https://zakon.today/biologiya_1092/opredelenie-kontsentratsii-veschestv-rastvore-93314.html
Определение концентрации веществ в растворе с помощью фотоэлектроколориметра
Свойство атомов и молекул поглощать свет определенных длин волн, характерных для данного вещества, широко используется в медицине и фармации для качественных и количественных исследований.
Измерение спектров поглощения позволяет судить о концентрации различных химических веществ. Для измерения концентрации веществ по спектрам поглощения их растворов используют прибор фотоэлектрокодо- риметр.
Цель работы:
Изучить законы поглощения света как теоретическую основу спектрофотометрии.
Понимать принципы применения фотоколориметрии в биологии, медицине и фармации.
Выработать умение измерять концентрации веществ с помощью фотоэлектроколориметра.
Литература:
Ремизов А.Н Медицинская и биологическая физика. Изд. Второе. — М.: “Высшая школа”, 1996.
Лекции.
Данное методическое пособие.
Подготовка к работе
Изучить по рекомендованным пособиям следующие вопросы:
Спектр поглощения вещества.
Вывод закона Бугера. Закон Бугера-Ламберта-Бера. Физический смысл всех входящих в него величин.
Коэффициент пропускания вещества, оптическая плотность образца. Связь между этими величинами. Размерности величин, входящих в формулы для коэффициента пропускания и оптической плотности.
Принципиальная схема фотоэлектроколориметра, назначение отдельных блоков.
Оптическая схема фотоэлектроколориметра, ход лучей в нем, способ изменения длины волны, место расположения исследуемого образца.
Примеры применения абсорбционной фотоэлектроколориметрии в медицине и фармации.
Ход работы и способ обработки результатов.
Теоретические сведения
I
Спектры поглощения веществ определяются разностью энергий между энергетическими уровнями молекул, составляющими вещество, а также вероятностями перехода между ними. Разность энергий определяет длину волны, на которой происходит поглощение света, вероятность перехода — коэффициент поглощения вещества.
Для веществ в растворе характерны широкие полосы поглощения, обусловленные электронными, колебательными и вращательными уровнями.
При прохождении через вещество свет поглощается. Рассмотрим слой толщины I, в котором в концентрации с находится вещество, поглощающее свет. В этом случае, согласно закону Бугера-Ламберта-Вера, интенсивность I света, прошедшего через слой, и интенсивность 10 света, падающего на него, связаны соотношением: '
I = 10е-ксг, (1)
где е = 2>72 — основание натуральных логарифмов, к — коэф-фициент пропорциональности, характерный для данного вещества и для данной длины волны. Для практических приложений закон (1) записывается,в виде:
= 10Ю_^сг, (2)
где величина — молярный коэффициент поглощения на длине волны X. Показатель степени в формуле (2), взятый с обратным знаком, называют оптической плотностью:
' В = ЕХС1 (3)
Как видно из формул (1) и (2), измерив отношение интенсивностей падающего и прошедшего света и зная величину е^, можно определить концентрацию с вещества.
На практике измеряют две физические величины: оптическую плотность В и коэффициент пропускания т. Коэффициент пропускания х —* это отношение интенсивности света, прошедшего через образец, к интенсивности падающего света:
х = I / 10. (4)
Значения X могут меняться от 0 (весь свет поглощается) до 1 (весь свет проходит), обычно их выражают в процентах.
Как видно из формулы (2), оптическая плотность В — это десятичный логарифм отношения падающего и прошедшего света. Она связана с коэффициентом пропускания:
О = 1&(10/1) = 1&(1/х). (5)
Как видно из формулы (5), когда коэффициент пропускания х падает от 100% до 0%, оптическая плотность В Соответственно растет от 0 до оо. Используются следующие единицы измерений х и Б — безразмерные величины; концентрация поглощающего вещества [с] = моль/л; Щ = см; [е^] = л/моль • см.
Спектром поглощения называют зависимость молярного коэффициента поглощения ОТ ДЛИНЫ волны X. Спектры поглощения можно измерять различными приборами.
Внимание!
Если вам нужна помощь в написании работы, то рекомендуем обратиться к профессионалам. Более 70 000 авторов готовы помочь вам прямо сейчас. Бесплатные корректировки и доработки.Узнать стоимость своей работы
В видимом диапазоне (380-760 нм) спектр поглощения определяет цвет вещества, поэтому прибор для измерения спектров называется колориметром (от латинского со1ог ¦— цвет). Современные колориметры позволяют производить измерения в более широком спектральном диапазоне от ультрафиолета до ближнего инфракрасного (315-980 нм).'
Примеры применения фотоэлектроколориметра в биологии, медицине и фармации:
Измерение концентрации окрашенных веществ, например, некоторых витаминов и лекарств, в растворе.
Определение рН среды по цвету добавленных в раствор рН-индикаторов.
Определение активности ферментов по интенсивности ок-рашивания раствора после добавления соответствующих химических реагентов, дающих окрашенные реакции с продуктами ферментативной реакции (например, оценка активности АТФ-аз по скорости образования неорганического фосфата).
Оценка скорости роста микроорганизмов по увеличению оптической плотности культуральной жидкости вследствие рассеяния света на микроорганизмах.
Принципиальная оптическая схема фотоэлектроколориметра.
Термин “фотоэлектроколориметр” означает, что это прибор для измерения цвета (“колориметр”), в котором оптическое излучение (“фото”) преобразуется в электрический сигнал (“эле- ктро”). Фотоэлектроколориметр состоит из следующих основных блоков (рис. 1): источника света (И), светофильтров (СФ), двух кювет — К1 — кюветы сравнения, заполненной растворителем, и К2 — кюветы для исследуемого раствора, полупроз-
^(Ф1 Ф2
Рис. 1 Принципиальная оптическая схема фотоэлектроколориметра
рачного зеркала (3), расщепляющего прошедший пучок света на два фотоэлемента (Ф1) и (Ф2).
Источник света создает излучение в широком диапазоне длин волн, светофильтр выделяет из него нужный участок спектра. Этот свет далее проходит либо через кювету (К2), в которую помещают исследуемый раствор, либо через кювету сравнения (К1), в которой находится растворитель. Пучок света, прошедший через кювету, расщепляется полупрозрачным зеркалом на два пучка, интенсивности которых регистрируются фотоприемниками Ф1 и Ф2.
Два фотоприемника используются для измерений в разных участках спектра.
Оптическая схема фотоэлектроколориметра типа КФК- 2МП, используемого в работе, естественно, существенно сложнее. Кроме того в этом приборе применяется микропроцессорная система для получения и обработки данных. Фотоэлектроколориметр (рис.2) конструктивно состоит из колориметрического блока (1) и вычислительного блока (2), в котором размещена микропроцессорная система (МПС), представляющую собой микроЭВМ.
В колориметрическом блоке (1) размещен источник света и
стеклянных светофильтров, вмонтированных в диск. Нужный светофильтр вводится в световой пучок поворотом диска (ручка (3)). Рабочее положение каждого светофильтра фиксируется. Длина волны, которую пропускает данный фильтр, отсчитывается на ручке (3) против белой риски, нанесенной на корпус прибора.
В кюветном отделении (4) в кюветодержателе, устанавливаемом на подвижный столик, располагают кюветы. Кюветодер- жатель устанавливают так, чтобы две маленькие пружины находились со стороны источника света. Ввод в световой пучок той или иной кюветы осуществляют перемещением ручки (5) влево или вправо до упора (положение “1” или “2”). В положении “1” в световой пучок вводится кювета с растворителем,
в положении “2” — с исследуемым раствором. Кюветное отделение закрывается крышкой (6).
При открытой крышке специальная шторка перекрывает световой пучок, чтобы не засвечивать фотоприемники. Дело в том, что фотоприемники даже в отсутствии освещения дают на выходе так называемый “темновой” сигнал, свойства которого меняются после изменения освещенности и искажают результаты измерений. Поэтому при открытом кюветном отделении световой пучок перекрывают, а после закрытия крышки необходимо подождать некоторое время, прежде чем производить измерения. "
Переключение фотоприемников для регистрации в фиолетовой или красной областях спектра осуществляют с помощью ручки (7).
В вычислительный блок 2 (рис. 2) входит микропроцессорная система (МПС).
На передней панели МПС расположены клавиатура, цифровое табло и два сигнальных светодиода.
Клавиатура состоит из
клавиш. Клавиша “пуск” предназначена для запуска мик-ропроцессорной системы. Клавиши “Ъ” и “с” предназначены для вызова на цифровое табло из памяти МПС значений соот-ветствующих коэффициентов для их контроля или ввода новых значений. Клавиша “сбр” (сброс) предназначена для стирания значения вызванного коэффициента (в случае необходимости задания нового значения).
Клавиши “0”, “1-9”, предназначены для набора на ци
фровом табло МПС нового значения коэффициента “Ъ” или “с”.
Клавиша “УТВ” (утверждение) предназначена для записи в память МПС нового значения коэффициента, набранного на цифровом табло.
Клавиши “К(1)”, “т(2)”, “0(5)”, “С(4)” предназначены для выполнения калибровки прибора, то есть установки 100% -ого пропускания, измерений коэффициента пропускания, оптической плотности исследуемого вещества, концентрации вещества в растворе.
Клавиша “А(3)” предназначена для измерения активности.
Клавиша “Ц/Р” предназначена для перевода МПС в один из двух режимов выполнения измерений: режим одиночных (разовых ”Р") измерений или режим циклических ("Ц") измерений. В режиме одиночных измерений измерения выполняются один раз при нажатии соответствующей клавиши: в режиме циклических измерений первое измерение производится при нажатии соответствующей клавиши и затем они повторяются циклически с периодом 5 с до тех пор пока МПС не будет переведена в режим выполнения одиночных измерений. Перевод МПС из режима циклических измерений в режим одиночных измерений и обратно происходит при нажатии клавиши “Ц/Р”. Сигнальный светодиод “Ц” и сигнальный светодиод “Р” служат для указания режима измерения. В режиме одиночных измерений горит светодиод “Р”, в циклическом — горит светодиод “Ц”.
Цифровое табло состоит из 6-ти индикаторов. Первый индикатор служит для отображения одного из символов “1”, “2”, “3”, “4”, “5”, “0”, появляющегося при нажатии одной из клавиш “К (1)”, “т(2)”, “А (3)”, “С (4)”, “Б (5)” соответственно и при проверочном измерении “нулевого отсчета” “ТТТ (0)”, то есть темнового отсчета при перекрытом световом потоке.
Индикаторы 2-6 служат для вывода результатов измерений и значений параметров “с” и “Ъ”.
Принцип действия колориметра основан на поочередном измерении светового потока Г0, прошедшего через растворитель или контрольный раствор, по отношению к которому производится измерение и потока Г, прошедшего через исследуемую среду.
Световые потоки Г0, Г фотоприемниками преобразуются в электрические сигналы и II, которые обрабатываются микроЭВМ колориметра. Результаты представляются на цифровом табло в виде коэффициента пропускания, оптической плотности, концентрации, активности.
С помощью микроЭВМ рассчитывается коэффициент пропускания исследуемого раствора по формуле:
где 11т — величина темнового сигнала при перекрытом световом потоке.
Оптическая плотность исследуемого раствора рассчитывается по формуле:
(7)
Измерение концентрации исследуемого раствора на колориметре возможно при соблюдении основного закона светопогло- щения, закона Бугера-Ламберта-Бера, то есть при линейной зависимости оптической плотности Б* исследуемого раствора от концентрации
Концентрация исследуемого раствора рассчитывается ЭВМ по формулам:
(8)
(9)
где с, Ь — коэффициенты, определяемые исследователем по градуировочной характеристике.
Выполнение работы
Внимание: 1. Микропроцессорная система (МПС), как и любая ЭВМ, работает строго по программе. При выполнении команд описания типа “открыть крышку” или “закрыть крышку” срабатывают специальные микропереключатели, которые включают нужные разделы программы, — поэтому обращайте внимание на точное выполнение подобных команд.
Микропроцессорная система (МПС) представляет собой универсальное устройство, с этим связано использование двойных обозначений для каждого параметра: буквенного и цифрового.
Задание 1. Провести метрологическую проверку колориметра.
Подсоединить колориметр к сети 220 В, 50/60 Гц, открыть крышку кюветного отделения и включить тумблер “сеть”, при этом должна загореться сигнальная лампа.
Нажать клавишу “пуск” — на цифровом табло появляется мигающая запятая и горит индикатор “Р”.
Если запятая не появилась — повторно нажать клавишу “пуск”.
Выдержать колориметр во включенном состоянии в течение
минут при открытой крышке кюветного отделения.
В процессе прогрева прибора измерить диапазон длин волн, видимых глазом человека. Вращая рукоятку выбора светофильтра, установить светофильтр 340 нм. Поместить в кювет- ное отделение около выхода светового пучка после светофильтра лист белой бумаги.
Переключая рукоятку выбора светофильтра в сторону увеличения длин волн, зафиксировать момет, когда появится цветное пятно на бумаге, записать соответствующее значение длины волны. Затем увеличивать далее длину волны, отмечая длины волн, соответствующие голубому, зеленому, оранжевому и красному излучению. При дальнейшем вращении зафиксировать момент, когда изображение пятна пропадет — это граница инфракрасного излучения. Составить таблицу длин волн, соответствующих границам восприятия глаза человека, а также указанным выше цветам.
Крышку кюветного отделения закрыть и открыть. По истечении 5 с нажать клавишу “Ш (0)”. На цифровом табло справа от мигающей запятой высвечивается значение нулевого отсчета п0, а слева — символ “0”. Значение п0 должно быть не менее 0,001 и не более 1,000.
В режиме одиночных измерений — горящий индикатор “Р” — произвести измерение коэффициентов пропускания контрольных светофильтров.
Для этого ручкой 3 установить светофильтр 540 нм; ручкой б установить соответствующий фотоприемник “315-540”. Закрыть крышку кюветного отделения. Выждать 1 минуту для выдерживания фотоприемника в освещенном состоянии (время выдерживания удлиняют до 5 минут после длительного, более 5 минут, нахождения колориметра при открытой крышке кюветного отделения). Нажать клавишу “К(1)’\ На цифровом табло слева от мигающей запятой загорается символ “1”. Установить контрольный светофильтр К-1 во входное окно кюветного отделения. Закрыть крышку. Выждать 1 минуту. Нажать клавишу ‘4(2)”. На цифровом табло слева от мигающей запятой появится символ “2”, справа — отсчет коэффициента пропускания. Записать данные в таблицу и сравнить с паспортными данными: Контрольный
светофильтр Коэффициент пропускания х, % паспорт опыт 1 опыт 2 опыт 3 К-1 15 ± 3 ••• . К-2 80 + 3
Повторить согласно п. 3 процесс измерения коэффициента пропускания светофильтра К-1 еще 2 раза. Результаты записать в таблицу.
Произвести согласно п. 3 трехкратное измерение коэффициента пропускания контрольного светофильтра К-2. Резуль-таты записать в таблицу.
Совпадение опытных и паспортных данных свидетельствует о соответствии фотоколориметра техническим требованиям.
Задание 2. В режиме одиночных измерений — горящий индикатор “Р” —¦ произвести определение длины волны максимума поглощения исследуемого вещества.
Для этого:
Заполнить первую кювету растворителем (до метки), вторую кювету (до метки) раствором с известной наименьшей концентрацией, открыть крышку кюветного отделения, поместить кюветы в кюветодержатель: растворитель в дальнее от оператора гнездо держателя (положение 1), раствор — в ближнее (положение 2). Держатель с кюветами устанавливают в кюветное отделение на столик так, чтобы две маленькие пружины находились с передней стороны кюветодержателя.
Внимание:
а) Кюветы следует удерживать руками только за верхние, выше метки, нерабочие поверхности.
Кюветы следует заполнять жидкостью до метки.
Рабочие поверхности кювет перед каждым опытбм следует тщательно протирать сухой чистой ткайью, или тканью, смоченной спирто-эфирной смесью.
б) После смены светофильтра, после длительного, более 5 минут, состояния колориметра с открытой крышкой кюветного отделения (при этом шторка перекрывает световой поток от источника к фотоприемнику) следует перед измерением выдержать фотоприемник 5 минут в освещенном состоянии, то есть при закрытой крышке.
Ручкой 3 установить светофильтр 315 нм. Ручкой 7 установить соответствующий фотоприемник “315-540”.
Крышку Кюветного отделения закрыть и открыть. По истечении; 5 с нажатием клавиши “Ш (0)” произвести проверку “нулевого отсчета”.
Ручку 5 перевести в положение “1”. Закрыть крышку кюветного отделения. Выждать1 минуту, нажав клавишу “К (1)”. На цифровом табло слева от мигающей запятой загорается символ “1”.
Ручку 5 перевести в положение “2”. Нажать клавишу “Б (5)*’. На цифровом табло слева от мигающей запятой появится символ “5”, справа отсчет оптической плотности. Последовательно устанавливая ручкой 3 светофильтры 340 нм, 400 нм, 440 нм, 490 нм, 540 нм и т. д. аналогично провести измерение оптической плотности. Результаты записать в таблицу: Светофильтр, А,нм 315 340 400 440 490 540 590 670 750 Р, отн. ед. (5)
Внимание. Перед каждым видом измерений (коэффициент пропускания, оптическая плотность, концентрация, активность) и при переключении фотоприемников следует провести проверку “нулевого отсчета” и при необходимости его регулировку.
Ручкой 3 установить светофильтр 590 нм. Ручкой 7 установить соответствующий фотоприемник “590-980”. Провести измерение оптической плотности, далее аналогично для свето
фильтров 670 нм, 750 нм. Результаты записать в вышеуказанную таблицу. Определить длину волны, соответствующую максимуму поглощения
т, _
Лтах погл.
Задание 3. В режиме одиночных измерений — горящий индикатор “Р” — произвести определение концентрации вещества в растворе по градуировочному графику.
Для этого:
При открытой крышке кюветного отделения заполнить первую кювету растворителем (до метки), вторую кювету (до метки) раствором с известной наименьшей концентрацией. Поместить кюветы в кюветодержатель: растворитель в дальнее от оператора гнездо держателя (положение 1), раствор в ближнее (положение 2). Держатель с кюветами устанавливают в кюветное отделение на столик так, чтобы две маленькие пружины находились с передней стороны кюветодержателя.
Ручкой 3 установить светофильтр, соответствующий длине волны максимума поглощения.
Ручкой 7 установить соответствующий фотоприемник.
Крышку кюветного отделения закрыть и открыть. По истечении 5 с нажатием клавиши “III (0)” произвести проверку “нулевого отсчета”.
Ручку 5 перевести в положение “1”. Закрыть крышку кюветного отделения. Выждать 1 минуту, наткав клавишу “К (1)”. На цифровом табло слева от мигающей запятой загорается символ “1”.
Ручку 5 перевести в положение “2”. Нажать клавишу “Б
”. На цифровом табло слева от мигающей запятой появится символ “5”, справа — отсчет оптической плотности. Результаты записать в таблицу: с, % Р, отн ед.
Аналогично провести измерения оптических плотностей всех растворов известной концентрации. Результаты записать в таблицу.
По значениям оптической плотности для раствора известных концентраций построить градуировочный график (рис. 3).
По градуировочному графику определить коэффициенты ‘с” и “Ъ”.
значение оптической плотности при с= 0, то есть при пересечении градуировочного графика с осью оптической плотности Б:
1 Рис. 3 Градуировочный график
где а — угол между градуировочной прямой и осью концентраций с^; (с^; — координаты какой-либо точки градуировоч
ного графика.
Ввести в память вычислительного блока коэффициенты “с” и “Ъ”. Для этого нажать клавиши “с” (“Ъ”), “сбр” — на цифровом табло слева от мигающей запятой высвечивается символ “с” (“Ъ”), набрать с помощью клавиатуры значение коэффициента “с” (“Ъ”). На цифровом табло справа от мигающей запятой высвечивается набранное значение коэффициента. Затем нажать клавишу УТВ — информация на цифровом табло исчезает.
Установить в ближнее гнездо кюветного отделения кювету с исследуемым раствором. Ручку 5 перевести в положение “1”. Закрыть крышку, нажать клавишу “К (1)”. Ручку 5 перевести в положение “2”. Нажать клавишу “С (4)”. На цифровом табло слева от мигающей запятой появляется символ “4”. Справа — значение концентрации схисследуемого раствора.
Записать результат в тетрадь:
сх
Абсолютная погрешность Дсхрассчитывается по градуировочному графику, исходя из линейной зависимости Б^ и с^.
По оси ординат откладывают отрезок дБ, равный единице последнего значащего порядка Б^. Перпендикулярами к оси ординат переносят отрезок на градуировочную прямую, а с нее перпендикулярами к оси абсцисс на ось абсцисс. Выделенный отрезок и определяет величину Дсх. Для удобства перенесений, учитывая линейную связь Б^ и с^, можно увеличить величину откладываемого по оси ординат отрезка дБ в десять раз, тогда для определения абсолютной погрешности Дсх, величину полученного отрезка на оси абсцисс следует уменьшить в десять раз. Окончательно представить результат в виде:
сх ±Дсх = ...
Задание 4. Решить задачи.
Задача 1. Коэффициенты пропускания для трех различных растворов составляют 10%, 1% и 0,1%. Определить оптические плотности этих растворов.
Задача 2. Коэффициенты пропускания для трех различны^ растворов одного вещества составляют 10%, 1% и 0,1%. Как соотносятся концентрации окрашенного вещества в этих растворах? '
Задача 3. Коэффициенты пропускания для двух растворов составляют 10% и 5%. Определить соотношение концентраций красителей в этих растворах, если длина второй кюветы вдвое больше, чем первой.
<< | >>
↑
Источник: В.Ф. Антонов, А.М. Черныш, В.И. Пасечник, С.А. Вознесенский, Е.К. Козлова. Практикум по биофизике: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. — М.: Гуманит. изд. центр ВЛАДОС, 2001. —352 с.. 2001 |
Скачать 82 Kb.