Энзимология. +Основы энзимологии. ОсновыэнзимологииКанд мед наук, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики
 Скачать 0.68 Mb.
|
|
Основы энзимологии Канд. мед. наук, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики Е. Г. Степанова ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России Свойства ферментов Ферменты – это биокатализаторы белковой природы. Как и все остальные катализаторы (кислоты, щелочи), ферменты имеют ряд общих с ними свойств: • не расходуются при реакциях; • ускоряют только возможные реакции; • не изменяют направления реакции; • не изменяют положения равновесия в обратимых реакциях. Но по сравнению с другими катализаторами ферменты имеют ряд отличий: • обладают гораздо большей активностью (ускоряют реакции в 108-1011 раз), работают в мягких условиях (температура 37 ºС, рН 7, давление 1 атм.). Ферменты также обладают специфичностью или избирательностью действия. Специфичность бывает абсолютной (при этом фермент катализирует превращение одного субстрата) и относительной (при этом фермент катализирует превращение нескольких субстратов, имеющих сходное строение и общий тип химической связи). Кроме того, активность ферментов в отличие от небиологических катализаторов регулируется. Строение ферментов • Биологические функции фермента связаны с наличием в его структуре активного центра. Вещество, взаимодействующее с ферментом, называется субстратом. • Тогда активный центр фермента – это место на его поверхности, где происходит связывание и каталитическое превращение субстрата. В активном центре выделяют участок связывания, который обеспечивает субстратную специфичность, и каталитический участок, который осуществляет химическое превращение субстрата. Однако эти участки не всегда имеют четкое пространственное разделение и иногда могут «перекрываться». • Активный центр формируется в третичной структуре и состоит из нескольких аминокислотных остатков, которые оказались сближенными при формировании третичной структуры, в то время как в первичной структуре эти аминокислотные остатки могут быть удалены друг от друга на значительное расстояние. У большинства ферментов в состав активного центра (помимо аминокислотных остатков) входит еще небелковый компонент – кофактор. Белковую часть молекулы фермента называют апоферментом, а комплекс апофермента и кофактора – холоферментом. В роли кофакторов могут выступать ионы металлов и органические соединения – чаще всего производные витаминов. Их называют коферментами. Апофермент Апофермент обеспечивает специфичность действия и отвечает за выбор типа химического превращения субстрата, а кофермент обычно участвует в переносе функциональных групп. Один и тот же кофермент, взаимодействуя с различными апоферментами, может участвовать в разных превращениях субстрата. Лактатдегидрогеназа Классификация ферментов 1- й класс – оксидоредуктазы. Катализируют различные окислительновосстановительные реакции. Сюда входят подклассы дегидрогеназ (отщепляющих атомы водорода), редуктаз (присоединяющих атомы водорода), оксигеназ (внедряющих кислород в субстрат) и др. 2- й класс – трансферазы. Катализируют перенос функциональных групп от одного субстрата на другой. Сюда относят аминотрансферазы (переносят 10 аминогруппу), метилтрансферазы (метильную группу), киназы (переносят остаток фосфорной кислоты от АТФ). 3- й класс – гидролазы. Катализируют реакции гидролиза (расщепления ковалентной связи с присоединением молекулы воды по месту разрыва). Сюда относят эстеразы, гликозидазы, пептидазы. 4- й класс – липазы. Отщепляют от субстратов негидролитическим путем определенную группу, например, декарбоксилазы, альдолазы. 5- й класс – изомеразы. Катализируют различные внутримолекулярные превращения (изомеразы, мутазы – в том случае, когда изомеризация состоит во внутримолекулярном переносе какой-либо группы). 6- й класс – лигазы (синтетазы).Катализируют реакции присоединения друг к другу двух молекул с образованием ковалентной связи, этот процесс сопряжен с затратой энергии АТФ (РНК-полимераза). Субстраты Субстраты – вещества, с которыми происходит химическое превращение под действием ферментов. Схема ферментативной реакции Е – фермент; S – субстрат; ES – комплекс «фермент-субстрат»; Р 1 , Р 2 – продукты реакци; К 1 , К 2 , К 3 – константы равновесия. Скорость реакции (V) – скорость, с которой уменьшается концентрация субстрата или увеличивается концентрация продукта реакции. Выражается скорость реакции в мкмоль/мин Скорость реакции Кинетическая кривая ферментативной реакции А – нисходящая; Б – восходящая. V=tg А t (мин) [S] t (мин) [P] Б Активность фермента численно равна скорости ферментативной реакции в оптимальных условиях на начальном линейном участке кинетической кривой при насыщающей концентрации субстрата. Активность фермента Международная единица активности (U , МЕ, Е, Ед) ‒ это количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата или получение 1 мкмоля продукта в минуту в стандартных оптимальных условиях. Единица активности в системе СИ (катал) соответствует количеству фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата в секунду 1 кат. = 6 × 10 7 МЕ 1 МЕ = 16, 67 × 10 -9 кат. Международная единица активности • концентрация субстрата; • концентрация фермента; • активатор и его концентрация; • ингибитор и его концентрация; • рН среды; • температура среды; • буфер и его концентрация. Факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции V max V max 2 К м [S] V Vmax [S] K M + [S] V = Для ферментов, подчиняющихся уравнению Михаэлиса-Ментена Для аллостерических ферментов V max [S] V Лаг-период Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата Скорость ферментативной реакции (V) прямо пропорциональна концентрации фермента [E] Скорость ферментативной реакции зависит от природы субстрата, и с различными субстратами для одного и того же фермента может отличаться в несколько раз. 6.0 5.3 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 рН 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 V рН оптимум 8,0-8,7 рН оптимум пепсина – 1,5 рН оптимум щел. фосфатазы – 9-10 Зависимость скорости гидролиза ацетилхолина ацетилхолинэстеразой от рН инкубационной среды Скорость катализируемой ферментом реакции, а значит и его активность, существенно зависит от условий инкубационной среды Повышение температуры всего на 1 °С приводит к увеличению скорости ферментативной реакции на 2,5- 20 %. Определение активности фермента следует проводить при фиксированной температуре 37 или 30 и 25 °С (допустимо колебание ± 0,1°С). Расчет активности ферментов по формуле Ламберта-Бера где Е – активность фермента, Е/л; А/мин – изменение оптической плотности реакционной смеси за 1 мин, ед. опт. плотности/мин; V – объѐм реакционной смеси, мл; – миллимолярный коэффициент экстинкции, л/ммоль´см; 1 – длина оптического пути, см; v – объѐм пробы (сыворотки), мл; 1000 – коэффициент пересчѐта активности в мкмоль/мин. л; F – фактор F v V мин А Е 1 1000 / • Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях(плазме крови, моче). • Ферменты плазмы крови можно разделить на 2 группы: функциональные и нефункциональные. • Первые активно секретируются в плазму определенными органами и выполняют там определенные функции (например, ферменты свертывающей системы), патология этих ферментов приводит к развитию заболеваний, для диагностики эта группа ферментов не используется. • Ко второй группе относят большое количество ферментов, высвобождающихся из клеток при некрозе (в связи с нарушением целостности клеток) и воспалении (в связи с нарушением проницаемости мембраны). Обычно эти ферменты выполняют свои функции внутри клетки, у здорового человека активность их в плазме низкая и достаточно постоянная. • Повышение активности в крови нефункциональных ферментов используют для диагностики заболеваний сердца, печени, поджелудочной железы и др. При этом более информативными для диагностики являются тканеспецифические ферменты. Для печени это ЛДГ5, для сердечной мышцы – креатинкиназа, ЛДГ1; для поджелудочной железы – амилаза и липаза. При этом уровень активности ферментов в крови коррелирует со степенью повреждения клеток. |