦЕНКА ПРОЛИФЕРАТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА КЛЕТОК В РЕГЕНЕРАЦИОННОМ ГИСТ. Оценка пролиферативного потенциала клеток в регенерационном гистогенезе кожи
 Скачать 26.33 Kb.
|
|
ОЦЕНКА ПРОЛИФЕРАТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА КЛЕТОК В РЕГЕНЕРАЦИОННОМ ГИСТОГЕНЕЗЕ КОЖИ Процесс деления клеток во всех тканях организма направлен на восстановление или увеличение количества клеток, составляющих структуры этих тканей (Н. Н. Картамышева с соавт., 2003). Клеточный цикл состоит из 4 периодов: пресинтетического (G1), синтетического (S), постсинтетического (G2) и митоза (М). Также существует G0-период, при котором клетки находятся в состоянии покоя. В G1-периоде ядра клеток имеют диплоидное содержание ДНК. Этот период характеризуется началом роста клеток за счет накопления клеточных белков, так как происходит увеличение содержания в клетке РНК, а также запускается процесс подготовки к синтезу ДНК. В последующем S-периоде в ядре удваивается количество ДНК и хромосом. G2-период называется также премитотическим. В этот период происходит активный синтез матричной РНК. Далее следует деление клетки надвое или митоз (А. С. Чиж, 1998). В последнее время многие авторы занимаются вопросами исследования клеточной пролиферации, которая имеет большое значение при многих видах патологии (Е. Б. Владимирская, 2001; В. М. Погорелов, Г. И. Козинец, 2004). Все методики по определению пролиферативной активности выявляют отдельные клетки, которые находятся в той или иной фазе клеточного цикла (Л. И. Аруин с соавт., 1998). В настоящее время в связи со значительными успехами в молекулярной биологии и иммунологии появилась возможность иммуноцитохимически маркировать клетки, проходящие различные фазы клеточного цикла. (Д. Э. Коржевский с соавт., 2014). Самыми известными цитологическими маркерами клеточной пролиферации являются: 1) фигуры митозов в препаратах; 2) способность пролиферирующих клеток включать меченный тритием тимидин (3H-тимидин), другие радиоактивно меченые предшественники или аналог пиримидина – бромдезоксиуридин (Г. И. Козинец с соавт., 2002); 39 3) окрашивание препаратов по методу Фельгена (В. М. Котельников, 1991) и цитофотометрический анализ распределения клеток по фазам митотического цикла; 4) ДНК-цитофлюориметрия с анализом клеточных популяций, при помощи проточной цитометрии (Д. А. Шмаров с соавт., 2011), конфокальной микроскопии и других методов; 5) уровень экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA), антигена Ki-67 и других антигенов; 6) сродство ядрышковых антигенов, транскрипционных факторов, нуклеолина (С23) (В. М. Погорелов с соавт., 1987), нуклеофозмина (В23) (H. Chen et al., 2002) или фибриллярина (R. L. Ochs et al., 1985) к ионам серебра; 7) «комбинированные варианты», основанные на одновременном определении в препарате нескольких маркеров пролиферации. Одним из распространенных способов оценки пролиферативной активности клеток является анализ частоты митозов на 1000 клеток, то есть митотический индекс МИ (в ‰), (В. М. Котельников, 1991). Для более достоверной информации изучают статмокинетический индекс (СТИ), так как он не зависит от времени митоза и характеризуется только интервалами между клеточными делениями. Во второй половине XX века была широко распространена методика с использованием меченого тритием тимидина (3H-тимидин). Однако у этого методы было много недостатков (Д. Мецлер, 1980). Большое количество работ по оценке пролиферативной активности клеток посвящено методу Фельгена – окраска для выявления содержания ДНК. При анализе окрашенных препаратов можно проследить все фазы митотического цикла, в которых находятся исследуемые клетки. Применение окрашивания по Фельгену ограничено зависимостью связи реактива Шиффа от состояния хроматина, связи ДНК с белками, а также других факторов (Г. И. Козинец с соавт., 1986). 40 В исследовании митотического цикла широко применяются окрашивание препаратов люминесцентными (флуоресцентными) красителями, для окраски ДНК (бромистый этидий, йодистый пропидий, акридиновый оранжевый, Н33258, Н33342, ДАФИ и др.). Степень соответствия окраски количественным характеристикам выявляемого объекта этими агентами веществами высока. Это позволяет дифференцировать клетки с очень низким содержанием ДНК в ядре. При анализе популяций клеток строят гистограммы, в которых по оси абсцисс указывают содержание ДНК, а по оси ординат – количество с данным содержанием ДНК. Такие гистограммы распределения клеток по содержанию ДНК имеют пики, которые соответствуют клеткам в стадиях G1/ G0 (2 С) и G2 + M (4 С), а также в стадии S, находящиеся между этими двумя пиками (содержание ДНК от 2 до 4 С). Далее проводят компьютерный анализ этих гистограмм, что позволяет получить процентное содержание клеток на разных фазах деления (Д. А. Шмаров, Г. И. Козинец, 1999). При анализе ДНК-гистограмм, полученных при помощи цитофотометрии и конфокальной цитометрии, проводится в большей степени качественная оценка. Бромистый этидий окрашивает нуклеиновые кислоты независимо от состава оснований с красной флуоресценцией в ответ на возбуждение синим светом. Йодистый пропидий (PI), одинаково эффективно окрашивающий как ДНК, так и РНК, с красной флуоресценцией в ответ на возбуждение зеленым светом (А. Ф. Сайфитдинова, 2008). Акридиновый оранжевый в различной степени взаимодействуют с молекулами РНК и ДНК. При определенных условиях окраски структуры, богатые ДНК, люминесцируют зеленым свечением, а содержащие РНК – красным или оранжевым. В основе феномена двухцветной окраски лежит способность акридинового оранжевого образовывать с двухцепочными молекулами ДНК мономерные комплексы, в которых молекулы красителя не соединяются друг с другом (эти комплексы имеют зеленое свечение), а с 41 одноцепочными молекулами РНК – димерные комплексы, в которых молекулы красителя связываются между собой (люминесцируют красным цветом) (Е. И. Глухова, 2003). Ряд других авторов наблюдали различия в характере люминесценции клеток при исследовании различных органов и тканей. Так, ядра гепатоцитов начинали светиться желто-зеленым цветом, а цитоплазма – красным. Цитоплазма почечного эпителия становилась серовато-зеленой. Цитоплазма альвеоляров после обработки акридиновым оранжевым люминесцировала зеленовато-желтым цветом (В. П. Новоселов с соавт., 2012). В экспериментальных исследованиях С. Э. Глизер с соавт. (1998) и А. Л. Федоровцева с соавт. (2012) были показаны отличия свойств люминесценции изолированных клеток различных органов. Так, при окрашивании акридиновым оранжевым наблюдается оранжево-красное свечение крупных глыбок в цитоплазме гепатоцитов, а ядра люминесцируют желтоватозеленым цветом, и на их фоне выделяются оранжевого цвета ядрышки. В препаратах ткани легкого, ядра клеток мерцательного эпителия бронхов светятся зеленым светом, при этом в цитоплазме просматривается красного цвета зернистость. В канальцевых эпителиоцитах почек выделяются округлой формы ядра зеленого цвета, с большими оранжевыми ядрышками, их цитоплазма имеет серовато-зеленое свечение с хорошо различимыми немногочисленными оранжево-красными глыбками. Нейроны коры больших полушарий головного мозга характеризуются ярко-красным свечением, что характерно для сливающихся между собой мелких глыбок цитоплазмы, которые представляют собой субстанцию Ниссля. Их округлой формы ядра люминесцируют зеленым светом с ярко-красными крупными ядрышками. При люминесцентно-микроскопическом исследовании эпителиальных клеток слизистой оболочки носа, рта и влагалища авторами была отмечена иная картина. Их цитоплазма обладает неярким зеленым свечением, а также отсутствуют структуры, люминесцирующие красным или оранжевым светом, при этом ядра имеют желто-зеленый свет. 42 В настоящее время надежным методом оценки пролиферативной активности клеток является выявление белков специфичных для определенных фаз клеточного цикла, осуществляемый с помощью моноклональных антител. Наиболее часто применяют антитела к антигену PCNA и Ki-67 (И. И. Бабиченко, В. А. Ковязин, 2008). Белок PCNA – вспомогательный белок для ДНК-полимераз, участвующий в репликативном синтезе отстающей цепи ДНК, а также эсцизионном репаративном ресинтезе ДНК (G. Maga et al., 2001). В наибольшей концентрации PCNA обнаруживается в ядрах клеток, проходящих S-период интерфазы. Однако достаточно медленный катаболизм после завершения S-периода является недостатком PCNA. (Д. Э. Коржевский, 2000). Белок Ki-67 имеет две различные формы с молекулярной массой 320 kD и 359 kD. Кодирующий их ген локализуется в 10 хромосоме и состоит из 15 экзонов. Белок Ki-67 в основном связан с хромосомами и выявляется в области теломер, центромер, а также в ядрышках (И. И. Бабиченко, В. А. Ковязин, 2008). Белок Ki-67 (исследуется при оценке «ростовой фракции» клеточной популяции) (T. Scholzen, J. Gerdes, 2000) является белком, контролирующим митотический цикл. Использование индекса метки этим белком как маркер пролиферации клеток, конкурирует с PCNA: клетки в состоянии покоя (G0) негативны по уровню экспрессии Ki-67, а при поздней G1-фазе, а также в клетках S, G2 и в метафазе наблюдается экспрессия антигена в клетках. По сравнению с частотой митозов пролиферативный индекс этим белком значительно информативнее. В реформирующихся ядрышках дочерних клеток белок Ki-67 регистрируется позднее таких ядрышковых белков, как нуклеолин и фибрилларин (Е. Г. Артеменко, 2004), а также белка ядрышка SURF-6 (М. В. Малышева, с соавт., 2010). Концентрация Ki-67 в ядрах клеток увеличивается от G1-периода до митоза, при этом во время G1-периода экспрессия отмечается преимущественно в ядрышках, а в G2-период 43 окрашивается все ядро. Для выявления антигена Ki-67 необходимо проводить тепловую демаскировку, что является особенностью данного метода. Относительно функций белка Ki-67 в митозе высказано много предположений. Одни авторы утверждают, что локализация Ki-67 на поверхности хромосом является лишь распределением ядерных белков в дочерние клетки, а другие считают, что Ki-67 выполняет важную функцию в конденсации и деконденсации хромосом. Исследования, проведенные С. Schluter и соавт. (1993) и M. Starborg и соавт. (1996) показали, что Ki-67 жизненно необходим в митозе клетки, а при его нейтрализации деление клетки приостанавливается. Таким образом, иммуногистохимическая позитивная реакция на Ki-67 показывает, что клетка находится в промежутке от поздней G1 фазы до фазы М включительно (A. Hoos et al., 2002; Т. А. Шацева, М. С. Мухина, 2004; М. В. Галицкий с соавт., 2009). И. И. Яковцова с соавт. (2014) при изучении особенностей регенерации слизистой оболочки полости рта, отмечала высокую пролиферативную активность базальных и парабазальных отделов пласта многослойного плоского эпителия, проявляющуюся в «гиперэкспрессии» белка Ki-67. По данным К. Е. Новак с соавт. (2011) пролиферативная активность гепатоцитов имеет тенденцию к возрастанию по мере увеличения повреждения в виде нарастания цитолиза и возрастания гистологической активности гепатита, достигая максимума на высоте повреждения (по оценке экспрессии Ki-67). А. А. Евсеева с соавторами (2014) при изучении процессов регенерации в слизистой оболочке желудка отмечала увеличение индекса пролиферации Ki-67. В. Д. Труфанов с соавторами (2015) при изучении репарации тканей установил, что наиболее высокая пролиферация клеток, судя по экспрессии белка Ki-67, в раневой зоне регистрируется уже на третьи сутки после 44 операции, тогда как к четырнадцатым суткам индекс пролиферации резко снижается и идентичен таковому в зрелых тканях кожи. Несмотря на то, что белок Ki-67 экспрессирует в ядре, некоторые авторы отмечают его цитоплазматическую экспрессию при использовании клона MIB-1 (D. Faratian et al., 2009; D. M. Pleşan et al., 2010). Ядрышковые белки фибрилларин и нуклеофозмин, связывают ионы серебра, при этом обеспечивая субстрат цитохимической реакции транскрипционно активных ядрышкообразующих районов (ЯОР) с 50 % раствором AgNO3 (Ag-ЯОР-реакция) как в метафазе, так и в ядрах интерфазных клеток (C. Goodpasture, S. E. Bloom, 1975). По данным Y. H. Chou и B. Y. Yung (1995) количество аргирофильных белков в ядрышке, их размеры и локализация, а также функции в процессе интерфазы постоянно меняются. Данные подтверждают предположение о том, что, при оценке аргирофильности ядрышек, можно характеризовать распределение клеток по фазам митотического цикла, в которых находятся исследуемые клетки. Значительное содержание С23 и В23 отмечено в клетках, находящихся в S-G2 фазах, низкое – в клетках G1-фазы; в G0-фазе количество аргирофильных белков равно половине их содержания в G1-фазе (V. Sirri et al., 1997; В. М. Погорелов, Г. И. Козинец, 2004). Районы ядрышковых организаторов (AgЯО) – это участки хромосомной ДНК, которые кодируют рибосомную РНК и представлены множественными (до нескольких сотен) копиями генов рРНК, на каждом из которых синтезируются высокомолекулярные РНК-предшественники, которые в свою очередь превращаются в короткие молекулы РНК, входящие в состав субъединиц рибосом (С. Ю. Демин, В. Н. Стефанова, 2006). Анализ размеров ядрышковых организаторов позволяет охарактеризовать интенсивность синтеза рРНК и таким образом оценить белково-синтетическую функцию клетки (G. M. Cooper, 2000), что также может отражать пролиферативный потенциал клеток и состояние клеточной дифференцировки (Н. Т. Райхлин с соавт., 2006). 45 В рутинных гистологических и цитологических исследованиях применяется метод серебрения, который визуализирует материал белковой или липопротеидной природы ассоциированный с AgЯО и принимающий участие в их функционировании. Методика окрашивания коллоидным серебром для выявления аргирофильных белков, высоко специфична и получила общепринятое название AgЯОР (Джен Крокер, 1999; С. Ю. Демин, В. Н. Стефанова, 2006; В. И. Трухачев с соавт., 2014). Морфология ядрышек и количество AgЯО в клетках, в норме, генетически обусловлены и зависят от вида ткани, в которой проводят исследование, уровня дифференцировки и пролиферативной активности ее клеточных структур, а также фазы клеточного цикла (С. Е. Мамаева, 1992; С. Ю. Демин, В. Н. Стефанова, 2006; Н. Н. Мамаев, Н. Т. Райхлин с соавт., 2006; А. С. Юрко, Н. Н. Кавцевич, 2006; О. О. Жарская, О. В. Зацепина, 2007). Однако перечисленные параметры могут измениться при адаптивной или патологической трансформации клеток, при действии некоторых биологически активных веществ на клетки (А. С. Юрко, Н. Н. Кавцевич, 2006; Bauer NB et al., 2007). V. Sirri с соавт. (2000) утверждает, что аргирофильные белки, ассоциированные с ядрышкообразующими районами (AgЯО-белки), так же являются маркерами скорости клеточного цикла. До 75 % окрашивания AgЯО-белков составляют два главных белка – С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин), – играющих важнейшую роль в синтезе рибосомальной РНК. Эти белки выявляются в ядрах клеток во всех фазах клеточного цикла, при этом их количество увеличивается в S- и G2-фазы. Таким образом, на данный момент существует достаточное количество методов, позволяющих проводить изучение пролиферативной активности клеток. Исследование процессов репарации в различных тканях органов и систем требует детального изучения, в том числе и при частичной нефрэктомии, выполняемой при органосберегающих операциях в практической нефрологии на столь важном органе выделительной системы, которым является почка. |