                          КИНЕТИКА ПРОЦЕССОВ ФЕРМЕНТАЦИИ ОСНОВНЫЕ МОДЕЛИ И КИНЕТИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ
ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАЦИИ
КАК ОПИСЫВАТЬ СКОРОСТИ ПРОТЕКАЮЩИХ ПРОЦЕССОВ? Можно найти уравнения, описывающие изменения во времени X(t), S(t), P(t) или Qx(t), Qs(t), Qp(t) или удельных скоростей μ(t), qs (t) и qp(t) - Эти уравнения, однако, ничего не дают для описания закономерностей процесса. Нужны «автономные» уравнения, описывающие зависимости между кинетическими характеристиками (см. выше) и текущими концентрациями S, X, P и другими параметрами процесса
КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАВИСИМОСТИ Мы уже говорили о том, что кинетические характеристики процесса ферментации –μ, qp ,qs – не являются постоянными, а изменяются в ходе процесса Эти изменения связаны с тем, что существуют зависимости этих параметров от текущих концентраций субстратов (S), биомассы (X) и продуктов метаболизма (P)
ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ РОСТА ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ СУБСТРАТА Мы уже рассматривали одно уравнение для скорости роста биомассы QX = dX/dt = μX В этом уравнении μ постоянна На самом деле величина μ зависит по меньшей мере от концентрации субстрата S, которая в ходе процесса непрерывно уменьшается Ниже рассмотрены варианты этой зависимости
МОДЕЛЬ КОБОЗЕВА По аналогии с химической кинетикой можно считать, что в реакции участвуют два «реагента» - биомасса Х и субстрат S dX/dt = KXS (K – константа скорости) Или μ = KS (прямая на графике) Модель предсказывает неограниченное увеличение скорости роста при увеличении концентрации субстрата
МОДЕЛЬ БЛЭКМАНА - Практически известно, что скорость роста микроорганизмов не может быть сколь угодно большой, и повышение концентрации субстрата выше определённого предела не приводит к увеличению скорости роста биомассы
Блэкман предположил, что при достижении некоторого критического значения концентрации субстрата скорость роста становится постоянной по величине
ЗАВИСИМОСТЬ ПО БЛЭКМАНУ
УРАВНЕНИЯ БЛЭКМАНА dX/dt = KSX при S < S* dX/dt = KS*X при S > S* или, что то же самое: μ = KS при S < S* μ = KS* при S > S* В этих уравнениях K – константа скорости Кобозева, S* - критическая концентрация субстрата
МОДЕЛЬ МОНО В природе не бывает резких изломов зависимостей, как в модели Блэкмана Обычно удельная скорость роста с повышением концентрации субстрата постепенно возрастает, а затем плавно переходит в постоянное значение Моно предложил описать эту зависимость специальным уравнением, основанным на ферментативной кинетике
МОДЕЛЬ МОНО
S
0 0
УРАВНЕНИЕ МОНО dX / dt = μmXS / (Ks + S), или μ = μmS / (Ks + S), В этих уравнениях S – концентрация субстрата μm – константа максимальной удельной скорости роста Ks - субстратная константа Моно
РЕПЕРНЫЕ ТОЧКИ Характерные точки для графика (S) легко найти простой подстановкой в уравнение Моно : = 0 при S = 0 = ½m при S = Ks = m при S
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ КОНСТАНТ Кинетические константы, входящие в уравнения модели, определяются из экспериментальных данных путём их математической обработки с помощью специальных методов Некоторые из этих методов будут рассмотрены ниже на примере уравнения Моно
МЕТОД ЛАЙНУИВЕРА И БЭРКА Уравнение Моно можно преобразовать так, чтобы его переменные ( μ и S ) выразить в обратных величинах ( 1/μ ) и ( 1/S ): ( 1/μ ) = ( 1/μm ) + ( 1/S )*(Ks / μm ) Это – уравнение прямой с «новыми» константами ( 1/μm ) и (Ks / μm ), которые можно найти графическим построением
ГРАФИЧЕСКОЕ ПОСТРОЕНИЕ В результате эксперимента имеется некоторое количество парных данных ( 1/μ ) и ( 1/S ) для каждой точки Если нанести эти данные на график в обратных координатах, получается прямая, пересекающая ось ординат в точке 1/μ = 1/μm, а ось абсцисс – в точке 1/S = - 1/KS
МЕТОД КОРНИШ-БОУДЕНА Можно преобразовать уравнение Моно к такому виду: - μ = μm – KS(μ/S), откуда графически получается прямая в координатах μ - (μ/S). Прямая пересекает ось ординат в точке μ = μm ,а ось абсцисс – в точке (μ/S) = (μm/KS)
Таким образом, по экспериментальным данным можно найти кинетические константы процесса
ГРАФИЧЕСКОЕ ПОСТРОЕНИЕ КОРНИШ-БОУДЕНА
МОДЕЛЬ МОЗЕРА Для некоторых процессов зависимость скорости роста от концентрации субстрата имеет сигмоидальный характер (см. рисунок) Мозером предложено описывать данную ситуацию уравнением: μ = μmSk /(KS + Sk )
СИГМОИДНАЯ ЗАВИСИМОСТЬ
МОДЕЛЬ ПЕРТА Эта модель описывает влияние не лимитирующего, а «стимулирующего» субстрата μ = μо + μ1S/(KS + S) Интересно, что при S = 0 уже есть рост, то есть μ = μо
СТИМУЛИРУЮЩИЙ СУБСТРАТ
МОДЕЛЬ АНДРЮСА В этой модели учитывается ингибирование повышенными концентрациями субстрата (см. рис.) Зависимость описывается уравнением μ = μmS / (Ks + S + S2/KI), где KI – константа ингибирования Оптимальная концентрация субстрата Sopt = (KS K i)0,5
ЗАВИСИМОСТЬ С ЭКСТРЕМУМОМ
ПРОДУКТ-ЗАВИСИМЫЕ МОДЕЛИ - Во всех рассмотренных до сих пор уравнениях в качестве единственного параметра, влияющего на удельную скорость роста микроорганизмов, использовалась концентрация субстрата (т.е. это «субстрат-зависимые» модели)
Возможны случаи, когда не субстрат, а накапливающийся в среде продукт метаболизма влияет на скорость роста, и тогда это «продукт-зависимые модели»
МОДЕЛЬ ХИНШЕЛЬВУДА
УРАВНЕНИЕ ХИНШЕЛЬВУДА: μ = μm– KP P – концентрация продукта метаболизма μm и K - кинетические константы μ = μm при P = 0 μ = 0 при P = μm / K
МОДЕЛЬ ИЕРУСАЛИМСКОГО
УРАВНЕНИЕ ИЕРУСАЛИМСКОГО μ = μm / (1 + P / KP ) или μ = μm KP /(P + KP) , где KP – константа ингибирования, а μm – максимальная удельная скорость роста При P = 0 μ = μm При P >> μ = 0 При P = KP μ = 0,5μm
ЛИНЕАРИЗАЦИЯ УРАВНЕНИЯ ИЕРУСАЛИМСКОГО (1/ μm ) + (1/ μmKP)P При (1/ μ) P = 0 P = - KP При P = 0 (1/ μ) = (1/ μm ) Графическое выражение линеаризованного уравнения представлено на следующем слайде
ГРАФИЧЕСКОЕ ВЫРАЖЕНИЕ ЛИНЕАРИЗОВАННОГО УРАВНЕНИЯ
МОДЕЛЬ БЕРГТЕРА Встречаются процессы, в которых зависимость μ (P) имеет сигмоидный характер Уравнение Бергтера: μ = μm / (1 + P k / KP ), где KP – константа ингибирования k - показатель степени, как новая константа
СТИМУЛИРУЮЩИЙ ПРОДУКТ МЕТАБОЛИЗМА Иногда встречаются процессы, в которых продукт метаболизма не ингибирует, а стимулирует рост Эту зависимость можно описать уравнением: μ = μ0 + μ1P / ( KP + P )
ЧАСТИЧНО ИНГИБИРУЮЩИЙ ПРОДУКТ МЕТАБОЛИЗМА Бывают ситуации, когда продукт метаболизма как бы «частично» ингибирует рост (не до нуля) Эта зависимость может быть описана уравнением: μ = μ0 + μ1 / (1 + P / KP )
БИОМАССА КАК ВЛИЯЮЩИЙ ФАКТОР На ОБЩУЮ скорость роста влияет концентрация биомассы (как сомножитель). Влияет ли концентрация биомассы на УДЕЛЬНУЮ скорость роста ? Да, но это влияние не просто «эффект тесноты», а опосредствованное влияние через концентрацию ингибирующего продукта. Поэтому и зависимости при этом похожи, но вместо P в уравнения подставляют X.
ОТМИРАНИЕ (ДИССИМИЛЯЦИЯ) БИОМАССЫ Все рассмотренные ранее зависимости относятся к собственно росту микроорганизмов - Однако в процессе роста, и особенно при его замедлении, одновременно с ростом происходит диссимиляция (отмирание) микроорганизмов. Реально измеряя биомассу, мы наблюдаем объединённый процесс роста-диссимиляции
 ВАРИАНТЫ УЧЁТА КИНЕТИКИ ОТМИРАНИЯ БИОМАССЫ
dX / dt = μX – X ( общее уравнение) 3) μ = KX Ферхюльст 4) μ = KP Рамкришна
МНОГОФАКТОРНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ До сих пор мы рассматривали кинетические уравнения, в которых на скорость роста влиял только один фактор – субстрат (только один), или продукт, или биомасса. Но в реальности часто на процесс влияет не один, а несколько факторов. Существуют многофакторные зависимости, и прежде всего многосубстратные.
ТИПЫ МНОГОФАКТОРНЫХ КИНЕТИЧЕСКИХ УРАВНЕНИЙ Мультипликативные уравнения Аддитивные уравнения Альтернативные уравнения Уравнения с неразделяющимися эффектами факторов Уравнения с однородными факторами (например, многосубстратные) Уравнения со смешанными факторами
МУЛЬТИПЛИКАТИВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ Функция является произведением однофакторных зависимостей = f1(S1)* f2(S2), где S1 и S2 – концентрации субстратов S1 и S2 Каждый фактор может иметь собственную форму зависимости, например, Моно – Моно, Моно – Перт, Моно –Андрюс, Андрюс – Андрюс и т.п.
АДДИТИВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ Многофакторная функция является суммой однофакторных Такие зависимости встречаются довольно редко, чаще для двух-трёх субстратов одного назначения, например, глюкоза и лактоза [(S1) и (S2)] - = 1S1/(K1 + S1 ) + 2S2/(K2 + S2 ), где K1 ,K2 , 1, 2 – кинетические константы
АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ КИНЕТИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ Многофакторная зависимость подчиняется принципу кинетического минимума  Для каждого субстрата существует своя зависимость i(Si). Реализуется та из них при заданных < Si > , для которой i(Si) минимален:
КИНЕТИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ С НЕРАЗДЕЛЯЮЩИМИСЯ ПЕРЕМЕННЫМИ Все три рассмотренных варианта многофакторных уравнений формируются из однофакторных зависимостей В сложных случаях многофакторную зависимость трудно разбить на однофакторные. Например, уравнение «конкурентного торможения» вторым субстратом S2: μ = μmS1 /(KS + S1 + S2 / K i )
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ Температура оказывает влияние на константы скорости кинетических уравнений роста микроорганизмов В принципе любая из констант в той или иной мере может быть подвержена влиянию температуры Однако в кинетических уравнениях для роста чаще всего полагают, что температура влияет на максимальную удельную скорость роста m
ЗАКОН АРРЕНИУСА По аналогии с химической кинетикой температурное влияние часто пытаются описывать законом Аррениуса: m = m0 e- E/RT m0 – предэкспоненциальный множитель E – энергия активации R – универсальная газовая постоянная T – абсолютная температура
НЕДОСТАТКИ УРАВНЕНИЯ АРРЕНИУСА Уравнение описывает только возрастание констант с повышением температуры Реальная зависимость имеет вид кривой с экстремумом При этом ниспадающая часть этой кривой круче, чем восходящая
«ДВОЙНОЙ АРРЕНИУС» В клетках микроорганизмов одновременно протекают процессы синтеза и распада клеточного материала - При этом зависимость «объединённой» константы m от температуры отображает разность двух сопряжённых процессов, каждый из которых подчиняется закону Аррениуса со «своими» константами:
m = 1 e- E1/RT - 2 e- E2/RT ЭМПИРИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ Часто для описания m (Т) используют уравнение m = 0 + 1T + 2 T2 Здесь 0 , 1 и 2 - коэффициенты, определяемые из экспериментальных данных Это уравнение, однако, описывает только СИММЕТРИЧНЫЕ зависимости - Более точно – уравнение более высоких порядков: m = 0+ 1T + 2T2 + 3T3 + 4T4
ВИД ЗАВИСИМОСТИ M(РН)
ЗАВИСИМОСТЬ M(РН) Величина рН = - lg [H+] [H+] = 10-pH [г-ион/литр] В водных растворах: [H+] * [OH-] = 10-14 [OH-] = 10-(14 – pH) [г-ион/литр] Влияние рН осуществляется «через» влияние либо водородных, либо гидроксильных ионов - Поэтому можно использовать уравнения (P), подставляя вместо продукта P либо [H+] для левой ветви кривой, либо [OH-] – для правой . Или использовать эмпирическое уравнение: m = 0+ 1pH + 2(pH)2 + 3(pH)3 + 4(pH)4
QP = qP X qP – удельная скорость биосинтеза продукта метаболизма - Функция от удельной скорости роста - Функция от концентраций субстратов и продуктов метаболизма - Функция от возраста культуры
ОБОСНОВАНИЕ РОСТ-ЗАВИСИМЫХ МОДЕЛЕЙ БИОСИНТЕЗА - Предполагается, что комплексный показатель – удельная скорость роста микроорганизмов , зависящий от многих параметров, «вбирает в себя» всё влияние этих параметров, и его можно использовать как параметр-аргумент в уравнениях, описывающих кинетику биосинтеза продукта
На этом предположении основаны уравнения, предложенные и использованные для различных процессов биосинтеза продуктов – связанных с ростом и «вторичных» метаболитов
РОСТ-ЗАВИСИМЫЕ МОДЕЛИ 1 – прямая связь с ростом: qP =K 2 – Людекинг и Пайри : qP =K + qP0 3 – qP =a /(b + ) 4 – qP =a /(b - ) 5 – [3] + qP0 6 – [4] + qP0 РОСТ-ЗАВИСИМЫЕ МОДЕЛИ Зависимости с экстремумом (7 ) qP = b -c 2 (8 ) qP = a +b + c2
НЕДОСТАТКИ РОСТЗАВИСИМЫХ МОДЕЛЕЙ БИОСИНТЕЗА ПРОДУКТОВ - «Рост-зависимые» модели неявно предполагают, что совсем неважно, каким образом формируется то или иное значение удельной скорости роста μ. Например, уменьшить μ можно, снизив концентрацию лимитирующего субстрата, или увеличив или понизив величину рН или температуры.
Такое предположение справедливо для процессов биосинтеза продуктов, связанных с ростом.
НЕДОСТАТКИ РОСТЗАВИСИМЫХ МОДЕЛЕЙ БИОСИНТЕЗА ПРОДУКТОВ Для процессов, НЕ связанных с ростом, важно, каким именно образом достигается снижение величины μ. - Лимитирование концентрациями углеродного, или азотного субстрата, или кислорода, или повышение рН, или снижение температуры, давая ОДНО И ТО ЖЕ значение μ, могут давать совершенно разные скорости биосинтеза продукта метаболизма qP
МОДЕЛИ КИНЕТИКИ БИОСИНТЕЗА С ВНЕШНИМИ ПАРАМЕТРАМИ-АРГУМЕНТАМИ - Для таких процессов необходимо использовать уравнения, описывающие зависимости qP непосредственно от внешних факторов – концентраций субстрата S, или продукта P, и/или температуры и/или pH
qP = qmS / (KS + S) (Моно) qP = qmS / (KS + S + S2 / Ki) (Андрюс) qP = qm[ S1 / (K1+S1)]*[S2 /(K2+S2+S22 / Ki)] (Моно-Андрюс) qP = qmS / (KS+S) (1+P/KP) (Моно-Иерусалимский) qP = qmS / (KX + S) (Контуа) КИНЕТИКА ДЕГРАДАЦИИ ПРОДУКТОВ МЕТАБОЛИЗМА  Часто продукты биосинтеза бывают лабильными. Они разрушаются в процессе самой ферментации.
В материальный баланс продукта в таких случаях следует включать скорость деградации (инактивации) продукта.
 ВАРИАНТЫ ОПИСАНИЯ КИНЕТИКИ ДЕГРАДАЦИИ ПРОДУКТА
 = 0 (стабильный продукт)  = K (не имеет смысла при P = 0)
= KP (кинетика 1-го порядка)   = KPn (кинетика n-го порядка)
= KPX (деградация с участием не только самого продукта, но и биомассы)
КИНЕТИКА ПОТРЕБЛЕНИЯ СУБСТРАТА Чтобы «замкнуть» материальный баланс, в котором почти везде участвует концентрация субстрата, необходимо дополнить его уравнением кинетики потребления субстрата. - Это уравнение в общем виде может быть представлено как аддитивное, в правой части которого фигурируют затраты на собственно рост микроорганизмов (Q1), на образование продукта метаболизма (Q2) и на поддержание жизнедеятельности (Q3):
- dS/dt = Q1+ Q2+ Q3 Q1=QX /YXS ( рост) и QP /YPS (образование продукта)
ПОДДЕРЖАНИЕ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ - 1 - В клетках микроорганизмов всё время идут процессы деградации (разрушения) некоторых веществ (белков, нуклеиновых кислот и др.) и одновременно процессы их синтеза (репарации). На этот процесс необходимо расходовать часть субстрата .
Кроме того, субстрат расходуется на синтез определённых, но неизмеряемых продуктов, образующихся в небольшом количестве ПОДДЕРЖАНИЕ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ - 2 В процессе ферментации можно создать режим, при котором концентрация биомассы и продукта не изменяются (то есть ΔX = ΔP = 0), а субстрат всё время добавляется, предотвращая отмирание биомассы - Это дополнительное расходование биомассы происходит не только в такой искусственной ситуации, но и в течение всего процесса. Просто эти расходы обычно «приписывают» к расходам на рост и образование продукта.
ПОДДЕРЖАНИЕ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ - 3 Правильнее выделить эту статью расхода в отдельный член уравнения – на поддержание жизнедеятельности микроорганизмов Q3 Очевидно, что эти затраты пропорциональны концентрации микроорганизмов X: Q3 = X*mS Здесь mS – коэффициент поддержания жизнедеятельности или УДЕЛЬНАЯ скорость расходования субстрата на поддержание жизнедеятельности микроорганизмов [г субстрата / г биомассы в час]
ИТОГОВОЕ УРАВНЕНИЕ КИНЕТИКИ ПОТРЕБЛЕНИЯ СУБСТРАТА Подставляя найденные зависимости, получаем уравнение QS = (-dS / dt) = (1 /YXS )QX + (1 /YPS ) QP + mSX В этом уравнении коэффициенты YXS и YPS соответствуют стехиометрическим и не «приписывают» себе затраты субстрата на другие компоненты процесса
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ MS Если пренебречь затратами на биосинтез продукта QP: QS= QX(1/YXS) + mSX или qS= (1/YXS) +mS Графическое выражение зависимости представлено на графике qS() В точке пересечения прямой с осью ординат ( = 0) имеем qS= mS А с осью абсцисс (qS= 0) = YXS*mS СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЭФФИЦИЕНТОВ УРАВНЕНИЯ - Находят по экспериментальным данным за определённый промежуток времени Δt четыре сопряжённых величины – приращения концентраций субстрата ΔS, биомассы ΔX, продукта ΔP и среднюю концентрацию биомассы за этот промежуток времени X
Для этой совокупности данных строят уравнение: (ΔS/Δt) = (1/YXS)(ΔX/Δt) + (1/YPS)(ΔP/Δt) +X*mS В этом уравнении 3 неизвестных коэффициента По другим экспериментальным данным строят дополнительные уравнения, и искомые коэффициенты находят методом наименьших квадратов
ВАРИАНТЫ УРАВНЕНИЙ ДЛЯ MS mS = 0 - (нет затрат на поддержание –характерно для конструктивных субстратов) mS = m - (величина постоянна) mS = KS - (затраты возрастают с повышением концентрации субстрата) mS = m /(1 +S / Ki ) – (затраты возрастают при малых S)
СИСТЕМНАЯ МОДЕЛЬ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАЦИИ Модель процесса включает описание динамики изменения в ходе процесса трёх основных параметров: концентрации биомассы X, субстрата S, и продукта метаболизма P.  Система уравнений модели в общем виде:
КОНКРЕТИЗАЦИЯ МОДЕЛИ ПРОЦЕССА  Системная модель включает 5 кинетических переменных , каждая из которых может быть описана одним из вариантов уравнений (элементарных) для этой переменной Выбор вида уравнений и определение коэффициентов в них проводится с помощью специальных экспериментов на реальном объекте |
Скачать 9.79 Mb.