отчет. Отчет 03. 04
 Скачать 0.77 Mb.
|
Отчет03.04 Подготовка сред: жидкого LB и LB-агара. Состав LB-агара: 10g бактериального Пептона/л 5g NaCl/л 5g дрожжевого экстракта/л 2 мл 1Моль NaOH Наш объем был на 200 мл LB-агара и 500 мл жидкого LB:
Эту смесь заливаем дистиллированной водой и ставим в автоклав на 17 мин 117 °С. Готовим солевые растворы: 1л 100мМ CaCl2 1м 100мМ MgCl2 100мл 85мМ CaCl2, 15% глицерола Ставим в автоклав. 04.04 В 4 пробирки добавляем по 10мл LB и садим E.coli. Затем высеиваем на чашки Петри. Выращиваем в шейкере в течение ночи при 37°С.  09.04 4 чашки Петри: на одной выросло много, на второй меньше, а на последних двух ничего не выросло.   С помощью бактериологической петли берем с чашки одну бактерию и добавляем в 10мл LB.Оставляем колбы на 37°С на 24 часа.   10.04 Вносим 10мл культуры в 1л LB и выращиваем в 37°С в шейкере. По истечению часа мерим OD, затем через каждые 15-20 мин , пока OD не будет равна 0.2. Результаты OD: 1банка+0,220 2банка+0,245 3банка+0,205 4банка+0,028 Контроль без культуры -0,032 После этого сразу ставим в воду со льдом на 20 мин. Туда же ставим наши солевые растворы. Делаем компетентные клетки: То, что получилось в банках разливаем по пластмассовым колбочкам 250 мг и ставим в центрифугу на 3000g 15 мин 4°С. Затем вытащив из центрифуги из всех пробирок выливаем, оставив осадок, и добавляем 20мл MgCl2,пипетируем. Ставим в центрифугу на 2000g на 15 мин 4°С. Снова вытаскиваем из центрифуги ,выливаем оставляя осадок и добавляем CaCl2,пипетируеми ставим в центрифугу на 2000g 10 мин 4°С. Проделываем тоже самое , что в первый и второй раз ,но уже добавляем 85мМ CaCl2,15% глицерола центрифугируем 1000g 10 мин 4  С.По истечению 10 мин, забираем большую часть жидкости, оставив немного, и добавляем 400мл 85мМ CaCl2, 15% глицерола. Измеряем OD, оно должно быть приблизительно 200-250. Разливаем компетентные клетки по эпиндорфам , которые стоят на подставках со льдом по 50µL 1,5мл. Замораживаем в жидком азоте. 12.04 Берем компетентные клетки , плазмиду (#21045mCherry) и SOC ставим их в лед 4°С на 20 мин. Добавляем в компетентные клетки плазмиду ставим в термостат на 42°С 2 мин. Затем снова ставим в лед и добавляем SOC 600мл,кладем в инкубатор 37°С на час 250 RPM. Сеем культуры на селективные чашки и инкубируем сутки при 37°С. На следующий день мы должны были петлей снять одну колонию и перенести в 10мл LB+Amp, для последующего выделения плазмидной ДНК, но мы этого не делали. 13.04 Занимаемся клетками рака печени: 1)В ламинарном шкафу из flack убираем среду и промываем 2 раза FBS 3.7мкл(10%DMEM),добавляем 200мкл трипсина и инкубируем 5 мин. 2)Добавляем 3,7 FBS во флакон со средой DMEM к нему- 407мкл пенстрепа и 407мкл пируват. 3)Затем во flack из пункта 1 добавляем намешанный DMEM 1мл пункта 2(смываем излишек трипсина и FBS). Из него добавляем 3мл в пробирку. Собираем камеру Горяева, вносим в нее 7мкл из пробирки и посчитываем клетки. После расчета(концентрация равна 140000 клеток) ресуспендируем пробирку много раз. Затем на чашку-малютку вносим 1мл (по расчетам с камеры Горяева) и еще добавляем 2 мл DMEM. Пробирку ставим в инкубатор на 37°С.   16.04 Подготавливаем клетки к трансфекции: Из чашки-малютки отбираем среду, промываем PBS; затем добавляем OPTIMUM 100мкл и FBS 1,9мл Готовим 2 пробирки со средами: Одна -с 100мкл OPTIMUM к нему добавляем 1мг ДНК, другая пробирка с 90мкл OPTIMUM+10мкл Lipofectamine. Затем эти пробирки смешиваем вместе, отправляем на вортекс и центрифугируем .ЖДЕМ 15 мин И после этого 200мкл раскапываем на клетки в чашке-малютке по всей поверхности.Ставим в инкубатор на 40 мин 37°С. Петлей берем колонии и сеем в чашку-малютку. 17.04.18 Смотрим под микроскопом с ультрафиолетом.   |